Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung von Sequenzierungsbibliotheken für die Basenpaarauflösung D-N-A-C-P-G, Methylierungsanalyse basierend auf dem Verdau von Restriktionsenzymen in Kombination mit Cytosin durch Sulfitumwandlung. Dies wird erreicht, indem zunächst ein MSP-Verdau eines Restriktionsenzyms von hochwertiger DNA durchgeführt wird, gefolgt von einer Endreparatur, einem Tailing und einer Ligation von methylierten Adaptern. Der nächste Schritt besteht darin, die Sulfit-Umwandlung an ausgewählten Fragmenten durchzuführen, nachdem sie die Sulfit-Umwandlung

Die Fragmente werden mittels PCR amplifiziert. Der letzte Schritt ist die Durchführung der Qualitätskontrolle und Sequenzierung, gefolgt von der Datenvisualisierung und -analyse. Letztendlich detektiert die verbesserte reduzierte Repräsentation der Bi-Sulfit-Sequenzierung die quantitative Basenpaarauflösung von Cytidin-Methylierungsmustern an CG-reichen genomischen Loci.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen DNA-Methylierungsmethoden, wie z. B. Microarrays, besteht darin, dass sie kleine Eingangsmaterialmengen verwenden kann, um D-N-A-C-P-G-Methylierungsdaten mit hoher Abdeckung mit Basenpaarauflösung und biologisch relevanten Stellen zu erzeugen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir daran interessiert waren, epigenetische Muster jenseits von Regionen zu erforschen, die in traditionellen Assays abgedeckt werden. Wir waren daran interessiert, diese Technik zu entwickeln, um von Microarrays zur Generierung von DNA-Methylierungsdaten mit Basenpaarauflösung überzugehen, die mit Daten aus anderen Techniken der nächsten Generation integriert werden können.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten. Zum Beispiel epigenetische Musterbildung und Heterogenität in biologischen Proben im Vergleich zu normalen Kontrollen oder anderen Krankheitszuständen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Länge des Verfahrens, der zahlreichen spezifischen Anforderungen und der einzigartigen Sequenzierungseigenschaften der Bibliotheken, die den Mamie-Fall erzeugen, eine Herausforderung darstellen.

Ein Forschungsspezialist in unserem Labor wird Ihnen bei der Demonstration des Verfahrens behilflich sein, um dieses Protokoll zu starten. Bereiten Sie zunächst gereinigte Aliquots von genomischen DNA-Proben vor, die einem MSP-Ein-Restriktionsenzymverdau, einer stumpfen Endreparaturreaktion und einer einzelnen Nukleotidzugabe an den drei Prime-Enden unterzogen wurden. Zu diesem Zeitpunkt sind die DNA-Produkte bereit für Adapterligationen, um mit dem Transfer von 10 Mikrolitern der A-A-L-D-N-A-Probe in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen zu beginnen und das Röhrchen auf Eis zu legen.

Legen Sie zusätzlich ein Aliquot der Adaptermoleküle auf Eis. Bereiten Sie als Nächstes die Ligationsreagenzmischung auf Eis vor. Geben Sie sowohl das Ligationsreagenz als auch die Adaptermoleküle in die DNA-Probe und pipettieren Sie zum Mischen einige Male auf und ab.

Legen Sie ein PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und lassen Sie die Ligationsreaktion am nächsten Tag über Nacht bei 16 Grad Celsius ablaufen. Reinigen Sie die Ligationsprodukte mit einem Festphasen-DNA-Extraktionskit auf Basis von Magnetbeads oder Siliziumdioxidsäulen. Im letzten Schritt des Reinigungsprozesses.

Eluieren Sie die DNA, indem Sie 30 Mikroliter DNA-freies Wasser hinzufügen. Das aufgereinigte DNA-Produkt kann bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, bis es für Proben benötigt wird, die mit einer Gesamt-DNA von 25 Nanogramm oder mehr begonnen haben. Verwenden Sie ein automatisiertes Gelextraktionsgerät wie das PI and Prep, um nach ligierten Produkten mit Längen zwischen 150 Basenpaaren und 400 Basenpaaren zu selektieren.

Achten Sie darauf, DNA-Visualisierungsfarbstoffe wie Ethereum, Bromid oder Cyber Green von der Agros-Kassette auszuschließen, da sie die DNA-Migrationseigenschaften der gegabelten adaptergebundenen Fragmente verändern können. Für diesen Schritt des Protokolls können auch Standardprotokolle zur Größenauswahl auf Basis von Agros-Gel verwendet werden, um die DNA-Elektrophorese auf einer pippin 2%-farbstofffreien Arous-Kassette einzurichten. Erstellen Sie ein neues Protokoll in der Pippin Prep-Konsole und wählen Sie die Option 2%DF Marker L als Kassette Ihrer Wahl aus.

Aktivieren Sie dann die Option Interne Standards verwenden, und stellen Sie sicher, dass die Referenzspurnummer mit den Spurnummern für die Isolierung von DNA-Fragmenten im Bereich von 150 Basenpaaren bis 400 Basenpaaren übereinstimmt. Wählen Sie die Option "Bereich" als Entnahmemodus und geben Sie die folgenden Grenzwerte ein: 135 für den Start des Basispaars, 410 für das Ende des Basispaars und 240 für das Basispaar Pfoten. Dies weist die Vorrichtung an, das elektrophoretische Feld auf den Elektroelutionsausgang auszurichten.

Wenn DNA-Fragmente innerhalb dieses Bereichs in der Nähe des Auslasses unterwegs sind. Bereiten Sie nach dem Speichern der Protokolldatei die Gelkassette und die Probenladevertiefungen des Instruments vor, indem Sie die Standardarbeitsanweisungen von Pippen Prep bei der Einrichtung des Instruments befolgen. Bereiten Sie die DNA-Proben für die Elektrophorese vor, indem Sie 10 Mikroliter des DNA-Markers zu einem 30-Mikroliter-Aliquot einer bestimmten Post-Ligationsprobe hinzufügen, um die Mischungen auf die Gelkassette zu laden.

Entfernen Sie zunächst 40 Mikroliter des Elektrophoresepuffers aus jeder Probe. Ersetzen Sie dann das Volumen, indem Sie jeweils 40 Mikroliter Probenmarkermischung in einzelne Vertiefungen pipettieren. Kehren Sie zur Konsole zurück, laden Sie das gespeicherte Protokoll und drücken Sie Start, um die Elektrophorese zu starten.

Wenn das Programm das Basenpaar 240 erreicht, werden im Pausenschritt manuell 40 Mikroliter des Ausgangs mit einer Pipette von jedem Ausgangsanschluss gesammelt. Beschriften Sie diese Brüche als untere Bibliotheksfraktion. Nach dem Sammeln der unteren Bibliotheksfraktionen werden die Auslassöffnungen sofort mit 40 Mikrolitern frischem Elektrophoresepuffer gewaschen

Pipettieren Sie den Puffer mindestens dreimal auf und ab und saugen Sie dann das Netz an. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal, um alle Spuren von kurzen DNA-Spezies aus den Auslässen zu entfernen. Geben Sie nun 40 Mikroliter Elektrophoresepuffer in die Probe.

Versiegeln Sie die elucianischen Ports und drücken Sie die Run-Taste, um den elucianischen Prozess fortzusetzen. Nach Abschluss des Ellucian-Programms bei der Einstellung 410 Basenpaar sammeln Sie die 40 Mikroliter Inuit aus allen Auslassöffnungen und beschriften diese Fraktionen als obere Bibliotheksfraktion. Zu diesem Zeitpunkt sind beide Bibliotheksfraktionen gelgereinigt und bereits für die Bi-Sulfit-Umwandlung geeignet.

Führen Sie mit einem im Handel erhältlichen Kit den Bi-Sulfit-Umwandlungsassay für beide Bibliotheksfraktionen durch. Im letzten Schritt des Umwandlungsprozesses eluieren Sie die DNA-Proben in 40 Mikrolitern freiem DNA-Wasser. Nach der Bi-Sulfit-Umwandlung werden die resultierenden DNA-Bibliotheksfragmente einer Anreicherungs-PCR-Amplifikation unterzogen, bei der Primer verwendet werden, die an den Adapterenden jedes DNA-Moleküls hybridisieren.

Um sich auf die Anreicherungs-PCR vorzubereiten, fügen Sie zunächst 160 Mikroliter des PCR-Mastermixes zu jedem 40-Mikroliter-Aliquot einer durch Sulfid umgewandelten Probe hinzu. Teilen Sie dann die resultierende 200-Mikroliter-Mischung in vier 50-Mikroliter-Aliquots auf. In separaten PCR-Röhrchen.

Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler und amplifizieren Sie das umgewandelte DNA-Template. Nach der Anreicherung ziehen Sie die vier Post-PCR-Produkte in ein einziges 1,5-Milliliter-Röhrchen und reinigen Sie die DNA mit einem kommerziellen PCR-Cleanup-Kit. Wenn ein Festphasen-Extraktionskit mit magnetischen Beads zur Aufreinigung der PCR-Produkte verwendet wird, ändern Sie die Standardverfahren, indem Sie zuerst die kombinierten PCR-Produkte der unteren Bibliothek mit dem 1,7-fachen ihres Gesamtvolumens in den Beads mischen.

Mischen Sie dann die kombinierten PCR-Produkte der oberen Bibliothek mit dem 1,1-fachen ihres Gesamtvolumens in Kügelchen. Befolgen Sie dann das Protokoll des Herstellers bis zu den 70%igen Ethanol-Waschschritten, bei denen jedes der Waschvolumen im letzten Schritt des Reinigungsprozesses auf 800 Mikroliter geändert werden sollte. Eluieren Sie die DNA mit 50 Mikrolitern DNA-freiem Elutionspuffer.

Lagern Sie die gereinigten Bibliotheken bei minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt werden, und quantifizieren Sie mit einem fluoreszenzbasierten Assay, der für doppelsträngige DNA selektiv ist, die Menge des DNA-Gehalts nach der Anreicherung für jede Bibliotheksfraktion. Beurteilen Sie außerdem die Größe und Qualität der Bibliothek nach der Anreicherung mit einem Bioanalysator. Berechnen Sie die effektive DNA-Molarität einer bestimmten Bibliotheksfraktion, indem Sie die durchschnittliche DNA-Länge verwenden, die in Basenpaaren ausgedrückt wird.

Sobald die Molarität bekannt ist, verwenden Sie das freie Wasser der DNA, um jede entsprechende obere und untere Bibliotheksfraktion auf zwei nanomolare Endkonzentrationen zu verdünnen. Kombinieren Sie die unteren und oberen Bibliothekspaare in einem einzigen Röhrchen, um eine Mischung aus zwei nanomolaren Lochbibliotheken mit jeweils 20 Mikrolitern zu erhalten. Die gepoolte Probe ist nun bereit für einen Sequenzierungslauf.

Bei sequenzierungsbezogenen Assays, einschließlich E-R-R-B-S, sind die Qualität und Größenverteilung der Moleküle der oberen und unteren Bibliothek Schlüsselfaktoren für die Bestimmung der Qualität der endgültigen Sequenzierungsdaten. Im Vergleich zu herkömmlichen manuellen Gelextraktionsprotokollen erzeugt das automatisierte Gelextraktionsgerät, das im E-R-R-B-S-Protokoll verwendet wird, eine konsistente Größenverteilung und minimiert das Potenzial für eine Kontamination der Proben über die Proben hinweg. Als nächstes zeigen die Rohdaten aller DNA-Stränge nach dem Senden der in die BIS-Sulfit-Bibliothek umgewandelten Bibliotheksmoleküle zur Sequenzierung, dass für jeden gegebenen Strang die Datenqualität für jede Nukleotidposition direkt nach den ersten drei Nukleotiden dramatisch zunimmt.

Da die Konsensussequenz für diese drei Nukleotide für die überwiegende Mehrheit der Bibliotheksmoleküle mit CGG gesetzt ist, deuten die Daten darauf hin, dass das E-R-R-B-S-Protokoll eine Bibliothekssammlung hervorgebracht hat, die einen wünschenswerten Satz genomischer Fragmente enthält, die überwiegend flankiert sind. Mit MSP endet ein Restriktionsdigest aus der Vogelperspektive. Das E-R-R-B-S-Protokoll kann Daten zur Basenpaarauflösung von Cytidin-Methylierungsstellen über das gesamte Genom liefern.

Hier ist zum Beispiel Chromosom 12 zu sehen. Das Protokoll deckt eine reduzierte Repräsentation genomweiter CPGs ab. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man E-R-R-B-S-Bibliotheken für die Generierung von D-N-A-C-P-G-Methylierungsdaten mit Basenauflösung vorbereitet. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, mit qualitativ hochwertiger DNA zu beginnen, alle beschriebenen Schritte einzubeziehen, die Effizienz der Bisulfatumwandlung und -sequenzierung anhand der empfohlenen Parameter zu validieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenyl und Chloroform äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer die üblichen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten in einer Chemikalienhaube und die ordnungsgemäße Abfallentsorgung.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden wie Spyro-Sequenzierung oder Massenarray-Epityp können durchgeführt werden, um die Ergebnisse zu validieren. Darüber hinaus kann ein Genexpressionsprofiling durchgeführt werden, um die biologische Bedeutung der detektierten DNA-Methylierungsmuster zu bestimmen.

Die Fähigkeit, DNA- und Methylierungsmuster mit Basenpaarauflösung aus begrenzten Mengen an Einsatzmaterialien zu generieren, hat die Erstellung von Profilen seltener Zellpopulationen ermöglicht, die bisher nicht möglich war. Es hat auch die Erstellung von Profilen großer Kohorten klinischer Stichproben für die Erforschung der epigenetischen vermittelten Regulation und Heterogenität von Krankheiten ermöglicht.