Clock Scan Protocol für Bildanalyse: ImageJ Plugins

Das übergeordnete Ziel dieser Clock-Scan-Protokolle besteht darin, die schnelle Charakterisierung der durchschnittlichen Pixelintensität innerhalb, entlang der Grenze von und/oder außerhalb ausgewählter Regionen von Interesse zu ermöglichen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zu beantworten und Bildanalysten hinsichtlich der durchschnittlichen Pixelintensität in bestimmten Regionen von Interesse zu unterrichten. Die wesentlichen Vorteile der Clock-Scan-Technik liegen darin, dass sie zur schnellen Charakterisierung der durchschnittlichen Pixelintensität aus der Umlaufbahn in einzelnen oder mehreren Regionen von Interesse genutzt werden kann.

Für die Standard-Clock-Scan-Analyse wählen Sie im Menü „Datei“ des entsprechenden ImageJ-Programms „Öffnen“, um eine Bilddatei von Interesse zu öffnen. Beispielsweise wird hier ein Gewebeschnitt mit Neuronen, die für ein Protein von Interesse markiert sind, analysiert. Wählen Sie ein geeignetes Zeichentool und umranden Sie den Bereich von Interesse.

Wählen Sie im Menü „Datei“ die Option „Plugins“ und „Clock Scan“, um das Standard-Clock-Scan-Protokoll und das Popup-Optionsfenster zu öffnen. Gleichzeitig wird das Fenster des Interessenbereich-Managers mit automatisch hinzugefügtem Umriss geöffnet. Ändern Sie im Plugin-Optionsfenster mithilfe der Bildlaufleisten die x- und y-Koordinaten für die Mitte des Interessenbereichs, wie erforderlich.

Je nachdem, wie viel des Hintergrundbereichs außerhalb des Objekts durch den Scan erfasst werden soll, verwenden Sie die Bildlaufleiste für die Scan-Grenzen, um diese anzupassen. Wählen Sie die Kontrollkästchen für echten Radius, Hintergrundabzug, polare Transformation und/oder Darstellung mit Standardabweichung entsprechend den experimentellen Anforderungen aus. Klicken Sie anschließend auf OK, um das Plugin auszuführen.

Sobald die Analyse abgeschlossen ist, verwenden Sie den Befehl „list“, um auf die numerischen Daten für eine weitere Analyse zuzugreifen. Für die Clock-Scan-Analyse mehrerer Bereiche öffnen Sie eine Bilddatei, die mehrere interessierende Bereiche enthält. Hier wird beispielsweise ein Panel von Einzelbildern, die innerhalb desselben Gewebeschnitts aufgenommen wurden, wie gerade gezeigt, analysiert.

Klicken Sie auf Analysieren, dann auf Werkzeuge und anschließend auf „Region of Interest Manager“ und verwenden Sie das geeignete Zeichenwerkzeug, um jede Region von Interesse zu umreißen. Das Werkzeug für segmentierte Linien eignet sich gut zur Auswahl asymmetrischer Regionen von Interesse und zum Ausschließen von Hintergrundmarkierungen. Klicken Sie im Fenster „Region of Interest Manager“ auf Hinzufügen, um jede ausgewählte Region von Interesse dem Manager hinzuzufügen.

Wählen Sie im Menü „Plugins“ die Option „Multi Clock Scan“, um das Popup-Fenster mit den Protokolloptionen zu öffnen, und setzen Sie gegebenenfalls die Scan-Grenze zurück. Überprüfen Sie die Darstellung mit Standardabweichung und/oder aktivieren Sie die Option zum Subtrahieren des Hintergrunds, je nach experimentellen Anforderungen. Klicken Sie anschließend auf „OK“, um das Protokoll auszuführen, wodurch zwei Ausgabediagramm-Fenster generiert werden.

Für die Clock-Scan-Analyse eines Bildstapels öffnen Sie einen entsprechenden Bildstapel. Hier wird ein Bildstapel eines isolierten Rückwurzelganglions analysiert, das mit einem kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert und vor und nach einer intrazellulären Elektrodenstimulation abgebildet wurde. Begrenzen Sie den interessierenden Bereich innerhalb des Bildstapels.

Fügen Sie den ausgewählten Bildstapel dem Bereichs-Manager hinzu, wie gerade gezeigt, und wählen Sie Mehrfach-Uhr-Scan, um das Fenster mit den Protokolloptionen zu öffnen. Setzen Sie das Scan-Limit bei Bedarf zurück und aktivieren Sie die Option zur Darstellung mit Standardabweichung und/oder zum Subtrahieren von Hintergrundfeldern, je nach experimentellen Anforderungen. Klicken Sie anschließend auf OK, um das Protokoll auszuführen, wodurch zwei Ausgabediagramm-Fenster generiert werden.

Bei dieser repräsentativen Analyse eines Gewebeschnitts fluoreszenzmarkierter Neuronen wurde ein Bereich von Interesse durch das helle Signal für das Protein von Interesse gezeichnet, und eine Standard-Clock-Scan-Analyse durchgeführt, um radiale Pixelintensitätsmessungen vom Zentrum des Bereichs von Interesse bis zur markierten Scan-Grenze zu erfassen. Die radialen Scans wurden auf den Radius des Bereichs von Interesse in der Richtung des Scans normalisiert. Ein Durchschnitt wurde gebildet, um ein integrales radiales Pixelintensitätsprofil zu erzeugen, das zeigt, dass der größte Teil des Proteins von Interesse an der Plasmamembran der Zelle nachgewiesen wurde.

Da für diese Analyse ein Diagramm mit Standardabweichung gewählt wurde, zeigen die vertikalen Linien der Standardabweichung die Unterschiede zwischen den Pixelintensitäten der einzelnen radialen Scanprofile in einem bestimmten Abstand vom Scanursprung an. In dieser Analyse wurden mehrere Regionen von Interesse innerhalb der Neuronengewebeprobe gescannt, wie gerade gezeigt wurde, wodurch für jedes gescannte Objekt ein integriertes Pixelintensitätsprofil in der Reihenfolge erzeugt wurde, in der es dem Manager für Regionen von Interesse hinzugefügt wurde. Außerdem wurde ein durchschnittliches Pixelintensitätsprofil für jede ausgewählte Region von Interesse erstellt.

Diese Standardabweichungs­balken stellen daher die Variabilität zwischen integralen Scans einzelner Objekte und nicht zwischen einzelnen radialen Scans dar. Hier wurde eine Analyse eines Bildstapels eines isolierten Neurons des Rückenmarks­ganglions zu verschiedenen Zeitpunkten, vor und nach Stimulation mittels intrazellulärer Elektrode, durchgeführt. Am Ende der Analyse wurden ein integrales Pixelintensitätsprofil der einzelnen Instanzen des Objekts von Interesse auf verschiedenen Bildern innerhalb des Stapels sowie ein durchschnittliches Pixelintensitätsprofil für alle Instanzen des Objekts dargestellt.

Außerdem zeigt die Standardabweichungsanalyse eines mit Clock-Scan aufgenommenen Bildstapels die Datenvariabilität zwischen den einzelnen Scans über den gesamten Bildstapel hinweg. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Pixelintensitäten mithilfe von Clock-Scan-Plugins gemessen werden. Unser Ziel bei der Entwicklung dieser Plugins war es, diese Art der Bildanalyse für jeden Forscher frei zugänglich zu machen.

Wir sind der Ansicht, dass das Clock-Scan-Protokoll für zahlreiche Forschungsbereiche genutzt werden wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, biologische, chemische und physikalische Bildgebungsanwendungen. Während wir diese Clock-Scan-Plugins weiterentwickeln und betreiben, sind wir für jedes Feedback und alle Vorschläge interessierter Parteien zur Verbesserung dieser Werkzeuge dankbar.