Drosophila Courtship Conditioning Als Maß für Lernen und Gedächtnis

Die Balzkonditionierung ist ein klassischer Drosophila-Lern- und Gedächtnistest, der auf einer Verringerung des männlichen Balzverhaltens nach sexueller Ablehnung durch ein nicht empfängliches Weibchen basiert. Dieser Assay kann verwendet werden, um das Lernen, das Kurzzeitgedächtnis und das Langzeitgedächtnis zu testen. Mit dieser Methode können grundlegende Mechanismen, die dem Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, aufgedeckt und der Einfluss verschiedener genetischer oder umweltbedingter Bedingungen auf Lernen und Gedächtnis untersucht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Lernen und das Gedächtnis robust bewertet. Es nutzt eine natürlich vorkommende Form der Verhaltensplastizität und kann mit minimalem Versuchsaufbau durchgeführt werden. Elf Tage vor dem Sammeln der experimentellen männlichen Fliegen beginnen Sie mit fünf bis 20 Wildtyp-Kulturen, die jeweils eine gemischtgeschlechtliche Population von 60 bis 100 Fliegen enthalten.

Bereiten Sie jedes Anzuchtfläschchen mit Powerfood und einem Stück Filterpapier vor, um die Oberfläche für die Verpuppung zu erweitern. Die Verwendung von Powerfood ist ein wesentlicher Schritt, um eine große Anzahl von vorverpaarten Weibchen zu produzieren. Geben Sie 10 Tage vor der Entnahme der männlichen Probanden Filterpapier auf eine Fliegenfutterflasche und etablieren Sie mindestens sechs normale 175-Milliliter-Fläschchenkulturen.

Geben Sie dann etwa 20 männliche und 30 bis 70 jungfräuliche weibliche Pflanzen in jede Flasche. In diesem Experiment werden neuartige experimentelle Wohnblöcke vorgestellt. Bereiten Sie diese Blöcke nicht länger als zwei Tage vor dem Experiment vor.

Schmelzen Sie Power-Lebensmittel und geben Sie mit einer Repetierpipette einen halben Milliliter davon in jede Vertiefung eines 96-Well-Blocks mit flachem Boden. Nachdem die Lebensmittel fest geworden sind, decken Sie den Block mit PCR-Klebefolie ab. Stechen Sie dann mit einer 0,8-Millimeter-Nadel mindestens vier Atemlöcher in jede Vertiefung

Schneiden Sie dann die Folie zwischen den Vertiefungen der Länge nach ab, aber nicht ganz ganz. Lassen Sie einen intakten Filmstreifen an einem Ende der Platte. Die Blöcke können bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis zu zwei Tage.

Einen Tag vor dem Sammeln von experimentellen männlichen Fliegen, zwei bis fünf Stunden vor der subjektiven Morgendämmerung der Fliegen, entfernen und entsorgen Sie alle erwachsenen Fliegen aus den Wildtyp-Power-Nahrungskulturen. Sammeln Sie dann alle zwei bis drei Stunden die frisch eingeschlossenen adulten Tiere aus diesen Kulturen mit Kohlendioxid. Sammeln Sie bis zu 200 Fliegen in ein neues Power-Food-Fläschchen, das mit etwas Filterpapier ergänzt wird.

Inkubieren Sie diese Paarungsfläschchen vier Tage lang, um sicherzustellen, dass sich alle Weibchen gepaart haben. Sammle genügend Weibchen für alle anstehenden Trainings- und Testschritte. Die Qualität dieser Kultur ist wichtig für den Erfolg dieses Experiments.

Übertragen Sie nur frisch eingeschlossene Fliegen und keine alten Fliegen, Larven oder Puppen. Es ist auch wichtig, dass genügend Männchen vorhanden sind, um mit allen Weibchen zu kopulieren. Räumen Sie am nächsten Tag, zwei bis drei Stunden vor der subjektiven Morgendämmerung, den anderen Satz normaler Lebensmittelkulturfläschchen ab, um männliche Probanden zu sammeln.

Betäuben Sie alle Erwachsenen mit Kohlendioxid und entsorgen Sie sie aus dem Fläschchen. Sammeln Sie dann in den nächsten fünf bis sechs Stunden alle 20 bis 30 Minuten frisch geschlossene männliche Fliegen. Die Männchen müssen frisch eingeschlossen sein und eine blasse Pigmentierung und das Vorhandensein des Mekoniums auf ihrem durchscheinenden Hinterleib aufweisen.

Bewegen Sie als Nächstes einzelne Männchen mit einem Aspirator in die Vertiefungen des Wohnblocks. Sammeln Sie bis zu 48 männliche Tiere pro Testbedingung. Achten Sie darauf, den Gehäuseblock wieder sicher mit der PCR-Folie zu verschließen.

Bruten Sie die Männchen isoliert aus, bis sie vier Tage alt sind. Starten Sie dann das Training. Um die Trainingsphase des Experiments vorzubereiten, beginnen Sie damit, alle erwachsenen Tiere aus den vier Tage alten Paarungsfläschchen zu betäuben.

Trennen Sie die Geschlechter und setzen Sie einzelne vorverpaarte Weibchen in jede der 12 Vertiefungen einer Reihe eines Haltungsblocks um. Nehmen Sie dann mit einem Aspirator und ohne Betäubung die naiven Männchen aus ihren Heimatbrunnen und bringen Sie sie in die Vertiefungen, in denen sich die vorverpaarten Weibchen befinden. Wiederholen Sie diesen Vorgang in einer zweiten Reihe, um 12 weitere Paare einzurichten.

Um das Lernen oder das Kurzzeitgedächtnis zu testen, führen Sie dieses Setup im Morgengrauen durch und lassen Sie die Trainingsphase eine Stunde lang laufen. Um das Langzeitgedächtnis zu testen, stellen Sie die Paare vier Stunden vor der subjektiven Morgendämmerung auf und lassen Sie das Training acht Stunden lang laufen. Damit Lernen und Gedächtnis aufgebaut werden können, ist es wichtig, dass die Männchen nicht kopulieren.

Kontrollieren Sie die Paare während der Trainingszeit regelmäßig, um sicherzustellen, dass die Männchen abgelehnt werden. Wenn die Trainingszeit vorbei ist, nehmen Sie die Männchen vorsichtig mit einem Aspirator aus den Vertiefungen, nicht mit Kohlendioxid-Anästhesie. Lade die Rüden in einen neuen Haltungsblock.

Für das Lernexperiment testen Sie die Männchen sofort nach dem Training ohne Ruhepause. Gönnen Sie den Männchen für das Kurzzeitgedächtnis-Experiment eine Stunde Ruhe, bevor Sie mit der Testphase beginnen. Für das Langzeitgedächtnis-Experiment ruhen Sie die Männchen bis zur folgenden subjektiven Morgendämmerung aus.

Um sich auf die Testphase des Experiments vorzubereiten, betäuben Sie vorverpaarte Weibchen und übertragen Sie sie in ein neues normales Futterfläschchen. Warten Sie mindestens eine Stunde, bis sich die Fliegen von der Narkose erholt haben. Bereiten Sie als Nächstes das Test-Setup vor.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Videorekorder bereithalten, um die Aktivitäten in den Balzarenen aufzuzeichnen. Um den Test zu starten, bringen Sie ein Testmännchen mit sanftem Aspiration aus dem Haltungsblock in die Balzarena, wobei die Trennwände geschlossen sind. Verschiebe die Einfluglöcher zwischen den Arenen, bis alle 18 Arenen mit einzelnen Männchen beladen sind.

Setze dann mit der gleichen Technik einzelne vorverpaarte Weibchen in jede der 18 Arenen um, aber auf die gegenüberliegende Seite der Trennwände. Drehen Sie nun die Balzarena vorsichtig um und platzieren Sie sie unter der Videokamera, wobei die Vertiefungsöffnungen nach unten zur weißen Bankoberfläche zeigen. Entfernen Sie dann die Trennwände und starten Sie die Videoaufnahme.

Zeichnen Sie mindestens 10 Minuten Aktivität auf. Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie die Fliegen mit einem Vakuum aus den Arenen und lüften Sie die Balzkammern mindestens 10 Minuten lang, bevor sie wiederverwendet werden. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um das Kurzzeit- und Langzeitgedächtnis von Fliegen mit einem neuronenspezifischen RNAi-Knockdown der Dihydroxyacetonphosphat-Acyltransferase oder Dhap-at zu testen.

Die Kontrollen exprimierten eine unspezifische RNAi, die auf ein Nemotod-Zinkfinger-Gen abzielte. In beiden Tests hatten trainierte Kontrollen einen niedrigeren medianen Balzindex als ihre naiven Gegenstücke, was das erwartete Ergebnis für normale Fliegen ist. Im Vergleich dazu waren trainierte Dhap-at-Knockdown-Männchen im Langzeitgedächtnistest nicht besser als naive Fliegen.

Eine quantitative Analyse des Gedächtnisses ist der Lernindex-Score. Dieser Index spiegelt das Defizit im Langzeitgedächtnis wider, das bei den Dhap-at-Knockdown-Männchen beobachtet wurde. Um die Variation zu demonstrieren, die typischerweise zwischen den Tagen zu beobachten ist, wurden beide Tests an zwei oder drei aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.

Trotz der täglichen Schwankungen war es immer noch möglich, das Defizit an jedem Versuchstag zu reproduzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Lernen, das Kurzzeitgedächtnis und das Langzeitgedächtnis mit dem Paradigma der Balzkonditionierung analysieren können. Einmal gemeistert, kann die Balzkonditionierung auf sechs bis acht Genotypen parallel getestet werden, wenn es darum geht, das Lern-, Kurzzeit- oder Langzeitgedächtnis zu bewerten.

Sobald die ersten Kulturen etabliert sind, dauert es etwa 20 Tage, bis die Experimente abgeschlossen sind. Das Verhalten von Tieren kann sehr unterschiedlich sein. Daher ist es wichtig, alle potenziellen Umweltfaktoren wie Licht-, Temperatur- und Feuchtigkeitsunterschiede zu eliminieren.

Ebenso ist es wichtig, die Fliegen konsequent schonend zu behandeln. Sobald ein Lern- und Gedächtnisdefizit in einer bestimmten Mutante identifiziert wurde, können Sie zusätzliche Methoden verwenden, um den zugrunde liegenden Mechanismus zu verstehen. Zum Beispiel durch Genexpressionsanalysen oder genetische Interaktionsexperimente.