Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen in lebenden Bakterienzellen direkt sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird durch die Visualisierung von Zellen erreicht, die ein photoaktiviertes fluoreszierendes Protein exprimieren, das mit einem DNA-Bindungsprotein von Interesse fusioniert ist. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Film von einzelnen Proteinen aufzunehmen, die während der Abbildung photoaktiviert werden.

Dann werden die Daten analysiert, um Proteinlokalisierungen zu bestimmen und Proteine in einzelnen Zellen zu verfolgen. DNA-Bindungsereignisse werden durch eine Änderung des Diffusionskoeffizienten einzelner Proteine identifiziert, wenn sie mit Chromosomen in Kontakt kommen. Letztendlich können die Ergebnisse ein quantitatives Maß für Protein-DNA-Interaktionen auf Einzelzellebene liefern, indem die Anzahl der gebundenen und diffundierenden Proteine pro Zelle gezählt wird.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, wie z.B. die in vivo Reparaturraten und die räumliche Verteilung von Reparaturstellen. Jetzt demonstrieren wir die Methode, indem wir die Reparaturaktivität der DNA-Polymerase messen, die im Leben e coli Zellen Stellen Sie zunächst Deckgläser ohne Hintergrund in einem Ofen bei 500 Grad Celsius für eine Stunde her. Verbrennen Sie einen Vorrat an Deckgläsern mit der Dicke Nummer 1,5 und lagern Sie sie bei Raumtemperatur in Alufolie.

Sie sind wochenlang gut. Als nächstes konzentrieren Sie einen Milliliter frühexponentielle Phase-E-Coli in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen des Stammes. AB 1157 poly a PA m Kirsche zentrifugieren die Zellen bei 2.300 G für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 Mikrolitern Restmedium und wirbeln Sie die Zellen in Lösung. Stellen Sie anschließend eine 1,5%ige Aros-Lösung mit geringer Fluoreszenz in destilliertem Wasser her. Mischen Sie 500 Mikroliter des geschmolzenen Aeros mit 500 Mikrolitern von zwei x minimalem Medium, indem Sie einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren für DNA-Schadensexperimente mit Methylmethansulfonat oder MMS, wobei Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.

Fügen Sie 8,3 Mikroliter MMS zu den 500 Mikrolitern minimalem Medium hinzu, bevor Sie es mit dem Aros mischen, bevor die Mischung abkühlt. Verteilen Sie es auf einem verbrannten Deckglas. Verteilen Sie es gleichmäßig und zentriert, ohne Blasen zu bilden.

Glätten Sie das Pad mit einem zweiten eingebrannten Deckglas. Entfernen Sie nach dem Abkühlen die obere Abdeckung vom Pad und fügen Sie einen Mikroliter konzentrierte Zellsuspension hinzu. Immobilisieren Sie die Zellen, indem Sie das Pad mit einem neuen eingebrannten Deckglas abdecken und sehr vorsichtig nach unten drücken.

Die Zellen sollten innerhalb von 45 Minuten abgebildet werden, bevor sie austrocknen. Um diese Zeit zu verlängern, kann das Pad in einer Silikondichtung für DNA-Damage-Experimente versiegelt werden. Vor der Bildgebung inkubieren die Zellen diese 20 Minuten lang auf dem Pad.

In einem befeuchteten Behälter bei Raumtemperatur verfügt das Mikroskop über einen 405-Nanometer-Photoaktivierungslaser und einen 561-Nanometer-Anregungslaser. Die Einzelmolekülempfindlichkeit wird erreicht, indem nur Fluor-Vierer innerhalb eines dünnen Abschnitts über der Deckglasoberfläche mit stark geneigter Beleuchtung angeregt werden, die Fluoreszenzemission wird auf einer elektronenmultiplizierenden CCD-Kamera aufgezeichnet. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und bringen Sie die Zellen in den Fokus.

Definieren Sie unter Durchlichtbeleuchtung ein beschnittenes Sichtfeld, um die Datengröße zu verringern und die Auslesegeschwindigkeit der Kamera zu erhöhen. Decken Sie die Probe vor Umgebungslicht ab und schalten Sie die elektronenmultiplizierende CCD-Kameraverstärkung für die Einzelfluoro-Vier-Detektion ein. Stellen Sie die Bildrate auf 15,26 Millisekunden pro Bild ein.

Dazu gehört auch die Kameraanzeige von 0,26 Millisekunden Zeit Die Belichtungszeiten müssen ausreichend kurz sein, um scharfe Fluoreszenzflecken mit wenig Bewegung zu beobachten. Andererseits müssen die Spuren in ausreichend langen Zeitabständen abgetastet werden, um die gebundenen von den diffundierenden Molekülen eindeutig unterscheiden zu können. Zeigen Sie nun die Kameradaten an, um das dunkle Hintergrundsignal zu überprüfen.

Schalten Sie den 561-Nanometer-Laser ein und überprüfen Sie das Anregungshintergrundsignal. Schalten Sie den 405-Nanometer-Laser für die Photoaktivierung der Kirsch-Fusionsproteine Paul one PA M ein und erhöhen Sie die Intensität, bis fluoreszierende Flecken einzelner Moleküle erscheinen. Stellen Sie nun den Winkel des Anregungsstrahls so ein, dass nur ein dünner Ausschnitt der Probe beleuchtet wird.

Schließen Sie die Deckglasfläche. Diese Methode beruht auf der Detektion und präzisen Lokalisierung einzelner fluoreszierender Proteine, so dass die optimale Ausrichtung und Empfindlichkeit des Mikroskops entscheidend für die Datenqualität sein wird. Fokussieren Sie dazu den Laserstrahl in die hintere Brennebene eines Objektivs mit 1,4 x numerischer Apertur.

Durch die Verschiebung der Fokussierlinse senkrecht zum Strahl wird der Fokus von der Mitte des Objektivs wegbewegt, wodurch der Strahl das Objektiv in einem bestimmten Winkel verlässt. Richten Sie den Strahl so aus, dass die Fluoreszenzintensität maximiert und der Hintergrund minimiert wird. Finden Sie ein neues Sichtfeld von Zellen im Durchlichtmikroskopie-Modus und fokussieren Sie das Bild.

Machen Sie einen Kamera-Schnappschuss, um die Zellenumrisse aufzuzeichnen. Schalten Sie den 561-Nanometer-Laser ein und bleichen Sie die zelluläre Autofluoreszenz und die Hintergrundflecken auf der Abdeckung. Schlüpfen Sie für ein paar Sekunden.

Bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen, beginnen Sie mit der Aufnahme eines Palmfilms unter kontinuierlicher Anregung von 561 Nanometern. Schalten Sie den 405-Nanometer-Laser ein und erhöhen Sie die Intensität im Laufe des Films allmählich auf bis zu einem Watt pro Quadratzentimeter. Vermeiden Sie höhere Intensitäten von 405 Nanometern, die eine zelluläre Autofluoreszenz verursachen.

Achten Sie auf die Dichte der fluoreszierenden Moleküle. Es ist wichtig, die Aktivierungsraten niedrig zu halten, damit die Fluoreszenzflecken in jedem Bild klar isoliert sind. Nehmen Sie etwa 10.000 Bilder pro Film auf, was bei einem beschnittenen Sichtfeld in der Regel bis zu drei Minuten und bis zu einem Gigabyte Festplattenspeicher in Anspruch nimmt.

Es ist zu beachten, dass die Fluorophore der Pammkirsche nach der Abbildung eines Gesichtsfeldes irreversibel gebleicht werden und nicht mehr beobachtet werden können. Auch im folgenden Verfahren wird benutzerdefinierte Software in Matlab verwendet. Einzelne Fluorophore erscheinen als Punktspreizfunktionen oder psfs.

Im Film werden psfs erstmals in einem bandpassgefilterten Bild unter Verwendung eines Gaußschen Kerns mit sieben Pixeldurchmessern identifiziert, dessen Kandidatenpositionen P SFS mit Spitzenpixelintensitäten 4,5-mal über der Standardabweichung des Hintergrunds entsprechen. Das lokal hellste Pixel pro PSF-Kandidat dient als erste Schätzung für die Anpassung einer elliptischen Gaußschen Funktion. Die Parameter für die freie Anpassung sind X-Position y, Position X-Breite, Y-Breitendrehung, Winkel, Amplitude und Hintergrundversatz.

Die elliptische Gaußsche Maske berücksichtigt die Molekülbewegung während der Belichtungszeit, wodurch das PSF-Diagramm verwischt und verformt wird. Die resultierenden XY-Lokalisationen aus allen Bildern des Handflächenfilms auf das Durchlichtmikroskopiebild der gleichen Sichtfeldlokalisierungen von Paul One PAM Cherry sollten im zentralen Bereich der E-Coli-Zellen erscheinen. Das automatisierte Tracking misst die Bewegung der Proteine, aber die erfolgreiche Wahl eines Tracking-Fensters ist entscheidend.

Führen Sie zunächst den Tracking-Algorithmus für eine Reihe von Parametern des Tracking-Fensters aus. Plotten Sie die Anzahl der gemessenen Spuren pro Zelle im Vergleich zum Tracking-Fenster, um das kleinstmögliche Tracking-Fenster zu identifizieren, in dem die Spuren nicht geteilt werden. Zeigen Sie die resultierenden Spuren auf dem Durchlichtmikroskopiebild desselben Sichtfelds an. Um die räumliche Verteilung der Molekülbewegung innerhalb von Zellen zu visualisieren, sollten P one Tracks eine Diffusion anzeigen, die auf einzelne Zellen beschränkt ist, wenn ein Bruchteil der Spuren zwischen Zellen zu kreuzen scheint, was darauf hindeutet, dass separate Moleküle fälschlicherweise miteinander verknüpft wurden, weil das Tracking-Fenster zu groß gewählt wurde oder die Photoaktivierungsrate zu hoch war.

Plottet die kumulative Verteilung der Schrittlängen zwischen aufeinanderfolgenden Lokalisierungen. Die Kurve steigt an und sättigt sich gleichmäßig für ausreichend große Tracking-Fenster, zeigt aber eine Cutoff-Kante, wenn das Fenster zu klein gewählt wurde. Sobald ein geeignetes Tracking-Fenster ausgewählt wurde, können die Diffusionseigenschaften von Paul one analysiert werden.

Berechnen Sie die mittlere quadratische Verschiebung oder MSD zwischen aufeinanderfolgenden Lokalisierungen für jede Spur mit insgesamt n Schritten, verwenden Sie nur Spuren mit mindestens fünf Lokalisierungen, um die statistische Unsicherheit der MSD zu reduzieren. Berechnen Sie als Nächstes den scheinbaren Diffusionskoeffizienten pro Spur aus dem MSD. Der zweite Term korrigiert den geschätzten Lokalisierungsfehler.

Dies sind die Werte für den zweiten Term. In diesem Beispiel zeichnen Sie nun ein Histogramm der gemessenen Diffusionskoeffizientenwerte von allen Spuren im Sichtfeld für Pol One in unbeschädigten Zellen und für Pol One in Zellen unter DNA-Schadensbehandlung mit MMS, die roten Balken identifizieren die Population einzelner Pol One-Moleküle, die an das Chromosom gebunden zu sein scheinen und mit weniger als 0,15 Quadratmikrometern pro Sekunde diffundieren. Während sich frei diffundierende Moleküle mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,9 Quadratmikrometern pro Sekunde bewegen.

Nach dem gebundenen Paul wurden Moleküle identifiziert. Die Positionen der Bindungsstellen können sowohl in ungeschädigten Zellen als auch in Zellen mit mm-MS-Schädigung sichtbar gemacht werden. Der Anteil der gebundenen Spuren im Verhältnis zur Gesamtzahl der beobachteten Spuren liefert ein direktes quantitatives Maß für die DNA-Reparaturaktivität von pol.

Eine in vivo Photoaktivierung von pol one PA m Kirsch-Fusionsproteinen wurde in lebenden e coli Zellen durchgeführt. Die Photoaktivierung konnte auf ein einzelnes PA m-Kirschfluorophor in einer Zelle beschränkt werden, höhere Photoaktivierungsraten zeigten mehr fluoreszierende Moleküle. Die Lokalisierungsanalyse wurde für jedes Bild eines Palm-Films durchgeführt.

Die Präzision wurde mit unbeweglichen Molekülen in fixierten Zellen oder gebundenen Molekülen in lebenden Zellen gemessen und es wurde festgestellt, dass 40 Nanometer in Übereinstimmung mit der theoretischen Vorhersage liegen. Als nächstes wurde der Lokalisierungsschwellenwert festgelegt, wenn er zu niedrig war. Zufällige Spitzen im Hintergrundrauschen wurden fälschlicherweise als Kandidatenpositionen ausgewählt, während bei zu hohen Schwellenwerten einige Punkte übersehen wurden.

Die resultierenden Paul-One-Lokalisationen nahmen den zentralen Bereich der Zelle ein und rekapitulierten weitgehend die räumliche Organisation des E-Coli-Nukleoids. Die Mehrzahl der Paul, die man in unbeschädigten Zellen verfolgt, zeigen Diffusion. Eine typische Zelle enthält mehrere hundert Paul one Spuren, was der Kopienzahl von etwa 400 Paul one Molekülen pro e coli Zelle entspricht.

Verschiedene Arten von molekularer Bewegung können identifiziert werden, indem MSD-Werte über einen Bereich von Verzögerungszeiten berechnet werden, die gerichtete Bewegung ergibt eine parabolische Kurve. Die Brownsche Bewegung ist durch eine gerade Linie gekennzeichnet. Eine geschlossene Diffusionskurve erreicht ein Plateau und ein Versatz der MSD-Kurve für unbewegliche Partikel stellt die Lokalisierungsunsicherheit dar.

Die resultierende MSD-Kurve für Paul eins stieg linear für kurze Verzögerungszeiten an, die auf eine Brownsche Bewegung hindeuteten, und sättigte bei längeren Verzögerungszeiten aufgrund des Zelleinschlusses. Mit diesen Methoden wurde die DNA-Reparaturaktivität von Paul als Reaktion auf exogene DNA-Alkylierungsschäden in ungeschädigten Zellen gemessen. Das Diffusionskoeffizienten-Histogramm von Paul eins zeigt eine dominante Population von diffundierenden Molekülen.

Die wenigen gebundenen Moleküle könnten an der DNA-Replikation und Reparatur von endogenen DNA-Schäden unter kontinuierlicher 100 millimolare MMS-Schädigung beteiligt sein. Die Häufigkeit von Leiterbahnen mit Diffusionskoeffizienten nahe Null nimmt deutlich zu. Dies unterstützt das Modell, dass mehr Paul one Moleküle an der DNA-Reparatur beteiligt sein müssen, wobei Mutagen vorhanden ist Nach diesem Verfahren.

Andere Datenanalysemethoden wie Lokalisierung und Clustering können durchgeführt werden, um die räumliche Verteilung von Proteinen in der Zelle zu quantifizieren und das Vorhandensein größerer Proteinkomplexe zu untersuchen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind.