Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Proteine bewegen sich in einem komplexen Zustandsraum, und vieles davon ist verborgen. Wir verwenden Einzelmolekül-Bildgebung, um diese Zustände zu enthüllen. Bei der Verfolgung einzelner Membranproteine in einer Lipiddoppelschicht sind die Hauptaufgaben die Probenvorbereitung, das Photobleaching und die Zeitauflösung.

Zu Beginn nehmen Sie die Lipidstängellösungen aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie Raumtemperatur erreichen. Nimm eine saubere 10-Milliliter-Flasche aus dem Ofen und lass sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Fügen Sie 900 Mikroliter spektroskopisches Chloroform und 100 Mikroliter spektroskopisches Methanol in die abgekühlte Rundbodenkolbe hinzu.

Gib dann die passenden Mengen jedes Lipids in die Flasche und wirbel, um gründlich zu mischen. Setzen Sie nun einen Vakuumdestillationsanschluss auf den runden Kolben und verbinden Sie ihn mit der Stickstoff-Trocknungsleitung. Dann schalte das Stickstoffgas ein und passe den Druck an, bis der Fluss auf dem Handrücken nur noch spürbar ist.

Pipettieren Sie einen Milliliter Puffer für jeweils fünf Mikromol Gesamtlipid in den runden Kolben am unteren Boden. Setzen Sie einen Glasstopper auf die Flasche und versiegeln Sie sie mit Paraffinfolie. Positionieren Sie die Flasche und eine Klemme auf einem Ringhalter und tauchen Sie deren Boden in ein 60-Grad-Sonikaterbad.

Überprüfen Sie, dass die Lösung undurchsichtig wird und keine Lipide an der Innenwand der Kolbenwand haften. Nach der einstündigen Inkubation schalten Sie den Sonikater ein und stellen Sie die Amplitude auf das höchste Niveau. Bewege die Flasche im Bad, um die Stelle mit der stärksten Bewegung zu finden, an der die Lösung sichtbar im Inneren des Kolbens stößt und sprüht.

Sonikieren Sie die Lösung 30 Minuten lang. Beobachte den Übergang von undurchsichtig zu transparent und leicht opalisierend. Entfernen Sie die Lipidlösung aus dem Kolben und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenrohr.

Zentrifugiere das Rohr bei 100.000 G für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird das Supernatant entnommen und in ein neues Zentrifugenrohr übertragen. Geben Sie die 25-Millimeter-Quarzabdeckung in einen Becher und fügen Sie gleiche Mengen Nanoreines Wasser, 30 % Wasserstoffperoxid und konzentrierte Salpetersäure hinzu.

Erhitze den Deckel 30 Minuten lang in der vorbereiteten Lösung, bis die Blasen beginnt. Kontrollieren Sie die Lösung alle 10 Minuten und bewegen Sie sie vorsichtig, um zu verhindern, dass die Abdeckungen zusammenkleben. Beobachten Sie, wie die Abdeckung beim Wirbeln auseinanderrutscht und sich trennt.

Sobald sie getrennt sind, reduzieren Sie allmählich die Wirbelgeschwindigkeit, um die Trennung aufrechtzuerhalten und der Blasenlösung zu ermöglichen, die Deckungsverschlüpfungen gleichmäßig zu beschichten. Dann spülen Sie den Deckel gründlich mit gereinigtem Wasser ab und schwenken Sie dabei vorsichtig, um alle chemischen Rückstände zu entfernen. Alternativ reinigen Sie die Quarzabdeckungen mit N-Hexan, gefolgt von Methanol, wobei Sie mit Linsengewebe für jedes Lösungsmittel abwischen.

Schieben Sie die Abdeckungen in einen UV-Ozonreiniger, wobei die zu behandelnde Oberfläche zur Lampe zeigt. Lass Sauerstoff fünf Minuten lang mit fünf Pfund pro Quadratzoll in die Kammer fließen. Dann schalte den Sauerstofffluss ab.

Jetzt schalten Sie die ultravioletten Lichter für 15 Minuten ein und lassen Sie die Abdeckungen mindestens 10 Minuten ruhen, damit sich das Ozon ablösen kann. Legen Sie einen frisch gereinigten Deckelzettel in einen 25-Millimeter-Probenhalter. Mit einem Viertelzoll-SM-Ein-Objektiv-Rohr schneiden Sie eine acht Millimeter große, doppelschichtige Par-Filmdichtung und positionieren sie in der Mitte des Probenhalters.

Tragen Sie einen 50-Mikroliter-Tröpfchen der kleinen Unilamellar-Vesikel in die Mitte der Acht-Millimeter-Dichtung auf. Nach dem Abschließen der Kammer eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung abzuspülen.

Fügen Sie 50 Mikroliter frischen Puffer zur Doppelschicht hinzu und wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt 10 Mal. Nach der letzten Spülung entfernen Sie den Puffer aus dem Probenhalter. Fügen Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot des gewünschten Proteins in Dentschmiermittel hinzu und stellen Sie sicher, dass die Konzentration bei oder unter der kritischen Micellenkonzentration liegt.

Inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde, um die Proteinaufnahme zu ermöglichen, spülen Sie die Probe mit einem Puffer ab, um nicht eingearbeitetes Protein und Reinigungsmittel zu entfernen. Stellen Sie die vertikale Pixelverschiebungsgeschwindigkeit auf etwa 600 Nanosekunden ein und erhöhen Sie die vertikale Taktspannung im Übertaktmodus. Dann konfiguriere die horizontale Pixel-Anzeige auf ihre maximale Geschwindigkeit.

Stell die Vorverstärkerverstärkung auf zwei ein. Stellen Sie den Verstärkerausgang für die Elektronenmultiplikation ein und stellen Sie die Verstärkung des Elektronenmultiplikators auf das höchste Niveau. Dann stellen Sie die Belichtungszeit auf 25 millisekunden ein.

Bestätigen Sie, dass die tatsächliche Bildrate die Belichtungszeit leicht übersteigt. Stellen Sie nun die Laserleistung ein, bis das Signal klar vom Hintergrundrauschen abhebt. Sammeln Sie genügend Bilddaten, um mindestens 1000 Spuren pro Probe zu erhalten.

Subtrahieren Sie den Hintergrund aus einem ausgewählten Interessengebiet und wenden Sie ihn auf die gespeicherte Kopie der Originaldaten an. Gehe zum Reiter Prozess und wähle Hintergrund subtrahieren. Im Plugins-Tab wählen Sie Tracking, gefolgt von trackmate, um das Trackmate-Dialogfenster für die Tracking-Analyse zu öffnen.

Der Grad der Markierung für AQP-vier Tetramere wurde mit UV-sichtbarer Spektrometrie auf 4,12 berechnet, und die Analyse der Poisson-Verteilung zeigte, dass 98 % der Tetramere mindestens ein fluoreszierendes Farbstoffmolekül trugen. Das Histogramm zeigt eine große Verteilung der Schrittweiten, die mit der Diffusion unterschiedlich großer orthogonaler Partikelanordnungen übereinstimmen, und der berechnete durchschnittliche Diffusionskoeffizient betrug 0,0143 Quadratmikrometer pro Sekunde. In diesem Video haben wir Schlüsselzustände identifiziert, die für die Regulation von Aquaporin vier und deren zugehörige thermodynamische Kräfte wichtig sind.

Dieses Protokoll eliminiert Ratspiel bei der Erstellung biomimetischer Membranen mit gereinigten transmembranären Proteinen, die für Zeitraffer-Einzelmolekül-Tracking geeignet sind. Proteinmaschinen, die an Wendepunkten betrieben werden. Zeitraffer-Einzelprotein-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung stochastischer Bahnen, Äste und Sackgassen.