Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und ihre Position, Bewegung und dynamische Assoziation zu supramolekularen Komplexen zu analysieren. Dies wird erreicht, indem Snap-markierte Rezeptoren in sehr geringen Mengen auf der Oberfläche lebender Zellen exprimiert und mit hellen organischen Fluorophoren markiert werden, um den Nachweis einzelner Moleküle zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt werden die Zellen durch Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, was eine schnelle Bildsequenz einzelner Rezeptorpartikel ermöglicht, die sich auf der Zelloberfläche bewegen.

Als nächstes werden automatisierte Detektions- und Tracking-Algorithmen auf die Bildsequenz angewendet, um die Position und Intensität jedes Rezeptorpartikels im Laufe der Zeit zu erhalten. Es werden Ergebnisse erhalten, die eine genaue Analyse der Größe von Rezeptorkomplexen in diesem Beispiel zeigen, beta zwei adrenerge Rezeptoren basierend auf einer gemischten Gaußschen Anpassung der Intensitätsverteilung der Partikel am Anfang der Bildsequenz. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie sich unsere Rezeptoren in den Domänen der Oberfläche lebender Zellen organisieren.

Wie interagieren sie miteinander, um Dimere und Oligomere zu bilden, und wie laufen dynamische Ereignisse an der Basis der Rezeptorsignalübertragung tatsächlich ab? Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen biochemischen und mikroskopischen Methoden besteht darin, dass sie das Verhalten einzelner Rezeptoren in der natürlichen Umgebung untersucht und es uns so ermöglicht, wichtige Aspekte zu untersuchen, die typischerweise bei Ensemble-Messungen verborgen sind. Die Deckgläser für die Proben müssen umfassend gereinigt werden, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Verwenden Sie während der Bildgebung eine saubere Pinzette, um einen Durchmesser von 24 Millimetern zu platzieren.

Die Glasabdeckung wird in einen Eindeckglashalter gesteckt, der die einzelnen Eindeckgläser trennt. Setzen Sie den Halter mit den Deckgläsern in ein Becherglas und fügen Sie Chloroform hinzu, bis die Deckgläser abgedeckt sind. Decken Sie das Becherglas mit Alufolie ab, um die Verdunstung zu verringern, und beschallen Sie es in einem Bad.

Eine Stunde lang bei Raumtemperatur beschallen. Nehmen Sie nach einer Stunde den Deckglashalter aus dem Becherglas und lassen Sie die Deckgläser trocknen. Setzen Sie dann den Halter mit den Deckgläsern in ein anderes Becherglas ein und fügen Sie fünf molare Natronlauge hinzu, bis die Deckgläser bedeckt sind.

Decken Sie das Becherglas wie zuvor mit Folie ab und beschallen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur, setzen Sie den Deckglashalter in ein neues Becherglas um und waschen Sie es dreimal mit destilliertem Wasser. Legen Sie zum Schluss die gereinigten Deckgläser in eine mit 100 % Ethanol gefüllte Glaszellkulturschale. Hier sind Deckgläser vor und nach der Reinigung zu sehen, die mittels Totalreflexionsfluoreszenz oder Rasenmikroskopie abgebildet wurden.

Cal-Kalibrierproben werden verwendet, um die Intensität einzelner fluoreszierender Moleküle während der Rasenmikroskopie abzuschätzen. Zur Vorbereitung der Proben lösen Sie den Fluoreszenzfarbstoff in dem entsprechenden Lösungsmittel auf. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung des Fluoreszenzfarbstoffs von einer bis 10 Uhr vor, die von einem Picamolar bis zu einem Anolar reicht.

Im Filter sterilisiertes Wasser. Waschen Sie die zuvor gereinigten Deckgläser, indem Sie sie in eine mit Filterwasser gefüllte Zellkulturschale geben. Legen Sie danach jedes Deckglas in eine Vertiefung einer Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen und warten Sie, bis es getrocknet ist, 20 Mikroliter jeder Fluoreszenzfarbstoffverdünnung auf einem separaten, gereinigten Deckglas aufsetzen.

Lassen Sie die Abdeckungsschlüpflinge unter einer sterilen Haube trocknen. Schützen Sie die Deckgläser vor der Transfektion vor Licht und Staub bis zum Gebrauch. Bereiten Sie eine Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen vor. Waschen Sie die gereinigten Deckgläser mit sterilem PBS und legen Sie einen Deckglas in jede Vertiefung der Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen.

Die CHO-Zellen, die für diese Studie transfiziert werden sollen, werden bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 in einem eins-zu-eins ECCOs modifizierten Adlermedium-Nährstoffgemisch F 12 kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin und Streptomycin nach Trypsin und Zählen der Zellen nach Standardmethoden: Aussaat bei einer Dichte von dreimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well. Lassen Sie die Zellen in der sechsten Vertiefungszellkulturplatte, die die Deckgläser enthält, 24 Stunden lang in einem Inkubator wachsen, um eine Co-Flüssigkeit von etwa 80 % zu erreichen, was der optimalen Zelldichte entspricht. Zur Transfektion.

Der schwierigste Aspekt dieses Protokolls besteht darin, ein extrem niedriges Expressionsniveau von Membranrezeptoren auf der Zelloberfläche zu erreichen, um den Erfolg zu gewährleisten. Der Transfektionszustand. So müssen z.B. die Menge an plus media NA und die Zeit nach der Transfektion am Tag der Transfektion optimiert werden.

Bereiten Sie die Transfektionsreagenzien vor, für die jeweils zwei Mikrogramm der gewünschten karierten DNA in 500 Mikrolitern optimalem Medium in einem anderen Röhrchen verdünnt werden. Für jede Vertiefung verdünnen Sie sechs Mikroliter Lipektomie 2000 in 500 Mikroliter Optum-Medium. Inkubieren Sie beide Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach fünf Minuten werden beide Lösungen in ein Röhrchen gegeben und zu einer Transfektionsmischung vermischt. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die CHO-Zellen vor.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewarntem PBS Nach dem zweiten Waschen ersetzen Sie PBS durch einen Milliliter phenolrotfreies D-M-E-M-F 12-Medium, das mit 10 % FBS ergänzt wurde, jedoch ohne Antibiotika. Geben Sie einen Milliliter der Transfektionsmischung tropfenweise in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte vorsichtig hin und her, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Inkubieren Sie zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2, bevor Sie sofort mit der Proteinmarkierung fortfahren.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verdünnen Sie einen Mikroliter des Fluor-vier-konjugierten Benzoguine-Derivats oder der Fluor-Vier-BG-Stammlösung in einem Milliliter D-M-E-M-F-12-Medium, das mit 10 % FBS ergänzt wird, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar zu erhalten. Nehmen Sie die transfizierten Zellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie zweimal mit vorwarmem PBS. Ersetzen Sie PBS durch einen Milliliter einer mikromolaren Fluorlösung mit vier BG und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2.

Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit D-M-E-M-F 12 Medium, das jeweils mit 10 % FBS ergänzt wird, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius. Verwendete Pinzette, um Deckgläser mit markierten Zellen in eine Bildgebungskammer zu übertragen. Zweimal mit 300 Mikrolitern Imaging-Puffer waschen.

Fügen Sie 300 Mikroliter frischen Bildgebungspuffer hinzu und fahren Sie sofort mit der Aufnahme der Bildgebungsbilder fort. Unter Verwendung eines Rasenmikroskops, das mit einem Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur, geeigneten Lasern, einem elektronenmultiplizierenden ladungsgekoppelten Gerät, einer Kamera und einem Inkubator sowie einer Temperaturregelung ausgestattet ist. Stellen Sie die gewünschten Mikroskopparameter ein, d. h. die Laserlinie, den Rasenwinkel, die Belichtungszeit, die Bildrate und die Anzahl der Bilder pro Film.

Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das 100-fache Objektiv des Mikroskops. Platzieren Sie die Bildgebungskammer mit den markierten Zellen auf dem Probenhalter des Mikroskops und bringen Sie die Zellen in den Fokus. Verwendung von Hellfeldbeleuchtung.

Wechseln Sie zur Rasenbeleuchtung. Halten Sie die Laserleistung so gering wie möglich, um die Suche nach der gewünschten Zelle zu ermöglichen, aber gleichzeitig das Photobleichen zu minimieren. Wählen Sie die gewünschte Zelle aus und fein.

Passen Sie den Fokus an. Erhöhen Sie die Laserleistung auf ein Niveau, das die Visualisierung einzelner Flora-Vierer ermöglicht. Erfassen Sie eine Bildsequenz und speichern Sie die Rohbildsequenz zur Kalibrierung als TIFF-Datei.

Montieren Sie jede Kalibrierprobe in der Bildgebungskammer und legen Sie sie auf das Mikroskop. Wählen Sie eine Probe mit gut getrennter Beugung. Begrenzte Flecken, die in einem einzigen Schritt bleichen.

Die Bildsequenzen des Rasens werden anschließend auf die gleiche Weise aufgenommen, wie sie für die markierten Zellen gezeigt wird. Um eine Bildsequenz vorzubereiten, verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware wie Image J, um die Bilder zuzuschneiden. Speichern Sie einzelne Frames als separate TIFF-Bilder in einem neuen Ordner, in dem die Frame-Nummer auf jedem Bild angegeben ist.

Die Partikeldetektion und -verfolgung erfolgt mit einer nicht-kommerziellen Software wie U Track in einer MATLAB-Umgebung. Geben Sie an der MATLAB-Eingabeaufforderung movie selector, GUI ein. Um die Filmauswahloberfläche zu öffnen, folgen Sie den Anweisungen, um eine neue Filmdatenbank zu erstellen, die aus den zuvor gespeicherten separaten Bildern besteht.

Geben Sie die Pixelgröße in Nanometern, das Zeitintervall in Sekunden, die numerische Apertur, die Bittiefe der Kamera und die Emissionswellenlänge des Fluorophors an, die für die Partikelerkennung und -verfolgung erforderlich sind. Speichern Sie die Filmdatenbank über die Filmauswahloberfläche. Führen Sie die Analyse aus, indem Sie einzelne Partikel als Objekttyp auswählen.

Führen Sie den Erkennungsalgorithmus und dann den Tracking-Algorithmus aus. Verwenden Sie die im URAC-Paket enthaltene Movie-Viewer-Routine, um die Spuren zu visualisieren und die Qualität der Erkennung und Verfolgung zu überprüfen. Öffnen Sie die Punkt-MAT-Datei, um die Position und Amplitude der verfolgten Partikel bei jedem Frame anzuzeigen.

Auch die Größe der Partikel kann aus den gewonnenen Daten berechnet werden. Hier ist das erste Bild einer typischen Rasenbildsequenz einer Zelle zu sehen, die mit Snap-markierten Beta-2-adrenergen Rezeptoren transfiziert und mit einem Fluor-4-konjugierten Benzylguinea-Derivat markiert wurde. Die Flecken stellen einzelne Rezeptoren oder Rezeptorkomplexe dar.

Ein Detektionsalgorithmus wird auf dieselbe Bildsequenz angewendet, und jedes detektierte Partikel wird durch einen blauen Kreis angezeigt, der auf einen Tracking-Algorithmus angewendet wird. Bei gleicher Bildsequenz ergeben sich die blau dargestellten Trajektorien der einzelnen Partikel. Grüne Segmente stellen Zusammenführungsereignisse dar, und rote Segmente stellen Aufteilungsereignisse dar.

Diese Methode erfasst auch dynamische Ereignisse. In diesem Beispiel durchlaufen zwei Partikel eine vorübergehende Wechselwirkung, bewegen sich für mehrere Frames zusammen und teilen sich wieder. Aus den Trajektorien der einzelnen Partikel werden ihre Diffusionskoeffizienten berechnet.

Dieses repräsentative Ergebnis zeigt, dass der beta zwei adrenerge Rezeptor eine hohe Beweglichkeit aufweist. Während der Gaba-B-Rezeptor eine eingeschränkte Beweglichkeit aufweist, kann die Größe der Rezeptorkomplexe genau abgeschätzt werden, indem die Verteilungen der Partikelintensitäten mit einem gemischten Gaußschen Modell angepasst werden. Diese Analyse kann auch die Koexistenz von Monomeren und Dimeren aufdecken.

Hier sind Beispiele für ein monomeres Rezeptorpartikel-Bleaching in einem Schritt und ein diametrales Rezeptorpartikel-Bleaching in zwei Schritten dargestellt. Diese Verfahren können erweitert und angepasst werden, um mit anderen Zelloberflächenproteinen, Nivellierungsmethoden und Zellmodellen zu arbeiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen sauberen Deckschlaf erzeugen, wie Sie niedrige Expressionswerte und eine effiziente Markierung mit hellen organischen Fluorstoffen erzielen sowie wie Sie Rasenbilder aufnehmen und analysieren, die alle wichtigen Schritte für einen erfolgreichen Einzelmolekül-T darstellen.