Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen in lebenden Bakterienzellen direkt zu visualisieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem Zellen beobachtet werden, die ein photoaktiviertes fluoreszierendes Protein exprimieren, das mit einem DNA-bindenden Protein der gewünschten Spezifität fusioniert ist. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Film einzelner Proteine aufzunehmen, während diese bei der Bildgebung photoaktiviert werden.

Anschließend werden die Daten analysiert, um Proteinlokalisationen zu bestimmen und Proteine innerhalb einzelner Zellen zu verfolgen. DNA-Bindungsereignisse werden durch die Änderung des Diffusionskoeffizienten einzelner Proteine erkannt, wenn diese mit Chromosomen in Kontakt kommen. Letztendlich können die Ergebnisse eine quantitative Messung von Protein-DNA-Wechselwirkungen auf Ebene einzelner Zellen liefern, indem die Anzahl gebundener und diffundierender Proteine pro Zelle gezählt wird.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, wie beispielsweise die Reparaturraten in vivo und die räumliche Verteilung von Reparaturstellen. Nun werden wir die Methode demonstrieren, indem wir die Reparaturaktivität der DNA-Polymerase eins in lebenden E. coli-Zellen messen. Erstellen Sie zunächst Deckgläser ohne Hintergrund-Fluoreszenzpartikel, indem Sie diese eine Stunde lang bei 500 Grad Celsius in einem Ofen verbrennen. Verbrennen Sie einen Vorrat an Deckgläsern der Dicke Nummer 1,5 und lagern Sie diese bei Raumtemperatur in Aluminiumfolie.

Sie sind noch wochenlang haltbar. Als Nächstes zentrifugieren Sie ein Milliliter einer frühen exponentiellen Phase von E. coli der Stammkultur AB1157 poly A PA mCherry in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 2.300 ×g für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 Mikrolitern Restmedium, und vortexen Sie die Zellen, um sie in Lösung zu bringen. Stellen Sie anschließend eine 1,5 %ige Lösung mit niedriger Fluoreszenz aus Agarose in destilliertem Wasser her. Mischen Sie 500 Mikroliter der geschmolzenen Agarose mit 500 Mikrolitern zweifach konzentriertem Minimalmedium, indem Sie einige Male vorsichtig auf- und abpipettieren, für DNA-Schädigungsversuche unter Verwendung von Methylmethansulfonat oder MMS unter Einhaltung von Vorsichtsmaßnahmen.

Fügen Sie 8,3 µL MMS dem 500 µL Minimalmedium hinzu, bevor Sie es mit den aros vermischen, solange die Mischung noch nicht abgekühlt ist. Geben Sie die Mischung auf ein ausgeglühtes Deckglas. Verteilen Sie sie gleichmäßig und mittig, ohne Blasen zu bilden.

Glätten Sie das Polster mit einem zweiten ausgebrannten Deckglas. Nach dem Abkühlen entfernen Sie das obere Deckglas vom Polster und geben einen Mikroliter konzentrierter Zellsuspension hinzu. Immobilisieren Sie die Zellen, indem Sie das Polster mit einem neuen ausgebrannten Deckglas bedecken und vorsichtig andrücken.

Die Zellen sollten innerhalb von 45 Minuten abgebildet werden, bevor sie austrocknen. Um diese Zeit zu verlängern, kann das Pad für DNA-Schadens-Experimente innerhalb einer Silikon-Dichtung versiegelt werden. Inkubieren Sie die Zellen vor der Bildgebung 20 Minuten lang auf dem Pad.

In einem befeuchteten Behälter bei Raumtemperatur verfügt das Mikroskop über einen 405 Nanometer Photoaktivierungslaser und einen 561 Nanometer Anregungslaser. Durch die hochgeneigte Beleuchtung, bei der nur Fluorophore innerhalb eines dünnen Abschnitts oberhalb der Deckglaskante angeregt werden, wird Einzelmolekülempfindlichkeit erreicht; die Fluoreszenzemission wird mit einer elektronenvervielfachenden CCD-Kamera aufgezeichnet. Platziere die Probe auf dem Mikroskoptisch und fokussiere die Zellen scharf.

Definieren Sie unter Durchlichtbeleuchtung ein beschnittenes Bildfeld, um die Datengröße zu reduzieren und die Kamera-Lesegeschwindigkeit zu erhöhen. Schützen Sie die Probe vor Umgebungslicht und schalten Sie die Verstärkung der elektronenvervielfachenden CCD-Kamera für die Einzelfluor vier-Detektion ein. Stellen Sie die Bildrate auf 15,26 Millisekunden pro Bild ein.

Dazu gehört die 0,26 Millisekunden lange Kameralesezeit. Die Belichtungszeiten müssen ausreichend kurz sein, um scharfe fluoreszierende Punkte mit geringer Bewegungsunschärfe beobachten zu können. Andererseits müssen die Spuren in ausreichend langen Zeitintervallen abgetastet werden, um gebundene von diffundierenden Molekülen eindeutig unterscheiden zu können. Zeigen Sie nun die Kameradaten an, um das dunkle Hintergrundsignal zu überprüfen.

Schalten Sie den 561 Nanometer Laser ein und überprüfen Sie das Anregungshintergrundsignal. Schalten Sie den 405 Nanometer Laser zur photochemischen Aktivierung der Paul-one-PA-mCherry-Fusionsproteine ein und erhöhen Sie die Intensität, bis fluoreszierende Einzelmolekülspots erscheinen. Stellen Sie nun den Winkel des Anregungsstrahls so ein, dass nur ein dünner Schnitt der Probe beleuchtet wird.

Schließen Sie die Deckglasoberfläche. Diese Methode beruht auf der Detektion und präzisen Lokalisierung einzelner fluoreszierender Proteine, weshalb die optimale Ausrichtung und Empfindlichkeit des Mikroskops entscheidend für die Datenqualität sein wird. Richten Sie hierzu den Laserstrahl in die hintere Brennebene eines 100x-Objektivs mit numerischer Apertur 1,4.

Wenn man die Fokussierlinse senkrecht zum Strahl verschiebt, bewegt sich der Fokus vom Zentrum des Objektivs weg, wodurch der Strahl unter einem Winkel aus dem Objektiv austritt. Stellen Sie den Strahl so ein, dass die Fluoreszenzintensität maximiert und die Hintergrundfluoreszenz minimiert wird. Suchen Sie ein neues Bildfeld mit Zellen im Durchlichtmikroskopie-Modus und fokussieren Sie das Bild.

Nehmen Sie eine Kameramessung vor, um die Zellkonturen zu erfassen. Schalten Sie den 561 Nanometer Laser ein und bleichen Sie die zelluläre Autofluoreszenz sowie die Hintergrundflecken auf dem Deckglas aus. Warten Sie einige Sekunden.

Bevor Sie mit der Datenaufnahme beginnen, starten Sie die Aufnahme eines PALM-Films unter kontinuierlicher Anregung mit 561 Nanometer. Schalten Sie den 405 Nanometer Laser ein und erhöhen Sie die Intensität im Verlauf des Films schrittweise bis auf einen Watt pro Quadratzentimeter. Vermeiden Sie höhere Intensitäten im 405 Nanometer-Bereich, die zu zellulärer Autofluoreszenz führen können.

Achten Sie auf die Dichte der fluoreszierenden Moleküle. Es ist wichtig, die Aktivierungsrate niedrig zu halten, sodass die fluoreszierenden Punkte in jedem Einzelbild klar getrennt sind. Nehmen Sie etwa 10.000 Bilder pro Aufnahme auf, was bei einem beschnittenen Bildausschnitt typischerweise bis zu drei Minuten dauert und bis zu einem Gigabyte Festplattenspeicher belegt.

Beachten Sie, dass nach der Aufnahme eines Bildfeldes die Pa m-Cherry-Fluorophore irreversibel gebleicht sind und nicht mehr beobachtet werden können. Wie bereits erwähnt, wird für das folgende Verfahren benutzerdefinierte Software in Matlab verwendet. Einzelne Fluorophore erscheinen als Punktverteilungsfunktionen oder PSFs.

In dem Film werden PSFs zunächst in einem bandpassgefilterten Bild mithilfe eines Gauß-Kerns mit einem Durchmesser von sieben Pixeln identifiziert; die Kandidatenpositionen entsprechen PSFs, deren Peak-Pixelintensitäten 4,5-mal über der Standardabweichung des Hintergrunds liegen. Das lokal hellste Pixel pro PSF-Kandidat dient als Startwert für die Anpassung einer elliptischen Gauß-Funktion. Die freien Anpassungsparameter sind X-Position, Y-Position, X-Weite, Y-Weite, Rotationswinkel, Amplitude und Hintergrundoffset.

Die elliptische Gauß-Maske berücksichtigt die Molekülbewegung während der Belichtungszeit, wodurch die PSF-Plot verwischt und verformt wird. Die resultierenden XY-Lokalisationen aus allen Einzelbildern des PALM-Videos werden auf das Transmissionslicht-Mikroskopiebild desselben Bildausschnitts projiziert; Lokalisationen von Paul one PAM Cherry sollten innerhalb des zentralen Bereichs von E. coli-Zellen erscheinen. Die automatisierte Verfolgung misst die Proteinebewegung, doch die erfolgreiche Wahl eines Verfolgungsfensters ist entscheidend.

Zunächst führen Sie den Verfolgungsalgorithmus für einen Bereich von Parameterwerten für das Verfolgungsfenster durch. Tragen Sie die Anzahl der gemessenen Spuren pro Zelle in Abhängigkeit vom Verfolgungsfenster auf, um das kleinste mögliche Verfolgungsfenster zu identifizieren, das keine Spuren unterbricht. Zeigen Sie die resultierenden Spuren auf dem Bild der Durchlichtmikroskopie desselben Bildfeldes an. Um die räumliche Verteilung der Molekülbewegung innerhalb von Zellen zu visualisieren, sollten P-Einzeltrajektorien die Diffusion innerhalb einzelner Zellen zeigen. Wenn ein Anteil der Spuren zwischen Zellen zu verlaufen scheint, deutet dies darauf hin, dass separate Moleküle fälschlicherweise verknüpft wurden, weil das Verfolgungsfenster zu groß gewählt wurde und/oder die Photoaktivierungsrate zu hoch war.

Zeichnen Sie die kumulative Verteilung der Schrittlängen zwischen aufeinanderfolgenden Lokalisationen auf. Die Kurve steigt an und sättigt sich bei ausreichend großen Tracking-Fenstern gleichmäßig, zeigt jedoch eine Abschneidekante, wenn das Fenster zu klein gewählt wurde. Sobald ein geeignetes Tracking-Fenster gewählt wurde, können die Diffusionseigenschaften von Paul one analysiert werden.

Berechnen Sie die mittlere quadratische Verschiebung oder MSD zwischen aufeinanderfolgenden Lokalisierungen für jede Spur mit insgesamt n Schritten; verwenden Sie dabei nur Spuren mit mindestens fünf Lokalisierungen, um die statistische Unsicherheit der MSD zu verringern. Berechnen Sie anschließend den apparenten Diffusionskoeffizienten pro Spur aus der MSD. Der zweite Term korrigiert den geschätzten Lokalisierungsfehler.

Dies sind die Werte für den zweiten Term. In diesem Beispiel wird nun ein Histogramm der gemessenen Diffusionskoeffizientenwerte aller Spuren im Sichtfeld für Pol eins in nicht geschädigten Zellen und für Pol eins in Zellen unter DNA-Schädigungsbehandlung mit MMS dargestellt. Die roten Balken kennzeichnen die Population einzelner Pol-eins-Moleküle, die an das Chromosom gebunden erscheinen und sich mit weniger als 0,15 Quadratmikrometern pro Sekunde bewegen. Frei diffundierende Moleküle hingegen bewegen sich etwa 0,9 Quadratmikrometer pro Sekunde.

Nachdem die gebundenen Paul-one-Moleküle identifiziert wurden, können die Positionen der Bindungsstellen in intakten Zellen sowie in Zellen mit mm-MS-Schäden sichtbar gemacht werden. Der Anteil gebundener Spuren im Verhältnis zur Gesamtanzahl beobachteter Spuren liefert ein direktes, quantitatives Maß für die DNA-Reparaturaktivität von Pol.

Eine in vivo-Photoaktivierung von Pol-One-PA-mCherry-Fusionsproteinen wurde in lebenden E. coli-Zellen durchgeführt. Die Photoaktivierung konnte auf einen einzelnen PA-mCherry-Fluorophor in einer Zelle beschränkt werden; höhere Photoaktivierungsraten zeigten mehr fluoreszierende Moleküle. Die Lokalisierungsanalyse wurde für jeden Einzelbild eines PALM-Videos durchgeführt.

Die Präzision wurde mithilfe ortsfester Moleküle in fixierten Zellen oder gebundener Moleküle in lebenden Zellen gemessen und betrug 40 Nanometer, was mit der theoretischen Vorhersage übereinstimmt. Anschließend wurde die Lokalisierungsschwelle festgelegt, wenn sie zu niedrig war. Zufällige Peaks im Hintergrundrauschen wurden fälschlicherweise als Kandidatenpositionen ausgewählt, während bei einer zu hohen Schwelle einige Stellen nicht erfasst wurden.

Die resultierenden Paul-one-Lokalisationen nahmen den zentralen Bereich der Zelle ein und rekapitulierten weitgehend die räumliche Organisation des E. coli-Nukleoids. Die Mehrheit der Paul-one-Spuren in nicht geschädigten Zellen zeigt Diffusion. Eine typische Zelle enthält mehrere hundert Paul-one-Spuren, was mit der Kopienzahl von etwa 400 Paul-one-Molekülen pro E. coli-Zelle übereinstimmt.

Unterschiedliche Arten der molekularen Bewegung können identifiziert werden, indem MSD-Werte über einen Bereich von Verzögerungszeiten berechnet werden: gerichtete Bewegung ergibt eine parabelförmige Kurve. Brown’sche Bewegung zeichnet sich durch eine Gerade aus. Eine Kurve bei eingeschränkter Diffusion erreicht eine Sättigung, und eine Verschiebung der MSD-Kurve für immobilisierte Teilchen stellt die Lokalisierungsgenauigkeit dar.

Die resultierende MSD-Kurve für Paul one stieg bei kurzen Verzögerungszeiten linear an, was auf eine brownsche Bewegung hinweist, und erreichte bei längeren Verzögerungszeiten ein Plateau, bedingt durch die Einschränkung der Zelle. Mit Hilfe dieser Methoden wurde die DNA-Reparaturaktivität von Paul one als Reaktion auf exogene DNA-Alkylierungsschäden in nicht geschädigten Zellen gemessen. Das Diffusionskoeffizienten-Histogramm von Paul one zeigt eine dominante Population diffundierender Moleküle.

Die geringe Anzahl gebundener Moleküle könnte an der DNA-Replikation und der Reparatur endogener DNA-Schäden unter kontinuierlicher 100 millimolarer MMS-Belastung beteiligt sein. Die Häufigkeit von Spuren mit nahezu null liegenden Diffusionskoeffizienten nimmt signifikant zu. Dies stützt das Modell, dass mehr Paul-one-Moleküle bei Anwesenheit eines Mutagens in die DNA-Reparatur eingebunden sein müssen, wenn diesem Verfahren gefolgt wird.

Andere Methoden der Datenanalyse wie Lokalisierung und Clusterung können durchgeführt werden, um die räumliche Verteilung von Proteinen in der Zelle zu quantifizieren und das Vorhandensein größerer Protein-Komplexe, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu untersuchen.