Name: Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Einzelmolekül-Tracking-Methode für Membranproteine in Lipid-Doppelschichten. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Proteindynamik und verbirgten Zuständen mit Fluoreszenzmikroskopie.

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<table><tbody><tr><td>1/4 Wellenplatte</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>Achte darauf, dass der Laser abgestimmt ist</td></tr><tr><td>100-faches Öl-Ziel</td><td>Olympus</td><td>12-563-659</td><td>1,45 N/A apochromatisch</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Avantipolare Lipide</td><td>850457</td><td>POPC-Phospholipide</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 Sportunterricht</td><td>Avantipolare Lipide</td><td>880210</td><td>Ammoniumsalz</td></tr><tr><td>300mm-Objektiv</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>633 nm He:Ne-Laser</td><td>Melles Griot</td><td>05-LHP-927</td><td>Kann auf andere Quellen und auf andere Wellenlängen umgestellt werden.</td></tr><tr><td>633-nm-Bandpassfilter</td><td>Chroma Tech</td><td>633/10X</td><td>Übereinstimmung mit dem verwendeten Laser</td></tr><tr><td>655-nm Langpassfilter</td><td>Chroma Tech</td><td>ET655lp</td><td>Änderung an die Wellenlängen des Farbstoffs/Lasers anzupassen</td></tr><tr><td>Andor Solis I</td><td>Andor&nbsp;</td><td>Andor Solis I</td><td>Software zur Bildaufnahme</td></tr><tr><td>ATTO 655&nbsp;</td><td>ATTO-TEC</td><td>655 n. Chr.</td><td>NHS-Ester-Modifikation, jeder Farbstoff mit der Modifikation, die für die Arbeit an einzelnen Molekülen geeignet ist, kann verwendet werden. ATTO wird empfohlen, aber Cy5/7 kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Bioperlen SM-2 Harz</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155-50MG</td><td>Aus Rinderleber, wässrige Soltion, &ge; 30.000 Einheiten/mg</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C547-1</td><td>HPLC- oder spektroskopische Qualität</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Deckzettel</td><td>ESCO Optik</td><td>R525000</td><td>25mm Quarz</td></tr><tr><td>Dichroischer Strahlteiler</td><td>Semrock</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>Änderung an die Wellenlängen des Farbstoffs/Lasers anzupassen</td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Andor&nbsp;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Falcon-Röhren 15 ml&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Cellestar-Zellkulturröhren</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133-50KU</td><td>aus Aspergillus niger, Typ VII, &ge; 100.000 Einheiten/g Feststoff (ohne zugesetzten Sauerstoff)</td></tr><tr><td>Heißluftpistole</td><td>Harbor Freight</td><td>56434</td><td>Bei der Erhitzung des Parafilms konnte in der Regel jede Heißluftpistole verwendet werden</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher-Bioreagenzien</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Niedrigfluoreszenz-Immersionsöl</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>Methonal</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A452-1</td><td>HPLC- oder spektroskopische Qualität</td></tr><tr><td>Mikro-Zentrifugenröhre</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro-Pipetters</td><td>Ependorf</td><td></td><td>Verschiedene; 1000 & Mikro; L, 100 & Mikro; L und 10 & Mikro; L werden vorgeschlagen</td></tr><tr><td>&Oslash; 1,5" Objektivröhren</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>Der externe Thread wird für die Sample-Vorbereitung abgeschnitten</td></tr><tr><td>Optische Tabelle</td><td>Newport</td><td>RPR Reliance</td><td>Die Größe der Tabelle hängt vom verfügbaren Speicherplatz ab</td></tr><tr><td>Optische Gewebe</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>Reinigung verschiedener Bauteile</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7669</td><td>Überprüfen Sie während des Prozesses, dass keine fluoreszierenden Gase ausweichen</td></tr><tr><td>Piezo-Aktuator</td><td>Newport</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatische Schwingungsisolatoren</td><td>Newport</td><td>I-2000-Serie</td><td>zur Stabilisierung der optischen Tabelle bei jeglichen Ungleichheiten&nbsp;</td></tr><tr><td>Kühlbad</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>Verschlussregler</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>Verknüpft mit der Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>Steritop-Filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Switchbox-Treiber und Controller&nbsp;</td><td>Newport</td><td>PZC200</td><td>Stage-Controller</td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>J.T. Baker</td><td>SF01-98</td><td>PES 25mm 0,2 & Mikro; M</td></tr><tr><td>TEC-Element</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>Wird verwendet, um die Peltirer-Wärmepumpe mit dem Probehalter und dem Objektivhalsband zu verbinden</td></tr><tr><td>Temperaturkontrolleur</td><td>Meerstetter Engineering</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturdetektor</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>Thermistor</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Tube-O-Dialysator</td><td>G Biosciences</td><td>786-611</td><td>4K MWCO</td></tr><tr><td>UV-Ozonreiniger</td><td>Novascan</td><td>PSDP_UV</td><td>Pro Series – Digital&nbsp;</td></tr><tr><td>Zoom Optics&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

verfolgung einzelner proteine in lipid-doppelschichten mittels fluoreszenzmikroskopie

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Direct observation is a fundamental method for scientific discovery and understanding. Time-lapse single-molecule fluorescence imaging allows the ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik von Plasmamembranproteinen und Lipiden ist ein heißes Thema in der Biologie. Hier wird dieses Problem durch eine räumlich-zeitliche Bildfluktuationsanalyse gelöst, die konzeptionell die gleichen physikalischen Größen der Einzelpartikelverfolgung liefert, jedoch kleine molekulare Markierungen und Standardmikroskopie-Setups verwendet.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

Wir präsentieren ein Verfahren zur Herstellung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten für die hochauflösende Mikroskopie. Mica ist durchsichtig und flach auf atomarer Skala, aber nur selten in der Bildgebung aufgrund der Handhabungsschwierigkeiten verwendet werden; unserer Zubereitung ergibt sogar Abscheidung der Glimmerschicht und reduziert die Doppelschicht in Herstellung verwendeten Material ab.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Erfahren Sie die Einzelmolekül-Tracking-Methode für Membranproteine in Lipid-Doppelschichten. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Proteindynamik und verbirgten Zuständen mit Fluoreszenzmikroskopie.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

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