Clock Scan Protocol für Bildanalyse: ImageJ Plugins

Das übergeordnete Ziel dieser Clock-Scan-Protokolle ist es, die schnelle Charakterisierung der durchschnittlichen Pixelintensität innerhalb, entlang der Grenze und/oder außerhalb ausgewählter interessierender Bereiche zu ermöglichen. Diese Methode kann dabei helfen, wichtige Fragen zu beantworten und Bildanalysten etwas über die durchschnittliche Pixelintensität in bestimmten Interessenbereichen zu vermitteln. Die Hauptvorteile der Clock-Scan-Technik bestehen darin, dass sie zur schnellen Charakterisierung der durchschnittlichen Pixelintensität aus dem Orbit in einzelnen oder mehreren interessierenden Bereichen verwendet werden kann.

Wählen Sie für die standardmäßige Clock-Scan-Analyse im Menü Datei im entsprechenden ImageJ-Programm die Option Öffnen, um eine Bilddatei von Interesse zu öffnen. Hier wird zum Beispiel ein Gewebeschnitt mit Neuronen analysiert, die für ein Protein von Interesse markiert sind. Wählen Sie ein geeignetes Zeichenwerkzeug aus, und skizzieren Sie den Interessenbereich.

Wählen Sie Plugins und Clock Scan aus dem Menü Datei, um das Popup-Optionsfenster des Standard-Clock-Scan-Protokolls zu öffnen. Das Fenster des Managers für den Interessenbereich, in dem die Gliederung automatisch hinzugefügt wird, wird ebenfalls geöffnet. Verwenden Sie im Plugin-Optionsfenster die Bildlaufleisten, um die X- und Y-Koordinaten in der Mitte des Interessenbereichs nach Bedarf zu ändern.

Je nachdem, wie viel des Hintergrundbereichs außerhalb des Objekts durch den Scanvorgang abgedeckt werden soll, verwenden Sie die Bildlaufleiste für die Scanbegrenzung, um die Scangrenzen anzupassen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für den tatsächlichen Radius, den Hintergrund subtrahieren, die Polartransformation und/oder das Plotten mit Standardabweichung, je nach experimenteller Eignung. Klicken Sie dann auf OK, um das Plugin auszuführen.

Sobald die Analyse abgeschlossen ist, verwenden Sie den Befehl list, um auf die numerischen Daten für die weitere Analyse zuzugreifen. Für die Clock-Scan-Analyse mehrerer Regionen öffnen Sie eine Bilddatei, die mehrere interessante Bereiche enthält. Hier wird beispielsweise ein Panel von Frames analysiert, die innerhalb desselben Gewebeschnitts aufgenommen wurden, wie gerade gezeigt.

Klicken Sie auf Analysieren, dann auf Extras und dann auf Manager für Interessenregionen, und verwenden Sie das entsprechende Zeichenwerkzeug, um die einzelnen Interessenbereiche zu umreißen. Das Werkzeug "Segmentierte Linie" eignet sich zum Auswählen asymmetrischer Interessenbereiche und zum Ausschließen von Hintergrundbeschriftungen. Klicken Sie im Fenster "Manager für Interessenregion" auf Hinzufügen, um jede Region von Interesse dem Manager hinzuzufügen, sobald sie ausgewählt ist.

Wählen Sie im Menü Plugins die Option Multi Clock Scan, um das Popup-Fenster für die Protokolloptionen zu öffnen und das Scan-Limit bei Bedarf zurückzusetzen. Überprüfen Sie das Diagramm mit Standardabweichung und/oder subtrahieren Sie die Hintergrundfelder, je nachdem, was experimentell angemessen ist. Klicken Sie dann auf OK, um das Protokoll auszuführen, das zwei Ausgabediagrammfenster generiert.

Öffnen Sie für die Clock-Scan-Analyse eines Bildstapels einen Bildstapel von Interesse. Hier wird ein Bildstapel eines isolierten Spinalganglion analysiert, markiert mit einer kalziumsensitiven Fluoreszenz, die vor und nach intrazellulärer Elektrodenstimulation aufgenommen wurde. Umreißen Sie den interessierenden Bereich innerhalb des Bildstapels.

Fügen Sie den ausgewählten Bildstapel dem Region-of-Interest-Manager hinzu, wie gerade gezeigt, und wählen Sie Multi Clock Scan aus, um das Popup-Fenster mit den Protokolloptionen zu öffnen. Setzen Sie das Scan-Limit bei Bedarf zurück und überprüfen Sie das Diagramm mit Standardabweichung und/oder subtrahieren Sie die Hintergrundfelder, je nach experimenteller Eignung. Klicken Sie dann auf OK, um das Protokoll auszuführen und zwei Ausgabediagrammfenster zu generieren.

In dieser repräsentativen Analyse eines Gewebeschnitts von fluoreszenzmarkierten Neuronen wurde ein interessierender Bereich durch das helle Signal für das interessierende Protein gezeichnet, und eine Standard-Clock-Scan-Analyse wurde durchgeführt, um radiale Pixelintensitätsscans von der Mitte des interessierenden Bereichs bis zur skizzierten Scan-Grenze zu sammeln. Die radialen Scans wurden auf den Region-of-Interest-Radius in Richtung des Scans normiert. Ein Mittelwert, um ein integrales Radiopixel-Intensitätsprofil zu erstellen, das zeigt, dass der größte Teil des interessierenden Proteins an der Plasmamembran der Zelle gemessen wurde.

Da für diese Analyse ein Diagramm mit Standardabweichung ausgewählt wurde, zeigten die vertikalen Standardabweichungslinien die Pixelintensitäten zwischen den einzelnen radialen Scan-Profilen in einem bestimmten Abstand vom Scan-Ursprung an. In dieser Analyse wurden, wie gerade gezeigt, mehrere interessante Regionen innerhalb der Neuronengewebeprobe gescannt, wodurch ein integrales Pixelintensitätsprofil für jedes gescannte Objekt in der Sequenz generiert wurde, in der es dem Region-of-Interest-Manager hinzugefügt wurde. Außerdem ein durchschnittliches Pixelintensitätsprofil für jeden ausgewählten Interessenbereich.

Diese Standardabweichungsbalken stellen daher die Variabilität zwischen integralen Scans einzelner Objekte und nicht zwischen einzelnen radialen Scans dar. In dieser Arbeit wurde eine Bildstapelanalyse eines isolierten Neurons des dorsalen Wurzelgangliens durchgeführt, das zu verschiedenen Zeitpunkten, vor und nach der Stimulation, mittels intrazellulärer Elektrode eingefangen wurde. Am Ende der Analyse wurden ein integrales Pixelintensitätsprofil der einzelnen Instanzen des Objekts von Interesse auf verschiedenen Bildern innerhalb des Stapels und ein durchschnittliches Pixelintensitätsprofil für alle Instanzen des Objekts angezeigt.

Darüber hinaus zeigt die Standardabweichungsanalyse eines von der Uhr gescannten Bildstapels die Datenvariabilität zwischen den integralen Scans im gesamten Bildstapel. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Pixelintensitäten mit Clock-Scan-Plugins messen können. Unser Ziel bei der Entwicklung dieser Plugins war es, diese Art der Bildanalyse für jeden Untersucher frei verfügbar zu machen.

Wir glauben, dass das Clock-Scan-Protokoll für viele Forschungsbereiche verwendet werden wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf biologische, chemische und physikalische Bildgebungsanwendungen. Während wir diese Clock-Scan-Plugins weiterentwickeln und betreiben, freuen wir uns über jedes Feedback und jeden Vorschlag von interessierten Parteien, wie diese Tools verbessert werden können.