Transkriptom-Analyse von C. elegans RNA Sequenzierung Daten durch die Tuxedo Suite auf dem Galaxy-Projekt

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, C.elegans-Forschern ohne Bioinformatik-Expertise zu helfen, ein RNA-Sequenzierungsexperiment durchzuführen und die Daten mit der Open-Access-Plattform Galaxy zu analysieren. Diese Methode kann helfen, komplexe High-Through-Put-Sequenzierungsdaten zu analysieren, um Einblicke in die transkriptomischen Signaturen hinter den Phänotypen in C.elegans zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es Wissenschaftlern ohne vorherige bioinformatische Ausbildung ermöglicht, Rohsequenzierungsdaten zu analysieren und eine Liste differentiell exprimierter Gene zusammen mit den zugehörigen Gen-Ontologie-Begriffen zu erstellen.

Obwohl diese Methode speziell auf die Nuancen der C.elegans-Sequenzierungsdaten ausgerichtet ist, kann sie auch auf andere Organismen und biologische Kontexte angewendet werden, in denen Genome und wichtige Transkriptionsänderungen untersucht werden müssen. Dieses Video befasst sich mit der webbasierten Nutzung der Galaxy-Pipeline. Wenn möglich, führen Sie den Workflow lokal aus.

Laden Sie Galaxy herunter und installieren Sie es gemäß den Anweisungen auf der Wiki-Seite. Nachdem Sie das Tutorial "Hier starten" auf der Galaxy-Homepage verwendet haben, folgen Sie diesem Video. Für den Benutzer ist es entscheidend, sich mit der Benutzeroberfläche von Galaxy und den im Arbeitsablauf verwendeten Tools vertraut zu machen und sich daran zu orientieren.

Klicken Sie zunächst im Kopfbereich auf Daten analysieren, um auf die Startansicht der Analyse zuzugreifen. Der Fortschrittsbalken oben rechts überwacht, wie viel Speicherplatz verwendet wurde. Rufen Sie als Nächstes das Werkzeugmenü im linken Bereich auf und klicken Sie auf NGS-RNA-Analyse.

Dies bietet die Möglichkeit, alle Werkzeuge zu verwenden, die für die Analyse von RNA-Sequenzdaten erforderlich sind. Starten Sie nun einen neuen Analyseverlauf. Gehen Sie zum Verlaufsfenster auf der rechten Seite.

Klicken Sie auf das Zahnradsymbol und wählen Sie die Option Neu erstellen aus dem Popup-Menü. Geben Sie dann unter Verlauf einen Namen an, um die Analyse zu identifizieren. Um fortzufahren, gehen Sie zum Menü Extras und klicken Sie unter Daten abrufen auf die Funktion Datei hochladen, um unformatierte Schnellwarteschlangendateien hochzuladen.

Nachdem die Aufgabe in der Analyseoberfläche geöffnet wurde, klicken Sie auf Lokale Datei auswählen oder wählen Sie FTP-Datei aus, um zu den entsprechenden Sequenzdaten zu navigieren und diese auszuwählen. Standardmäßig erkennt Galaxy den Dateityp automatisch. Wählen Sie dann den Organismus aus dem Pulldown-Menü aus, der in diesem Fall C.elegans ist.

Klicken Sie anschließend auf Start, um den Datenupload zu starten. Nachdem die Datei hochgeladen wurde, wird die Aktion im Verlaufsfenster gespeichert, in dem die Daten ausgewählt und aufgerufen werden können. Konvertieren Sie nun Dateien nacheinander aus dem Fast-Queue-Format in das Fast-Queue-Sanger-Format, indem Sie auf das NGS-QC- und Manipulationsmenü zugreifen, Fast Queue Groomer auswählen und die Datei unter Zu pflegende Datei auswählen.

Wählen Sie den entsprechenden Typ für die schnelle Gleichheitsbewertung der Eingabe aus, und führen Sie das Werkzeug mit den Standardparametern aus. Die Datendatei kann nun analysiert werden. Achten Sie besonders auf die Dateiformate und Testparameter, die im gesamten Protokoll verwendet werden.

Dieses Wissen ist wertvoll für die Fehlerbehebung bei fehlgeschlagenen Tests und anderen Problemen. Vor dem Fortfahren können Qualitätskontrolltests durchgeführt werden. Einzelheiten zum Ausführen finden Sie im Textprotokoll.

Sobald eine Datei zur Analyse bereit ist, ordnen Sie die Sequenzierungsdaten zu, indem Sie zuerst den Abschnitt NGS-RNA-Analyse öffnen und dann auf das Top-Hat-Tool klicken. Geben Sie im Dropdown-Menü die Antwort auf die Frage ein, handelt es sich um einzelne oder gepaarte Enddaten? Wählen Sie als Nächstes die entsprechende Schnellwarteschlangendatei aus.

Wählen Sie im nächsten Dropdown-Menü die Option Integriertes Genom verwenden aus, und wählen Sie die Referenz-Genomdaten von C.elegans aus. Wählen Sie Standard für alle anderen Parameteroptionen aus, und klicken Sie dann auf Ausführen. Um die relative Häufigkeit von Transkripten im Datensatz zu schätzen, wählen Sie das Manschettenknöpfe-Tool im Abschnitt NGS-RNA-Analyse aus und wählen Sie aus dem ersten Dropdown-Menü die zugeordnete Datei im Bam-Format aus, die aus der Top-Hat-Analyse erhalten wurde.

Legen Sie im zweiten Dropdown-Menü die Referenzannotation auf die GTF-Datei fest, die die aktuellen Genomdaten enthält. Wenn die Option Verzerrungskorrektur durchführen angezeigt wird, wählen Sie Ja und führen Sie die Aufgabe mit den Standardeinstellungen aus. Öffnen Sie anschließend im Menü für die NGS-RNA-Analyse das Cuff-Merge-Tool, um die assemblierten Transkripte zusammenzuführen, die für alle RNA-Sequenzproben hergestellt wurden.

Das erste Feld im Tool lädt alle GTF-Dateien, die im vorherigen Schritt mit Manschettenknöpfen erstellt wurden. Wählen Sie nun die assemblierte Transkriptdatei für jeden der getesteten Stämme oder Bedingungen aus, einschließlich der biologischen Replikate desselben Stammzustands. Wählen Sie Ja für die Annotation für Benutzerreferenz aus, und wählen Sie die Referenzgenomdatendatei aus.

Wählen Sie als Nächstes Ja für die Option Sequenzdaten verwenden aus. Dadurch wird automatisch das passende Referenzgenom erkannt und ausgewählt. Lassen Sie alle anderen Parameter in der Standardeinstellung und klicken Sie auf Ausführen.

Es wird eine einzelne GTF-Datei erstellt. Um mehrere Stämme oder Bedingungen zu vergleichen, gehen Sie zurück zum Abschnitt NGS-RNA-Analyse und wählen Sie das Cuff-Div-Tool aus. Wählen Sie dann aus dem Menü "Transkripte" im Cuff-Div-Tool die zusammengeführte Ausgabedatei aus "Cuff Merge" aus.

Geben Sie dann Beschriftungen für die beiden Bedingungen ein. Gehen Sie für jede Bedingung zu Replikate und wählen Sie die einzelnen akzeptierten Trefferausgabedateien aus dem Top Hat aus, die den verschiedenen biologischen Replikaten dieser Bedingung entsprechen. Um mehrere Dateien gleichzeitig auszuwählen, halten Sie die Befehlstaste oder die Strg-Taste gedrückt.

Nachdem Sie die Dateien ausgewählt haben, verwenden Sie die Standardparametereinstellungen und klicken Sie auf Ausführen, um die Aufgabe auszuführen. Laden Sie differentiell exprimierte Daten herunter, indem Sie auf das Symbol "Speichern" im Feld für Gendifferenzialtests klicken, das im Verlaufsfenster generiert wird. Greifen Sie zunächst von der Website aus auf David zu.

Wählen Sie in der Kopfzeile der Webseite die Option Analyse starten aus. Kopieren Sie die Liste der von Galaxy erhaltenen Gene in Feld A und wählen Sie in diesem Beispiel den Genidentifikator als Wurmbasen-Gen-ID aus.Geben Sie dann unter Liste die dritte Frage ein, wählen Sie Genliste und klicken Sie auf das Symbol "Liste senden". Nun öffnet sich die Startseite des Analyseassistenten, von der aus David-Aufgaben ausgewählt werden können.

In diesem Videosegment werden einige dieser Optionen beschrieben. Wählen Sie zunächst funktionales Annotations-Clustering aus, um zur Zusammenfassungsseite zu gelangen. Belassen Sie die Annotationskategorien auf den Standardeinstellungen und klicken Sie auf Funktionales Annotations-Clustering.

Mit dieser Option werden Cluster ähnlicher Annotationsbegriffe generiert, die nach ihrer Anreicherungsbewertung geordnet sind. Kehren Sie nun zum Analyse-Assistenten zurück, und wählen Sie die Option für das funktionale Anmerkungsdiagramm aus, um deutlich überrepräsentierte biologische Begriffe zu identifizieren, die mit der Genliste verknüpft sind. Ein wertvolles David-Feature ist die Möglichkeit, eine funktionale Anmerkungstabelle zu erstellen.

Hier werden alle Annotationen aufgelistet, die mit den Genen verbunden sind, ohne dass statistische Berechnungen angezeigt werden. Dies kann für die Gen-für-Gen-Analyse und für die Suche nach bestimmten Genen von Interesse nützlich sein. Ein weiteres nützliches David-Tool, das überprüft werden sollte, ist die funktionelle Klassifizierung von Genen.

Mit dieser Option werden die Gene in eine Liste funktionell verwandter Gruppen unterteilt, die nach ihrem Anreicherungswert geordnet sind. Das beschriebene Protokoll wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, deren Expression nach Keimbahnverlust durch Tcer-1 moduliert wird. Das Transkriptom von langlebigen glp-1-Mutanten der Keimbahnliste wurde mit tcer-1 glp-1-Doppelmutanten verglichen, die unsere Keimbahnliste auflistet, aber keine Verlängerung der Lebensdauer aufweisen.

Eine Qualitätsprüfung der Sequenzen ergab keine Lesevorgänge von schlechter Qualität, einen GC-Gehalt von 48 bis 49 % und eine konstante Leselänge der Sequenz von 51 Basenpaaren. Die Genomabdeckung der Proben wurde auf das Sieben- bis Elffache geschätzt. Galaxy ermöglichte die Kombination der NGS-Daten aus den beiden Replikaten jedes Stammes und die Durchführung von Differentialanalysen zur Erstellung von Genlisten, die das genomweite Expressionsprofil hervorheben.

Insgesamt wurden 835 Gene zwischen den beiden Stämmen unter Verwendung eines P-Wert-Cutoffs von 0,05 differentiell exprimiert. Die funktionelle Annotationsanalyse der hochregulierten Gene ergab vier Annotationscluster mit hohen Anreicherungswerten. Die höchsten umfassen Cytochrom P450 und xenobiotische Reaktionsgene, gefolgt von Genen, die an Lipidmodifikationen beteiligt sind.

Das funktionale Annotations-Clustering der herunterregulierten Ziele identifizierte auch eine Vielzahl von Annotationsclustern. Dazu gehörten Cluster, die für die Funktion des Zytoskeletts, die positive Regulation von Wachstum, Fortpflanzung und Alterung angereichert waren. Die Galaxy-Pipeline hat Forschern in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen den Weg geebnet, um großflächige Veränderungen der Genexpression schnell und effizient zu analysieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ein RNA-Suchexperiment durchzuführen und die rohen High-Through-Put-Sequenzierungsdaten mithilfe der Galaxy-Pipeline zu analysieren. Sie sollten auch in der Lage sein, biologisch relevante Informationen aus den Galaxy-Daten mithilfe der David-Plattform zu extrahieren.