Name: Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Lernen Sie Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing für DNA-Methylierungsanalysen bei Basenpaarauflösung. Diese Methode kombiniert Restriktionsenzym-Verdau mit Bisulfit-Konversion und ermöglicht hochaufgelöste epigenetische Daten aus kleinen Ausgangsmaterialien.

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Wir danken allen Autoren des ursprünglichen ERRBS-Berichts. Wir danken Mame Fall für die technische Unterstützung. Wir danken dem Weill Cornell Medical College Epigenomics Core für technische Dienstleistungen und Unterstützung. Die Arbeit wurde unterstützt durch ein Judah Folkman Fellowship der Sass Foundation, ein NCI K08CA169055 und ASH-AMFDP12005 für FGB, NIH R01HG006798 und R01NS076465, eine Finanzierung durch die Irma T. Hirschl und Monique Weill-Caulier Charitable Trusts und das STARR Consortium (I7-A765) für CEM und ein LLS SCORE Stipendium (7006-13) für AMM.

Alle Geschäfte durchgeführt werden von der Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und befolgt, National Institute of Health Richtlinien. 1. Operationstechnik <ol><li> Pflegen aseptische Technik bei diesem Verfahren, indem sie sterile Handschuhe, Instrumente, und ein steriles Operationsfeld nach NIH-Richtlinien 25. Sterilisieren Instrumente vor Beginn der Operation durch Autoklavieren ihnen (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Ausrüstung für die komplette Liste). Verwenden Sie eine Glasperlen Sterilisator Werkzeuge während der Operation zu sterilisieren. </li></ol> 2. Anästhesie und Vorbereitung <ol><li> Anesthetize die Maus in einem Anästhesie-Box mit einer Mischung aus 0,9 l / min Sauerstoff und 2,5% Isofluran mit einem veterinär Isofluran Verdampfersystem. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht zu Veränderungen in der Körperposition, bevor es dem Auspacken zu reagieren. </li><li> Bewerben Augensalbe auf die mouse in die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. </li><li> Schalten Sie den Gasstrom aus der Box an den Nasenkegel. Platzieren Sie die Maus direkt auf seiner linken Seite auf einer erhitzten Unterlage mit einem Operationsfeld und absorbierende Papierbank mit der Nase und den Mund innerhalb des Kegels bedeckt. Die Maus Atemrhythmus und bewerten fortlaufend zu überwachen und anzupassen Isofluran Ebenen nach Bedarf (zwischen 2,5 bis 3% Isofluran), ein angemessenes Niveau der Narkose zu halten und verwenden die Zehe Prise Reflex auf insgesamt Sedierung bestätigen. </li></ol> 3. Chirurgische Vorgehensweise <ol><li> Ausrichten und konzentrieren das Stereoskop mit dem OP-Feld. Passen Sie den Nasenkegel und kleben Sie es nach unten, so dass es am Rand des Gesichtsfeldes positioniert ist. </li><li> Mit der Maus, der auf der linken Seite, kleben Sie den Rand des rechten Ohr auf die Bugnase, Freilegung der Bereich hinter dem Ohr, wo der Schnitt gemacht werden. Stellen Sie sicher, dass die hintere Ohrvene fährt horizontal über das Ohr. Man beachte, dass die korrekte Platzierung ter Tier- und Taping des Ohres sind von entscheidender Bedeutung, um die Gesichtsnerven schnell zu finden. </li><li> Befeuchten Sie das Fell auf und hinter dem Ohr mit 70% Ethanol und rasieren die Operationsstelle mit einer Rasierklinge oder Skalpell. Vorbenetzung das Fell macht Rasieren leichter in dieser anatomischen Lage. </li><li> Reinigen der Haut mit einer Jodlösung, wie Betadine chirurgischen Scheuer (7,5% Povidon-Iod), gefolgt von 70% Ethanol. Wiederholen Sie diese Reinigung noch zweimal, um den Bereich gründlich zu desinfizieren. </li><li> Um festzustellen, wo der Schnitt zu machen, verfolgen Sie die hinteren Ohrvene aus dem Ohr nach kaudal auf den Bereich hinter dem Ohr Vorsprung. Mit Federschere, einen 4 mm Schnitt 2-3 mm hinter dem Vorsprung. </li><li> Präparieren durch das subkutane Fett und Bindegewebe mit stumpf. Vermeiden Sie direkte Schneiden mit der Schere, weil die Blutgefäße oder Muskelgewebe leicht beschädigt werden könnte. </li><li> Wenn die Blutung auf, Druck auf die Operationsstelle mit einem sterilen Wattestäbchenfür mindestens 30 sec. Wenn bedeutende Flüssigkeitsverlust auftritt, injizieren die Maus intraperitoneal mit bis zu 0,5 ml steriler 0,9% iger Kochsalzlösung unter Verwendung einer 25 oder 27 G-Nadel. </li><li> Verwenden Sie mehrere wichtige Sehenswürdigkeiten, die N. accessorius, Gehörgang, und vorderen M. digastricus (siehe unten), um die Gesichtsnerven zu lokalisieren. Sezieren um diese Landmarken, bis die Zweige des Gesichtsnervs visualisiert werden. Der Nerv wird als bedeutender solid weiß Struktur angezeigt, wenn es aufgedeckt wird und eine Schicht aus Faszie haftet sie an die zugrunde liegenden Strukturen. <ol><li> Finden Sie die N. accessorius, die aus dem kaudalen Teil des Schädels reist, um die Trapezmuskel innervieren, sobald das subkutane Fett und Bindegewebe wurden seziert. Der Gesichtsnerv ist tief mit dem N. accessorius. </li><li> Finden Sie die knorpeligen Gehörgang, die strahlend weißen aussieht und rostral des Gesichtsnerven zu sehen. </li><li> Finden Sie die Muskelbauch des vorderen M. digastricus, der oben auf und c liegtaudal des Gesichtsnervs. </li></ol></li><li> Wenn die Hauptzweige des Gesichtsnervs visualisiert, Spuren sie dorsal ihrer Herkunft aus den Foramen stylomastoideum finden. Mit feiner Spitze Dumont Pinzetten # 5/45 um die Operationsstelle offen zu halten, zu fördern die Federscherenspitzen nach dem Pfad des Nervs, und bewegen Sie die Zange dorsal um den neu erweiterten Bereich offen zu halten. </li><li> Visualisieren Sie die Stamm des Facialis mit dem Jochbein, bukkale, und Randkieferzweige an dieser Stelle. HINWEIS: Die zeitliche Niederlassung wird näher an das Foramen finden. Die Randkiefernervenäste in die oberen und unteren Teil näher an der Backe, damit diese Nervenäste nicht auf dieser Ebene sichtbar sein. <ol><li> Bei Durchführung einer Nervendurchtrennung, Stabilisierung des Nerven vorsichtig mit der feinen Spitze Pinzette und schneiden Sie die Nerven mit den Feder Schere. Vermeiden Sie die Anwendung zu viel Traktion auf die Nerven mit der Zange avulsing den Nerv aus dem Hirnstamm zu verhindern. Drückendie Stümpfe voneinander entfernt oder ausgeschnitten und ein Abschnitt des distalen Nerv zu entfernen, um sicherzustellen, dass keine Wiederverbindung auftreten kann. </li><li> Bei Durchführung einer Quetschverletzungen, verwenden Dumont # 5/45 Pinzette, um den Nerv für 30 Sekunden mit konstantem Druck, alle Axone trennen, wiederholen Sie diesen Andrang in einem zweiten Winkel senkrecht zur ersten Quetschstelle zu komprimieren. Vermeiden Sie die Anwendung unterschiedliche Mengen an Druck während der 30 Sekunden zu vernichten, da sonst die Verletzung inkonsistent zwischen den Tieren sein. </li></ol></li></ol> 4. Schließen und Wiederherstellung <ol><li> Positionieren Sie das Fett und die Muskeln in den darunterliegenden Strukturen. </li><li> Näherungsweise die Kanten des Einschnitts und schließen Sie die Wunde mit einem 7,5 mm Wundklammer. Nahtmaterial oder Klebstoff sind auch für den Wundverschluss akzeptabel. Postoperative Schmerz kann zu diesem Zeitpunkt zur Verfügung gestellt werden. </li><li> Entfernen Sie das Band von Ohr die Maus. Schalten Sie die Isofluran Fluss und damit die Maus, um reinen Sauerstoff für 30 Sekunden zu atmen, um 1 Min. PlAss der Maus in einem leeren Käfig ohne Einstreu aus der Narkose zu erholen. </li><li> Wenn die Maus wieder, verfolgen Sie sein Verhalten für bestätigende Anzeichen von Gesichtslähmung. Die Schnurrhaare werden gelähmt und abgewinkelt zurück in Richtung der Wange sein, wird die Nase abgewichen werden, und das Auge wird nicht als Reaktion auf einen Luftstoß blinken. </li><li> Haustieren gemeinsam nach der Operation, wenn sie weiblich sind. Vermeiden männlichen Mäusen gemeinsam, weil sie sind aggressiver und neigen dazu, Gewalt zu entfernen Wundklammern ihres cagemate, die Infektion führt. Bereitzustellen postoperativen Schmerz zu dieser Zeit, falls erforderlich. </li><li> Überwachen die Mäuse einmal am Tag über mehrere Tage nach der Operation, um sicherzustellen, dass keine Infektion oder andere Komplikation tritt postoperativ. Entfernen Wundklammern 7-10 Tage nach der Operation, wenn sie nicht auf eigene Faust zurückgegangen. </li><li> Bewerben Schmieraugensalbe in das betroffene Auge täglich Hornhautkomplikationen zu vermeiden, sei es, bis das Auge Blinkreflex ist neuabgedeckt oder bis Euthanasie. </li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Die vorgestellten Protokoll Erträge Basenpaar-Feindaten von Cytosin-Methylierung in biologisch relevanten genomischen Regionen. Das Protokoll geschrieben wird 50 ng des Ausgangsmaterials optimiert, kann es jedoch geeignet ist, einen Bereich von Eingangsmaterial (5 ng oder mehr) 26 handhaben. Dies wird Anpassungen einiger der Protokollschritte erforderlich, wie in Tabelle 6 zu sehen. Die ERRBS Bibliotheken zugänglich sind gepaart Ende Sequenzierung und weitere genomische Abdeckung kann auch durch Sequenzierung durchgeführt werden liest mehr als 51 Zyklen. Multiplex-Sequenzierung wird eine kostengünstigere Protokoll pro Probe anbieten, dies jedoch zu einer verringerten Verbrauch pro CpG-in den Daten (Abbildung 5 und Tabelle 8) vertreten führen und ausreichend Tiefe der Berichterstattung, um Analysen, die hohe Reichweite pro erfordern führen nicht nachgeben CpG-Stelle (zB durch Landan et al. 33 beschrieben). Schließlich dieses Protokoll (oder ein Bisulfit-basierten Protokolls inl) kann nicht zwischen Methyl-Cytosin und Hydroxymethyl-Cytosin 46,47 unterscheiden. Jedoch sind die erzeugten mit anderen Protokoll integriert werden Daten ergibt 48,49, um die verschiedenen Modifikationen zu beschreiben, und andere Modifikationen Cytosin kürzlich berichtet 50, sollten sie von Interesse sein. Hochwertige Bibliotheken wird angezeigt, wie in 3A-C gezeigt, und einmal für die Sequenzierung zusammengefasst ergibt sich eine Spur wie in 3G (rote Linie), die gleiche molare Beiträge von beiden Bankfraktionen gezeigt. Bibliothek Vorbereitung Ausfall kann von jedem Schritt während des Verfahrens führen. Wenn degradierte DNA verarbeitet sie in Bibliotheken, die nicht in MspI Fragmente in niedrigen CpG Berichterstattung über die in diesem Protokoll beschriebenen Sequenzierung Parameter angereichert sind und somit zur Folge haben. Wenn ein Enzym nicht-funktionell ist oder unbeabsichtigt von einer der Reaktionen auszuschließen, wird das Protokoll nicht zu den gewünschten Bibliothek. Wenn der Ligation reaRésol ineffizient sind Adapter in einer höheren Konzentration als erwartet, und / oder die Primer-Konzentration verwendet wird, eine begrenzende Reagenz für die Endverstärkung Schritten können Bibliotheksfehler auftreten. Überschüssiges Adaptern (als Peaks bei ~ 150 bp Bioanalyzer Ergebnissen gesehen; Figur 3D-F) in der Bibliothek werden auch mit Sequenzierung stören aufgrund des wahllosen Clustering von der Bibliothek und überschüssiges Adapter. Während eine solche Bibliothek kann offensichtlich normal Sequenz, einen signifikanten Teil der Leseoperationen lediglich Adaptersequenzen sein. Wenn überschüssige Adapter werden in einer Bibliothek zu beobachten, ist es am besten, wiederholen Sie die Bibliothek, wenn Vorbereitung Material ist mit optimalen Ausgangsmaterial, um Mengenverhältnisse Adapter. Schließlich, um eine effiziente PCR-Amplifikation der Bibliotheken zu gewährleisten, werden die niedrigeren und höheren Bankfraktionen als getrennte Proben der gesamten Bisulfitumwandlung und PCR Anreicherungsschritten aufrechterhalten. Andernfalls ergibt Differential Effizienz der Amplifikation in der PCR-Reaktion von höheren und niederen Fraktionen (wie in 3G-blaue Spur zu sehen) und das Potential für ungleiche Repräsentation der jeweiligen genomischen Loci in jeder Bibliothek Anteil während der Sequenzierung bedeckt. Der Benutzer kann entscheiden, eine quantitative PCR-Schritt unmittelbar nach der Bisulfit-Konvertierung für die weitere Titration optimale PCR-Zyklen notwendig, um verstärkt die Bibliotheken erzeugt sind. ERRBS Bibliothek Vorbereitung Protokoll hat mehrere Schritte, in denen spezifische Reagenzien empfohlen. Am Ende Reparaturschritt ermöglicht End-Reparatur aller Produkte der CG Überhang, wie die von MspI enzymatische Sterne-Aktivität und geschert DNA in der ursprünglichen DNA-Probe vorhandenen Fragmente ergibt, nicht enthalten, die Verwendung eines Vier-Nucleotid-dNTP-Mix. Dies führt zu einer verbesserten CpG Darstellung der Ergebnisse. An der Ligationsschritt ist es wichtig, eine hohe Konzentration Ligase (2.000.000 Einheiten / ml) und methylierten Adapter, um sicherzustellen, daß die Ligations Reactiauf effiziente und dass die Bisulfitumwandlung nicht den Adapter Voraussetzung für eine genaue Datenabgleich Sequenzen beeinflussen. Bei der PCR-Schritt unter Verwendung einer Polymerase zur Amplifikation Bisulphit-behandelten GC-reichen DNA-Fragmente ist für hohe Spezifität notwendig. Schließlich, um die Beseitigung von überschüssigem Adapter und Primer zu gewährleisten, SPRI Wulst Reinigung (zum Beispiel: Agen AMPure XP) wird vielmehr empfohlen, als Säule basierte Assays für Ligation und PCR Produkt Isolierungen. Um Daten hoher Qualität zu erzeugen, ist es wichtig, um eine effiziente Bisulfitumwandlung gewährleisten. Das vorgestellte Regel bietet dem Benutzer die Möglichkeit, Umwandlungseffizienz vor der Sequenzierung zu bestimmen. Als Alternative kann eine nicht-menschliche DNA wie Lambda DNA als eine interne Kontrolle (Spike-in) verwendet werden. Aufgrund der Unterschiede in der Art, kann diese Art einer Steuerung direkt in Downstream-Sequenzierung enthalten sein (zB wie beschrieben von Yu verwendet, et al. 34). Allerdings, wenn der Spike-in is verwendet wird, kann es nicht verwendet werden, um Umwandlungseffizienz vor der Bibliothek-Sequenzierung zu bestimmen, es sei denn eindeutig verstärkt und unabhängig sequenziert vor Bibliothek Sequenzierung werden. Die festgestellten Umrechnungskurse auf der Methylierungsstatus bei nicht-CpG Seiten. Dies ist möglicherweise nicht für die Verwendung im Zusammenhang mit Hoch Cytosinmethylierung in nicht-CpG-Kontext (zum Beispiel embryonale Stammzellen) und parallel Proben oder andere Mittel zur Bewertung der Umwandlungseffizienz kann für diesen Zweck verwendet werden, geeignet sein. Es gibt einige Einschränkungen an die Adresse, die einzigartig für die Sequenzierung ERRBS Bibliotheken sind. Die ersten drei Basen des Bankfraktionen sequenziert sind nahezu gleichförmig nicht-zufälligen aufgrund der MspI Erkennungsschnittstelle (C ^ CGG; siehe 4B, C). Daraus ergibt sich das Potenzial für erhebliche Datenverluste aufgrund von niedriger Qualität liest aus armen Cluster Lokalisierung trotz der offensichtlich hohen Clusterdichte während der Sequenzierung resultieren. Um dieses Hindernis zu überwinden,sind eine hohe Komplexität Bibliothek in einem unabhängigen Spur (PhiX Kontrolle oder andere Bibliothek Typ) als dedizierter Kontrollspur. Hohe Komplexität Bibliotheken haben Enden, die ein ausgewogenes Verhältnis von A, C, T und G in den ersten vier Basen sequenziert. Geeignete Kontrollspuren sind Bibliotheken wie RNA-seq, ChIP-seq, Sequenzierung ganzer Genome, oder eine Kontrolle durch die Sequenzierung Maschinenhersteller (zB PhiX Steuer v3) angeboten. Wenn sie als eine Kontrollspur für die jeweilige Sequenzierungslauf bezeichnet wird, kann es als Basis für die Matrix Generation, während der ersten vier Basen der Sequenzierung verwendet wird, um Clusteranordnungen detektieren dienen. Je höher die Qualität liest erfasst den mittleren Verbrauch pro CpG-durch zu erhöhen 5.2 (n = 4). Alternativ kann diese technische Schwierigkeit auch mit einem dunklen Sequenzierung Ansatz wie zuvor beschrieben 23 überwunden werden. Andere Sequenzierung Kriterien folgen Standard-Betriebsverfahren gemäß Herstellerprotokolle. Schließlich ist die Deckung pro CpG cHosen für die Datenanalyse wird durch den Benutzer und zum Teil von den biologischen Fragen von Interesse geführt werden. 10x Abdeckung Schwelle bietet eine hohe Abdeckungsanalyse Ansatz ist jedoch diese Schwelle gesenkt sollte, dass die von Interesse sein werden. Eine vollständige Diskussion von ERRBS Datenanalyse geht über den Rahmen dieses Artikels jedoch differentiell methylierte Cytosine und Regionen können mit Open Source Tools 31,51-53 bestimmt werden. Zusätzliche Analyse Überlegungen und Ansätze sind gut beschrieben worden, 54,55, und der Leser wird aufgefordert, die Literatur für die Werkzeuge am besten geeignet, um die geplante Analyse zu suchen. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Verfahren bietet ERRBS eine Vier-Tage-Protokoll, wenn wie beschrieben Erträge hohe Reproduzierbarkeit durchgeführt. Es hat sich im Vergleich zum Goldstandard Massarray EpiTYPER 26 validiert, ist kostengünstig für hohe Reichweite von Daten und ist für verschiedene Eingangsmaterial anpassbarMengen (günstig für klinische Probenverarbeitung und anderen Zelltypen der Niederfrequenz) und Sequenzierungsansätzen. Es bietet Basenpaar-Auflösung bei biologisch relevanten loci und können in integrativen-Analysen mit anderen Techniken Profilierung genomweiten Transkriptionsfaktor-Bindungs, Chromatin-Remodeling, epigenetische Markierungen und andere Cytosin Modifikationen von Interesse. ERRBS Daten Einsatz in solchen Studien können zu einem umfassenden molekularen Ansatz bei und ermöglichen eine hohe Dimensionsanalysen bei der Untersuchung von biologischen Modellen und Krankheit beim Menschen.

DNA Methylierung an Cytosin (5-Methylcytosin) eine epigenetische Filter kritisch in Säugerzellen für eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Prägen, X-Chromosom Inaktivierung, die Entwicklung und die Regulation der Genexpression 1-8 beschränkt. Die Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster in malignen und anderen Erkrankungen wurde krankheitsspezifische Muster bestimmt und dazu beigetragen, das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und potentielle Biomarker Entdeckungen 9-17. Es gibt viele Protokolle, die das Epigenom für DNA-Methylierungs-Status abfragen. Diese können in der Affinitäts-geteilt werden, Restriktionsenzymbasis und Bisulfitumwandlung basierten Assays, Mikroarray oder Sequenzierplattformen abwärts zu nutzen. Darüber hinaus gibt es einige Protokolle, die diese allgemeinen Kategorien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kombinierte Bisulfit Restriktionsanalyse 18 begrenzt und reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung (RRBS 19) zu überbrücken. </p&gt; RRBS wurde ursprünglich von Meissner et al. 19,20 beschrieben. Das Protokoll wurde ein Schritt zur GC-reiche genomischen Regionen, gefolgt von Bisulfit-Sequenzierung, die quantitativen Basenpaarauflösung Daten geführt, die kostengünstig ist 21,22 bereichern. Die GC-reiche Regionen werden durch das MspI (C ^ CGG) Restriktionsenzym gezielte und Cytosin Methylierung durch Bisulfit-Umwandlung von Cytosinen (Deaminierung von unmodifizierten Cytosine in Uracil), gefolgt von Polymerasekettenreaktion (PCR) gelöst. RRBS bedeckt den Großteil der Genpromotoren und CpG-Inseln in einem Bruchteil der für einen gesamten Genoms erforderliche Reihenfolge; jedoch RRBS nur eine begrenzte Verbreitung von CpG-Ufer und anderen intergenen Regionen biologische Relevanz. Mehrere Gruppen haben seit dem ursprünglichen Bericht, der von der Methode und der daraus resultierenden Abdeckung dieser genomischen Regionen 23-25 ​​verbessern veröffentlicht aktualisierte RRBS Protokolle. Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfite Sequflussen (ERRBS) umfasst Bibliothek Vorbereitung Änderungen und eine alternative Datenabgleich Ansatz 26 im Vergleich zu RRBS. ERRBS führte zu einer höheren Anzahl an CpGs in den erzeugten Daten dargestellt wird und eine erhöhte Abdeckung aller genomischen Regionen 26 abgefragt. Dieses Verfahren wurde verwendet, um DNA-Methylierungsmuster in menschlichen Patienten und anderen tierischen Proben 26-30 lösen. Die ERRBS Protokoll beschrieben Angebote Details über alle Schritte für den Abschluss und die Daten wurden unter Verwendung repräsentativer menschlicher DNA erzeugt benötigt (Proben wurden von zuvor berichteten deidentifizierte Patientenproben 31 erhalten und ein CD34 + Knochenmarksprobe von einem normalen menschlichen Spender). Das Protokoll umfasst eine automatische Größenauswahlprozesses, der die Bearbeitungszeit pro Probe reduziert und ermöglicht eine erhöhte Genauigkeit bei der Bibliotheksgrße Auswahl. Das Protokoll kombiniert eine Reihe etablierter molekularbiologischer Techniken. Hochmolekulare DNA wird w verdautit einem Methylierungsunempfindlichen Restriktionsenzym (MspI), gefolgt von End-Reparatur, A-Tailing, und Ligation von methylierter Adapter. Größe Auswahl der GC-reiche Fragmente durch Bisulfit-Konvertierung und PCR-Amplifikation vor der Sequenzierung gefolgt. Bisulfitumwandlung zuvor beschrieben 32 und detaillierte Überprüfung der Datenanalyse und Anwendungen würde den Rahmen dieses Artikels jedoch Empfehlungen und Referenzen sind für die Leser Einsatz enthalten gewesen. Das Protokoll kann über vier Tage durchgeführt werden und ist offen für kleine Eingangs (50 ng oder weniger) Materialmengen. Das Protokoll, wie beschrieben, liefert Ergebnisse mit hoher Deckkraft pro CpG-reichen nicht nur für Differenzmethylierungsstelle und der Region Bestimmungen, sondern auch für epigenetische Polymorphismus Erkennung durch Landan, et al. 33 beschrieben.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Reaktionspuffer für MspI Enzym; Protokollschritt 1.2</td></tr><tr><td>Phenollösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Äquilibriert mit 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0; siehe Sicherheits- und Handhabungshinweise bei http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>siehe Sicherheits- und Handhabungshinweise bei http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5,2</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Puffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Bereiten Sie eine 1 M, pH 8,5 Lösung</td></tr><tr><td>her Tris-Ethylendiamintetraessigsäure (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Verdünnen Sie auf 1x Pufferlösung gemäß den Empfehlungen</td></tr> <tr><td>des HerstellersT4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10-fache Konzentration</td></tr><tr><td>Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM pro Nukleotid</td></tr><tr><td>T4 DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I, großes (Klenow) Fragment</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>T4-Polynukleotidkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Wird für die Aufreinigung von DNA-Produkten im Protokollschritt 2.3</td></tr><tr><td>verwendet 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow-Fragment (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Wird für die Aufreinigung von DNA-Produkten im Protokollschritt 3.3</td></tr><tr><td>verwendet T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2.000.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>Methylierungsadapter Oligo Kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Schar</td><td>A63881</td><td>Wird in Protokollabschnitten verwendet, in denen die Aufreinigungsschritte für magnetische Beads implementiert werden (Schritte 4.3 und 8.2). Vor Gebrauch auf Raumtemperatur ausgleichen.</td></tr><tr><td>Pippin Prep Gel Kassetten, 2% Agarose, farbstofffrei</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>mit internen Standards</td></tr><tr><td>Zertifiziert Low Range Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromidlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA Leiter</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Farbstoff, Orange (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell&nbsp; Klinge&nbsp; Nr.&nbsp; 11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation</td><td>Kit Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Verwendet im Protokollschritt 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternative für Schritt 6.2</td></tr><tr><td>Universal Methylated Human DNA Standard</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>FastStart</td></tr><tr><td>High Fidelity PCR System Roche</td><td></td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Ein fluoreszenzbasierter DNA-Quantifizierungsassay, der in den Protokollschritten 1.1, 9.1 und 10.1 verwendet</td></tr> wird <tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Probenvorbereitung</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Barcode-Adapter für Multiplexing-Bibliotheken; Siehe Ergänzende Datei für das Multiplexing-Protokoll.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirbelmischer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trockenblockheizung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophoresesystem Elektrophorese-Stromversorgung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV- oder Blaulicht-Transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserte reduzierte darstellung bisulfit-sequenzierung für die bewertung der dna-methylierung bei basenpaar auflösung

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA-Methylierungsmuster Mapping ist stark in normalen und erkrankten Geweben untersucht. Eine Vielzahl von Methoden wurden etabliert, um die Cytosin-Methylierungsmustern in Zellen abzufragen. Reduzierte Darstellung des gesamten Genoms Bisulfit-Sequenzierung wurde entwickelt, um quantitative Basenpaar Auflösung Cytosin-Methylierungsmuster bei GC-reichen genomischen Loci zu erkennen. Dies wird durch die Kombination der Verwendung von einem Restriktionsenzym, gefolgt von Bisulfitumwandlung bewerkstelligt. Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung (ERRBS) erhöht die biologisch relevanten genomischen Loci bedeckt und wurde genutzt, um Cytosin-Methylierung in DNA aus Mensch, Maus und anderen Organismen zu profilieren. ERRBS initiiert mit dem Restriktionsenzym Verdauung von DNA, um niedermolekulare Bruchstücke für die Verwendung in der Bibliothek Vorbereitung erzeugen. Diese Fragmente werden zu Standardbibliothek Bau der nächsten Generation Sequenzierung unterzogen. Bisulfit-Umwandlung von nicht methylierten Cytosine vor der endgültigen amplificatiauf Schritt ermöglicht die quantitative Basisauflösung von Cytosin-Methylierung Niveaus in gedeckten genomischen Loci. Das Protokoll kann innerhalb von vier Tagen abgeschlossen sein. Trotz geringer Komplexität in den ersten drei Basen sequenziert, ERRBS Bibliotheken liefern hohe Datenqualität bei Verwendung eines vorgesehenen Ablaufsteuerung Spur. Mapping und Bioinformatik-Analyse wird dann durchgeführt und liefert Ergebnisse, die leicht mit einer Vielzahl von genomweite Plattformen integriert werden kann. ERRBS können kleine Mengen der Vorleistungsgüter nutzen, so dass es möglich ist, den menschlichen klinischen Proben und anwendbar in einer Reihe von Forschungsanwendungen verarbeiten. Das produzierte Video zeigt kritischen Schritte des ERRBS Protokoll.

Enhanced Reduced Representation Bisulfit Sequencing ist eine Methode zur Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken für die DNA-Methylierungsanalyse, die auf dem Verdau von Restriktionsenzymen in Kombination mit der Umwandlung von Cytosin-Bisulfit basiert. Dieses Protokoll erfordert 50 ng Ausgangsmaterial und liefert Daten zur Auflösung von Basenpaaren in GC-reichen genomischen Regionen.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung von Sequenzierungsbibliotheken für die Basenpaarauflösung D-N-A-C-P-G, Methylierungsanalyse basierend auf dem Verdau von Restriktionsenzymen in Kombination mit Cytosin durch Sulfitumwandlung. Dies wird erreicht, indem zunächst ein MSP-Verdau eines Restriktionsenzyms von hochwertiger DNA durchgeführt wird, gefolgt von einer Endreparatur, einem Tailing und einer Ligation von methylierten Adaptern. Der nächste Schritt besteht darin, die Sulfit-Umwandlung an ausgewählten Fragmenten durchzuführen, nachdem sie die Sulfit-Umwandlung durchgeführt haben.Die Fragmente werden mittels PCR amplifiziert. Der letzte Schritt ist die Durchführung der Qualitätskontrolle und Sequenzierung, gefolgt von der Datenvisualisierung und -analyse. Letztendlich detektiert die verbesserte reduzierte Repräsentation der Bi-Sulfit-Sequenzierung die quantitative Basenpaarauflösung von Cytidin-Methylierungsmustern an CG-reichen genomischen Loci.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen DNA-Methylierungsmethoden, wie z. B. Microarrays, besteht darin, dass sie kleine Eingangsmaterialmengen verwenden kann, um D-N-A-C-P-G-Methylierungsdaten mit hoher Abdeckung mit Basenpaarauflösung und biologisch relevanten Stellen zu erzeugen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir daran interessiert waren, epigenetische Muster jenseits von Regionen zu erforschen, die in traditionellen Assays abgedeckt werden. Wir waren daran interessiert, diese Technik zu entwickeln, um von Microarrays zur Generierung von DNA-Methylierungsdaten mit Basenpaarauflösung überzugehen, die mit Daten aus anderen Techniken der nächsten Generation integriert werden können.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten. Zum Beispiel epigenetische Musterbildung und Heterogenität in biologischen Proben im Vergleich zu normalen Kontrollen oder anderen Krankheitszuständen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Länge des Verfahrens, der zahlreichen spezifischen Anforderungen und der einzigartigen Sequenzierungseigenschaften der Bibliotheken, die den Mamie-Fall erzeugen, eine Herausforderung darstellen.Ein Forschungsspezialist in unserem Labor wird Ihnen bei der Demonstration des Verfahrens behilflich sein, um dieses Protokoll zu starten. Bereiten Sie zunächst gereinigte Aliquots von genomischen DNA-Proben vor, die einem MSP-Ein-Restriktionsenzymverdau, einer stumpfen Endreparaturreaktion und einer einzelnen Nukleotidzugabe an den drei Prime-Enden unterzogen wurden. Zu diesem Zeitpunkt sind die DNA-Produkte bereit für Adapterligationen, um mit dem Transfer von 10 Mikrolitern der A-A-L-D-N-A-Probe in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen zu beginnen und das Röhrchen auf Eis zu legen.Legen Sie zusätzlich ein Aliquot der Adaptermoleküle auf Eis. Bereiten Sie als Nächstes die Ligationsreagenzmischung auf Eis vor. Geben Sie sowohl das Ligationsreagenz als auch die Adaptermoleküle in die DNA-Probe und pipettieren Sie zum Mischen einige Male auf und ab.Legen Sie ein PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und lassen Sie die Ligationsreaktion am nächsten Tag über Nacht bei 16 Grad Celsius ablaufen. Reinigen Sie die Ligationsprodukte mit einem Festphasen-DNA-Extraktionskit auf Basis von Magnetbeads oder Siliziumdioxidsäulen. Im letzten Schritt des Reinigungsprozesses.Eluieren Sie die DNA, indem Sie 30 Mikroliter DNA-freies Wasser hinzufügen. Das aufgereinigte DNA-Produkt kann bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, bis es für Proben benötigt wird, die mit einer Gesamt-DNA von 25 Nanogramm oder mehr begonnen haben. Verwenden Sie ein automatisiertes Gelextraktionsgerät wie das PI and Prep, um nach ligierten Produkten mit Längen zwischen 150 Basenpaaren und 400 Basenpaaren zu selektieren.Achten Sie darauf, DNA-Visualisierungsfarbstoffe wie Ethereum, Bromid oder Cyber Green von der Agros-Kassette auszuschließen, da sie die DNA-Migrationseigenschaften der gegabelten adaptergebundenen Fragmente verändern können. Für diesen Schritt des Protokolls können auch Standardprotokolle zur Größenauswahl auf Basis von Agros-Gel verwendet werden, um die DNA-Elektrophorese auf einer pippin 2%-farbstofffreien Arous-Kassette einzurichten. Erstellen Sie ein neues Protokoll in der Pippin Prep-Konsole und wählen Sie die Option 2%DF Marker L als Kassette Ihrer Wahl aus.Aktivieren Sie dann die Option Interne Standards verwenden, und stellen Sie sicher, dass die Referenzspurnummer mit den Spurnummern für die Isolierung von DNA-Fragmenten im Bereich von 150 Basenpaaren bis 400 Basenpaaren übereinstimmt. Wählen Sie die Option "Bereich" als Entnahmemodus und geben Sie die folgenden Grenzwerte ein: 135 für den Start des Basispaars, 410 für das Ende des Basispaars und 240 für das Basispaar Pfoten. Dies weist die Vorrichtung an, das elektrophoretische Feld auf den Elektroelutionsausgang auszurichten.Wenn DNA-Fragmente innerhalb dieses Bereichs in der Nähe des Auslasses unterwegs sind. Bereiten Sie nach dem Speichern der Protokolldatei die Gelkassette und die Probenladevertiefungen des Instruments vor, indem Sie die Standardarbeitsanweisungen von Pippen Prep bei der Einrichtung des Instruments befolgen. Bereiten Sie die DNA-Proben für die Elektrophorese vor, indem Sie 10 Mikroliter des DNA-Markers zu einem 30-Mikroliter-Aliquot einer bestimmten Post-Ligationsprobe hinzufügen, um die Mischungen auf die Gelkassette zu laden.Entfernen Sie zunächst 40 Mikroliter des Elektrophoresepuffers aus jeder Probe. Ersetzen Sie dann das Volumen, indem Sie jeweils 40 Mikroliter Probenmarkermischung in einzelne Vertiefungen pipettieren. Kehren Sie zur Konsole zurück, laden Sie das gespeicherte Protokoll und drücken Sie Start, um die Elektrophorese zu starten.Wenn das Programm das Basenpaar 240 erreicht, werden im Pausenschritt manuell 40 Mikroliter des Ausgangs mit einer Pipette von jedem Ausgangsanschluss gesammelt. Beschriften Sie diese Brüche als untere Bibliotheksfraktion. Nach dem Sammeln der unteren Bibliotheksfraktionen werden die Auslassöffnungen sofort mit 40 Mikrolitern frischem Elektrophoresepuffer gewaschen.Pipettieren Sie den Puffer mindestens dreimal auf und ab und saugen Sie dann das Netz an. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal, um alle Spuren von kurzen DNA-Spezies aus den Auslässen zu entfernen. Geben Sie nun 40 Mikroliter Elektrophoresepuffer in die Probe.Versiegeln Sie die elucianischen Ports und drücken Sie die Run-Taste, um den elucianischen Prozess fortzusetzen. Nach Abschluss des Ellucian-Programms bei der Einstellung 410 Basenpaar sammeln Sie die 40 Mikroliter Inuit aus allen Auslassöffnungen und beschriften diese Fraktionen als obere Bibliotheksfraktion. Zu diesem Zeitpunkt sind beide Bibliotheksfraktionen gelgereinigt und bereits für die Bi-Sulfit-Umwandlung geeignet.Führen Sie mit einem im Handel erhältlichen Kit den Bi-Sulfit-Umwandlungsassay für beide Bibliotheksfraktionen durch. Im letzten Schritt des Umwandlungsprozesses eluieren Sie die DNA-Proben in 40 Mikrolitern freiem DNA-Wasser. Nach der Bi-Sulfit-Umwandlung werden die resultierenden DNA-Bibliotheksfragmente einer Anreicherungs-PCR-Amplifikation unterzogen, bei der Primer verwendet werden, die an den Adapterenden jedes DNA-Moleküls hybridisieren.Um sich auf die Anreicherungs-PCR vorzubereiten, fügen Sie zunächst 160 Mikroliter des PCR-Mastermixes zu jedem 40-Mikroliter-Aliquot einer durch Sulfid umgewandelten Probe hinzu. Teilen Sie dann die resultierende 200-Mikroliter-Mischung in vier 50-Mikroliter-Aliquots auf. In separaten PCR-Röhrchen.Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler und amplifizieren Sie das umgewandelte DNA-Template. Nach der Anreicherung ziehen Sie die vier Post-PCR-Produkte in ein einziges 1,5-Milliliter-Röhrchen und reinigen Sie die DNA mit einem kommerziellen PCR-Cleanup-Kit. Wenn ein Festphasen-Extraktionskit mit magnetischen Beads zur Aufreinigung der PCR-Produkte verwendet wird, ändern Sie die Standardverfahren, indem Sie zuerst die kombinierten PCR-Produkte der unteren Bibliothek mit dem 1,7-fachen ihres Gesamtvolumens in den Beads mischen.Mischen Sie dann die kombinierten PCR-Produkte der oberen Bibliothek mit dem 1,1-fachen ihres Gesamtvolumens in Kügelchen. Befolgen Sie dann das Protokoll des Herstellers bis zu den 70%igen Ethanol-Waschschritten, bei denen jedes der Waschvolumen im letzten Schritt des Reinigungsprozesses auf 800 Mikroliter geändert werden sollte. Eluieren Sie die DNA mit 50 Mikrolitern DNA-freiem Elutionspuffer.Lagern Sie die gereinigten Bibliotheken bei minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt werden, und quantifizieren Sie mit einem fluoreszenzbasierten Assay, der für doppelsträngige DNA selektiv ist, die Menge des DNA-Gehalts nach der Anreicherung für jede Bibliotheksfraktion. Beurteilen Sie außerdem die Größe und Qualität der Bibliothek nach der Anreicherung mit einem Bioanalysator. Berechnen Sie die effektive DNA-Molarität einer bestimmten Bibliotheksfraktion, indem Sie die durchschnittliche DNA-Länge verwenden, die in Basenpaaren ausgedrückt wird.Sobald die Molarität bekannt ist, verwenden Sie das freie Wasser der DNA, um jede entsprechende obere und untere Bibliotheksfraktion auf zwei nanomolare Endkonzentrationen zu verdünnen. Kombinieren Sie die unteren und oberen Bibliothekspaare in einem einzigen Röhrchen, um eine Mischung aus zwei nanomolaren Lochbibliotheken mit jeweils 20 Mikrolitern zu erhalten. Die gepoolte Probe ist nun bereit für einen Sequenzierungslauf.Bei sequenzierungsbezogenen Assays, einschließlich E-R-R-B-S, sind die Qualität und Größenverteilung der Moleküle der oberen und unteren Bibliothek Schlüsselfaktoren für die Bestimmung der Qualität der endgültigen Sequenzierungsdaten. Im Vergleich zu herkömmlichen manuellen Gelextraktionsprotokollen erzeugt das automatisierte Gelextraktionsgerät, das im E-R-R-B-S-Protokoll verwendet wird, eine konsistente Größenverteilung und minimiert das Potenzial für eine Kontamination der Proben über die Proben hinweg. Als nächstes zeigen die Rohdaten aller DNA-Stränge nach dem Senden der in die BIS-Sulfit-Bibliothek umgewandelten Bibliotheksmoleküle zur Sequenzierung, dass für jeden gegebenen Strang die Datenqualität für jede Nukleotidposition direkt nach den ersten drei Nukleotiden dramatisch zunimmt.Da die Konsensussequenz für diese drei Nukleotide für die überwiegende Mehrheit der Bibliotheksmoleküle mit CGG gesetzt ist, deuten die Daten darauf hin, dass das E-R-R-B-S-Protokoll eine Bibliothekssammlung hervorgebracht hat, die einen wünschenswerten Satz genomischer Fragmente enthält, die überwiegend flankiert sind. Mit MSP endet ein Restriktionsdigest aus der Vogelperspektive. Das E-R-R-B-S-Protokoll kann Daten zur Basenpaarauflösung von Cytidin-Methylierungsstellen über das gesamte Genom liefern.Hier ist zum Beispiel Chromosom 12 zu sehen. Das Protokoll deckt eine reduzierte Repräsentation genomweiter CPGs ab. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man E-R-R-B-S-Bibliotheken für die Generierung von D-N-A-C-P-G-Methylierungsdaten mit Basenauflösung vorbereitet. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, mit qualitativ hochwertiger DNA zu beginnen, alle beschriebenen Schritte einzubeziehen, die Effizienz der Bisulfatumwandlung und -sequenzierung anhand der empfohlenen Parameter zu validieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenyl und Chloroform äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer die üblichen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten in einer Chemikalienhaube und die ordnungsgemäße Abfallentsorgung.Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden wie Spyro-Sequenzierung oder Massenarray-Epityp können durchgeführt werden, um die Ergebnisse zu validieren. Darüber hinaus kann ein Genexpressionsprofiling durchgeführt werden, um die biologische Bedeutung der detektierten DNA-Methylierungsmuster zu bestimmen.Die Fähigkeit, DNA- und Methylierungsmuster mit Basenpaarauflösung aus begrenzten Mengen an Einsatzmaterialien zu generieren, hat die Erstellung von Profilen seltener Zellpopulationen ermöglicht, die bisher nicht möglich war. Es hat auch die Erstellung von Profilen großer Kohorten klinischer Stichproben für die Erforschung der epigenetischen vermittelten Regulation und Heterogenität von Krankheiten ermöglicht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

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Bisulfit-Umwandlung genomischer DNA: Eine Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung in genomischen DNA-Proben aus gastrointestinalem Krebsgewebe

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Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

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