Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Das übergeordnete Ziel dieser Bildanalysesoftware ist die parallele Analyse der Protrusionsdynamik und der relativen Proteinkonzentration über die gesamte filopodiale Länge. Diese Methode kann uns wirklich helfen, Schlüsselfragen der Zellbiologie zu verstehen, insbesondere die einzelnen Proteine, die an der Ausdehnung und Retraktion von Filopodien beteiligt sind. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass der bereitgestellte adaptive Formverfolgungsalgorithmus eine quantitative Bewertung der Protrusionsdynamik und der ortsaufgelösten Proteinlokalisierung ermöglicht.

Zu Beginn werden Neuronen, HeLa- oder COS-Zellen in einem ergänzten Medium kultiviert, wie im Textprotokoll beschrieben. Sobald eine Konfluenz von 40 % erreicht ist, transvektieren Sie die Zellen mit den Konstrukten Ihrer Wahl unter Verwendung eines Transvektionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bewahren Sie die transvektierten Zellen 15 bis 18 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 auf.

Füllen Sie die Zellkulturkammern nach der Inkubation zu 90 % mit 37 Grad Celsius vorgewärmtem Medium, das 20 Millimolare HEPES enthält, um Änderungen des pH-Werts und der Osmolarität aufgrund von Verdunstung während der Bildaufnahme zu reduzieren. Um den Deckel abzudichten, tragen Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die Innenseite des Deckels auf und drücken Sie es vorsichtig auf die Kulturkammer mit den transvektierten Zellen. Der vielleicht wichtigste Teil für die Bildanalyse ist die Bildqualität.

Eine Sache, auf die wir achten müssen, ist das Signal-Rausch-Verhältnis, das mehr als vier betragen muss, und wir können sicherstellen, dass durch die Anpassung der Belichtungszeit der Kamera und der Laserintensität und -kraft die Nachführkraft die Bildrate mehr als ein Hertz betragen muss. Erfassen Sie die Bilder mit einem Mikroskop mit einem 60x- oder 100x-Objektiv und ohne Pixelverbiegung. Verwenden Sie Erfassungsraten von nicht weniger als einem Hertz, um die Filopodialdynamik zu verfolgen.

Um unscharfe Artefakte zu minimieren, stellen Sie Filopodien nahe der Basilikummembran dar. Um eine reibungslose Nachführung zu gewährleisten, passen Sie die Belichtungszeit der Kamera und die Laserintensität so an, dass das Signal-Rausch-Verhältnis größer als vier ist. Sobald dies abgeschlossen ist, starten Sie die Bildaufnahme.

Laden Sie nach der Bildvorverarbeitung, wie im Textprotokoll beschrieben, die Bilder, indem Sie den gezippten Ordner herunterladen, der alle benötigten Dateien für die Bildanalyse enthält. Entpacken Sie die Dateien und kopieren Sie sie in den Arbeitsordner. Starten Sie nach der Installation die grafische Benutzeroberfläche, indem Sie die Datei mit dem Namen filopodiaAnalysisM3.fig. öffnen.

Laden Sie die gespeicherten Stack-TIFF-Dateien für einzelne Proteine in die grafische Benutzeroberfläche oder GUI. Mit den Schaltflächen 1B für Protein A, 1C für Protein B und optional 1D für Protein C.Erstellen Sie ein überlagertes Bild der Zelle aus den Proteinkanälen, indem Sie auf 1A klicken. Klicken Sie dann auf 2A, um den ersten Frame zuzuweisen, und klicken Sie auf 2B, um den letzten Frame für die Analyse zuzuweisen.

Optional können Sie den interessierenden Bereich oder ROI, der das interessierende Filopodium enthält, mit der 2H-Taste zuschneiden. Drehen Sie das Bild mit der 2I-Taste oder löschen Sie unerwünschte Bereiche mit dem freihändigen Zeichenwerkzeug 2J. Verschieben Sie den Schieberegler, 2C für jedes Bild, um die Qualität zu kontrollieren und zu überprüfen, ob das Filopodium während des gesamten Films deutlich sichtbar bleibt.

Um den Trace zu generieren, klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche 3A im ersten GUI-Fenster, um das zweite GUI-Fenster zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche vier im zweiten GUI-Fenster, um die Masse des überlagerten Zellkörpers zu erzeugen, der im ersten GUI-Fenster erzeugt wurde, nachdem Sie auf 1A geklickt haben. Es wird empfohlen, etwas Zeit in die Optimierung von Parametern wie der Anzahl der Segmente, der Scanbreite und des Scanradius für Ihren experimentellen Datensatz zu investieren.

Verschieben Sie den Schieberegler in Fenster Nummer zwei, um zu überprüfen, wo die filopodiale Spitze zuerst erscheint. Klicken Sie dann auf die fünfte Schaltfläche und der Cursor wird angezeigt. Wählen Sie mit dem Cursor die Basis aus, von der aus der Abstand der Filopodispitze gemessen wird.

Gefolgt von der Spitze der Filopodien in dem Rahmen, in dem sie zum ersten Mal erscheint. Wählen Sie als Nächstes die Schwellenlänge aus, ab der sich die Filopodien mit 6C biegen sollen. Geben Sie dann die Anzahl der Segmente an, die zur Annäherung an die Form der Filopodien in Feld 6A verwendet werden.

Geben Sie die Scanbreite an, die als horizontaler Scanner fungiert, um die Knoten in 6B zu platzieren. Geben Sie den Scanradius in Feld 6D an, und verwenden Sie einen Wert, der ca. 50 % größer ist als die beobachtete Verschiebung der Spitze zwischen den Frames. Geben Sie dann den Biegewinkel in Feld 6E an.

Aktivieren Sie die Verlaufsspur des Kontrollkästchens im zweiten GUI-Fenster, um das gesamte Tracking-Protokoll für zukünftige Referenzen zu speichern, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Verfolgen und Analysieren, um die Verfolgung zu starten. Wählen Sie für die räumlich-zeitliche Analyse das Kästchen aus, das durch 8B dargestellt wird, gefolgt von dem interessierenden Proteinkanal. Klicken Sie auf 8A, um die Proteinverfolgung entlang der filopodialen Länge unter Verwendung der zuvor generierten Spur zu starten.

Aktivieren Sie für die ratiometrische Proteinanalyse das Kontrollkästchen 9B oder 9C und klicken Sie auf die Schaltfläche 9A, um das räumlich-zeitliche ratiometrische Diagramm zu erhalten. Um die Analyse der filopodialen Spitze durchzuführen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen 8F und geben Sie die Spitzenlänge und die Schwellenwertlänge von der Basis aus mit 8G und 8H an. Klicken Sie auf den Druckknopf, um die Daten in einer Excel-Datei mit dem Namen dynamics.xlsx zu speichern.

Klicken Sie dann auf Proteinintensitäten analysieren, um die Spur der Proteinintensitäten der filopodialen Spitze zu generieren und für die ratiometrische Analyse zu speichern. Klicken Sie auf das gewünschte Verhältnis, das mit 9D oder 9E analysiert werden soll. Klicken Sie abschließend auf die Vergleichsschaltfläche 9A, um die ratiometrischen Daten zu generieren.

Die Analyse von COS-Zellen, die mit einem Marker für filamentöses Aktin in rot und einer zytosolischen Referenz in grün transvektiert wurden, zeigt aktinreiche filopodiale Protrusionen. Eine Zeitreihe zeigt, dass sich aktinreiche filopodiale Protrusionen schnell ausdehnen und wieder zurückziehen. Mit Hilfe der Bildanalysesoftware wurden die einzelnen Filopodien nachverfolgt.

Bildanalysesoftware verfolgt zuverlässig die filopodiale Extension, zusätzlich zu den Wachstums- und Retraktionsraten einer einzelnen Filopodien, zeigen Chemographen auch die Konzentration von Aktin, die auf die zytosolische Referenz normiert ist. Bei richtiger Anwendung ermöglicht diese Technik die quantitative Analyse der Protrusionsdynamik und der ortsaufgelösten Proteinkonzentration entlang der Filopodien. Wenn Sie das Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich die Erfassungsgeschwindigkeit zu merken und das Signal-Rausch-Verhältnis größer als vier zu halten, ohne einzelne Bilder zu sättigen.