Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Die Durchführung von Strukturfunktionsanalysen an repetitiven und ungeordneten Transkriptionsfaktoren ist schwierig. Durch die Kopplung der Transkriptomik mit dem richtigen zellulären Kontext deckt dieser Ansatz wichtige Struktur-Funktions-Beziehungen besser auf. Die Verwendung der RNA-Sequenzierung als funktioneller Output ermöglicht die effektive Bewertung aller Gene, die von einem einzigen Protein in einem Experiment reguliert werden, wodurch der Nachweis einer Teilfunktion wahrscheinlicher wird.

Der Nachweis von Teilfunktionen ist besonders wichtig für onkogene Fusionstranskriptionsfaktoren, da wir nicht wissen, wie diese Proteine funktionieren und ihre Sequenzierung zu besseren Therapien bei fusionsgetriebenen Krebserkrankungen führen kann. Obwohl wir uns auf die ungeordnete EWS-Domäne in EWS/FLI konzentrieren werden, ist EWS an anderen Fusionen beteiligt, die Unordnungsdomänen mit schlecht definierten Funktionen enthalten. Für eine Transduktion des cDNA-Expressionskonstrukts tauen Sie das gefrorene Virus zunächst schnell mit cDNA-Konstrukten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf und mischen Sie vorsichtig 2,5 Mikroliter mit acht Milligramm pro Milliliter Polybrene in jedes Vile.

Entfernen Sie anschließend das Medium von einer 50 bis 70 % konfluenten 10-Zentimeter-Zellkulturplatte pro Fläschchen und umgehen Sie vorsichtig das gesamte Volumen von zwei Millilitern des Konstrukts an der Seite der Platte. Schütteln Sie die Platte, um das Virus gleichmäßig über die Zellen zu verteilen, und legen Sie die Platte zwei Stunden lang in einen 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator, wobei Sie die Platte alle 30 Minuten schaukeln, um ein Austrocknen von Bereichen der Platte zu verhindern. Am Ende der Inkubation fügen Sie fünf Milliliter Medium hinzu, das mit fötalem Rinderserum, Antibiotika, Natriumpyruvat und Polybren ergänzt wird.

Nach der Inkubation über Nacht im Zellkultur-Inkubator ersetzen Sie den Überstand durch das Selektionsmedium und bringen die Zellen für weitere sieben bis 10 Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück, um die Selektion und die Expression des cDNA-Konstrukts zu ermöglichen. Am Ende des Selektionszeitraums werden die Zellen zum Zählen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen gefüllt und fünf bis 10 mal 10 bis die fünften Zellen in ein neues Röhrchen für die RNA-Sequenzierung und zwei mal 10 die sechs Zellen in ein weiteres neues Röhrchen für die Proteinextraktion gegeben. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter kaltem PBS oder einer fünfminütigen Zentrifugation.

Anschließend frieren Sie sowohl die Pellets als auch den flüssigen Stickstoff im Schockfrost ein und lagern die Zellen bei minus 80 Grad Celsius. Um den Knockdown der interessierenden Proteine und die Expression der Konstrukte zu validieren, werden die Proteinlysatproben mit den entsprechenden Primär- und Sekundärantikörpern gemäß den Standardprotokollen der Western-Blot-Analyse gekleckst. Um die Qualität und Quantität der RNA zu beurteilen, verwenden Sie den Lysepuffer aus einem auf Kieselsäure-Spin-Säulen basierenden Extraktionskit, um die RNA-Sequenzierungszellproben zu lysieren, und tragen Sie die Lysate 30 bis 60 Sekunden lang bei mehr als 13.000 Umdrehungen pro Minute auf eine genomische DNA-Entfernungssäule auf.

Fahren Sie anschließend mit der Reinigung der Silica-Spin-Säule fort und waschen Sie die RNA auf der Säule gemäß den Anweisungen des Kits. Dann eluieren Sie die RNA in 30 Mikrolitern Elutionspuffer und analysieren Sie mindestens 2,5 Mikrogramm RNA auf einem Spektralphotometer im Verhältnis von 260 bis 280 Nanometern, um die RNA-Menge und die Probenqualität zu beurteilen. Für die fastq-Dateianalyse verwenden Sie Putty, um das Terminal für die High-Performance-Computing-Umgebung zu öffnen und ein Analyseverzeichnis mit dem Namen project zu erstellen.

Navigieren Sie zum Pfad zum Projektverzeichnis, und erstellen Sie ein Verzeichnis für die komprimierten Rohdateien fastq. gz dem Namen fastq und ein zweites Verzeichnis mit dem Namen trimmed. Wir verwenden ein geeignetes sicheres Dateiübertragungsprogramm, um die komprimierte Rohdatei schnell zu übertragen.

gz-Dateien aus dem lokalen Speicher in den Pfad zum Projekt-Fastq-Verzeichnis und überprüfen Sie, ob für jedes Beispiel eine R1- und eine R2-Datei vorhanden ist. Navigieren Sie zum Pfad zum Projekt fastq, und verwenden Sie den Befehl in trim gluore wie angegeben, um die Lesevorgänge mit geringer Qualität aus dem fastq zu kürzen. gz-Dateien.

Navigieren Sie zum Pfad zum Projektverzeichnis, und erstellen Sie ein neues Verzeichnis mit dem Namen STAR-Ausgabe. Navigieren Sie zum Pfad zum Projekt-Trim-Verzeichnis, und verwenden Sie den Befehl wie angegeben, um STAR auszuführen und das gekürzte fastq auszurichten. gz-Dateien.

Suchen Sie die erforderliche Ausgabe für die nächsten Schritte, die die Zählungen pro Transkript enthält, an der angegebenen Stelle, und verwenden Sie den Befehl zum Einlesen jeder Lesevorgänge pro Gen aus der Registerkarte. Verwenden Sie für die erste Spalte nur die Zeichen vor dem Punkt in der ENSEMBL-Gen-ID-Spalte, um die Weiterverarbeitung zu erleichtern. Verwenden Sie dann den Befehl, um die Anzahl aller Stichproben in den Datenrahmen mit dem Namen totcts zu kompilieren, und speichern Sie diese neue Tabelle mit unformatierten Zähldaten als tabulatorgetrennte Textdatei.

Um das differentielle Expressionsprofil für jedes Konstrukt mit DESeq2 zu definieren, geben Sie den experimentellen DESeq2-Versuchsplan ein, und verwenden Sie die Funktion DESeq-Dataset aus Matrix, um ein DESeq-Dataset zu erstellen, die Größenfaktoren zu schätzen und DESeq2 auszuführen. Um die Qualität der Analyse auszuwerten, verwenden Sie DESeq2, um die regularisierten Logarithmus-Normalisierungszahlen zu extrahieren. Wenn Sie die Ergebnisse für jedes Transkriptionsprofil aus den DESeq2-Ergebnissen extrahieren, führen Sie paarweise Vergleiche in Bezug auf die Knockdown-Bedingung oder den leeren Basislinienvektor durch.

Ergänzen Sie diese Ergebnisse weiter mit den HGNC-Gensymbolen und extrahieren Sie die Daten aus den DESeq2-Daten als eine einzige Datei mit der ENSEMBL-Gen-ID, dem HGNC-Symbol, der baseMean-Expression und den differentiellen Expressionsdaten für alle Konstrukte mit logarithmischer zweifacher Änderung und rohen und angepassten P-Werten. Bewerten Sie die erfolgreiche Batchnormalisierung und die Ähnlichkeit der interessierenden Stichprobe, und verwenden Sie den Code, um die regularisierten logarithmischen normalisierten Zählungen zu verwenden, um das Stichprobenclustering mit der Hauptkomponentenanalyse und einem Abstandsdiagramm von Stichprobe zu Stichprobe zu überprüfen. Verwenden Sie die regularisierten logarithmischen normalisierten Zählungen, um die 1.000 variabelsten Gene in eine Matrix zu extrahieren, und verwenden Sie eine Heatmap, um eine unüberwachte hierarchische Clusterung der Proben basierend auf diesen Genen durchzuführen.

Um die interessierenden Cluster aus dem Dendrogramm zu extrahieren, entscheiden Sie, auf welcher Ebene des Dendrogramms die Interessencluster angezeigt werden, und setzen Sie K auf die Anzahl der Cluster auf dieser Ebene. Um zu bestimmen, welche Cluster von Interesse sind, stellen Sie die Heatmap nach Clustern geordnet neu dar und exportieren Sie die Liste der Gene, die mit jedem Cluster in einer Tabelle verbunden sind, und verwenden Sie dann ein geeignetes bioinformatisches Tool, um die biologischen Rollen für die verschiedenen Cluster von Genen zu identifizieren, die identifiziert und zwischen den Klassen verglichen wurden. In dieser repräsentativen Analyse kann ein effektiver Knockdown und eine Rettung mit den positiven und negativen Konstrukten beobachtet werden.

Beachten Sie, dass die von DAF geretteten Zellen keine Kolonien bildeten, was auf eine gestörte onkogene Transformation hindeutet. Nach Abschluss der Replikantenvalidierung können für alle Proben phänotypische Assays und die anfängliche RNA-Sequenzierungsdatenverarbeitung Genzählungen für die Chargennormalisierung und -analyse erhalten werden. DESeq2 ohne Chargennormalisierung kann zu verwirrenden Chargenfehlern führen, wahrscheinlich aufgrund der biologischen Variabilität, die durch den Durchgang von Zellen in Kultur und Unterschiede in der Verarbeitung jeder Charge eingeführt wird.

Nach der Batch-Normalisierung kann DESeq2 verwendet werden, um Transkriptionsprofile für die interessierenden Konstrukte relativ zur Baseline zu generieren. Die Analyse der Hauptkomponenten für diese Daten deutet darauf hin, dass das Transkriptionsprofil von DAF intermediär ist, zwischen Wildtyp-EWS/FLI und Delta 22, was die partielle Funktion bestätigt. Darüber hinaus zeigt die hierarchische Clusterbildung der 1.000 variabelsten Gene in den Proben, dass DAF die EWS/FLI-Zielgene nicht unterdrückt und die Genaktivierungsaktivität nur teilweise beibehält.

Die Top-Genanalyse deutet darauf hin, dass sich die Klassen von Genen, die DAF aktiviert, funktionell von den EWS/FLI-aktivierten Zielen unterscheiden, bei denen DAF nicht funktionsfähig ist. Interessanterweise ist DAF am ehesten in der Lage, GGAA-Mikrosatelliten-aktivierte Gene zu retten, aber nicht in der Lage, aktivierte Gene in der Nähe einer hohen Affinitätsstelle zu retten. Die Kopplung des transkriptomischen Outputs mit den relevanten phänotypischen Assays vervollständigt die Strukturfunktionsanalyse.

Forscher können auch andere Techniken verwenden, um die mechanistischen Treiber verschiedener Transkriptionsfunktionen zu untersuchen.