Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

El objetivo general de este examen ecocardiográfico, combinado con investigaciones histológicas, es examinar la función cardíaca y la morfología en diferentes modelos de ratones transgénicos en condiciones basales y fisiopatológicas. Para empezar, mientras sostienes ligeramente a un ratón por la cola, usa una balanza de laboratorio estándar para determinar el peso corporal del animal. Después de anestesiar el ratón de acuerdo con el protocolo de texto, apriete ligeramente un pie trasero y observe si la pata se retrae.

Use una afeitadora comercial para roedores para afeitar el lado izquierdo del tórax y la axila izquierda. Coloque al animal en una almohadilla caliente colocada a 40 a 42 grados centígrados en una posición poco profunda del lado izquierdo, con la cabeza a las 12 en punto y la cola a las 6 en punto. Luego use cinta adhesiva para fijar el brazo izquierdo, la pierna izquierda y la cola.

Aplique gel de ecocardiografía precalentado sobre el tórax afeitado y la cabeza del transductor. A continuación, coloque el transductor del ecocardiógrafo paraesternal izquierdo, dirigiéndolo hacia el lado derecho del cuello para obtener una vista bidimensional de acceso largo paraesternal a nivel del músculo papilar. A continuación, gire el transductor 90 grados en el sentido de las agujas del reloj para obtener una vista de acceso corta.

Establezca un ajuste de profundidad mínimo y un zoom para maximizar la calidad de la imagen y la velocidad de fotogramas. Ajuste la velocidad de barrido al máximo. Grabe imágenes guiadas en 2D en modo M en una vista de acceso corto.

Registre al menos tres series de tres semibucles de latidos cardíacos para cada animal. Después de obtener grabaciones exitosas, retire la cinta de las extremidades y la cola. Limpie el gel de ecocardiograma de la almohadilla térmica y el transductor del tórax del ratón.

Deje al ratón bajo observación en la almohadilla térmica, cubierto con un pañuelo de papel para evitar la exposición innecesaria a la luz y la pérdida de calor hasta que se despierte. Luego vuelva a colocar al animal en la jaula. Analice las imágenes grabadas en modo M desde una vista de acceso corto para determinar las dimensiones y la función del ventrículo izquierdo o del ventrículo izquierdo.

Utilizando la identificación de la interfaz sanguínea tisular en las imágenes almacenadas, mida el grosor de la pared anterior del VI en sístole y diástole, los diámetros telesistólico y diastólico internos del VI y el grosor de la pared posterior del VI en sístole y diástole. Mida las dimensiones diastólicas en el momento de las dimensiones diastólicas máximas aparentes del VI y las dimensiones telesistólicas del VI al final de la excursión sistólica más anterior de la pared posterior del VI. Toque la pantalla táctil en el icono de análisis y, a continuación, en el icono de LVAWd.

Coloque el calibrador electrónico en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior del VI en diástole. A continuación, coloque el calibrador electrónico en la interfaz entre la pared anterior del VI y la cavidad del VI para obtener el grosor de la pared anterior diastólica del VI. Coloque la pinza en la interfaz entre la cavidad del VI y la pared posterior del VI para obtener el diámetro interno y diastólico del VI.

Coloque el calibrador en la interfaz entre la pared posterior del VI y el pericardio para obtener el grosor de la pared posterior diastólica del VI. Para las dimensiones sistólicas del VI, toque la pantalla táctil en el icono de las AVVI y coloque el calibrador electrónico en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior del VI en sístole. Coloque el calibrador electrónico en la interfaz entre la pared anterior del VI y la cavidad del VI para obtener el grosor de la pared anterior sistólica del VI.

Coloque la pinza en la interfaz entre la cavidad del VI y la pared posterior del VI para obtener el diámetro interno y sistólico del VI. Coloque el calibrador en la interfaz entre la pared posterior del VI y el pericardio para obtener el grosor de la pared posterior sistólica del VI. Después de sacrificar a los animales de acuerdo con el protocolo de texto, mida su peso corporal.

A continuación, utilice un hisopo con alcohol al 70% para desinfectar el tórax y el abdomen. Realizar una incisión transversal en la piel, un centímetro distal al esternón. Luego, con pinzas romas, retire la piel del tórax moviéndola en dirección a la cabeza.

Con pinzas finas, sostenga el esternón ligeramente y abra el diafragma insertando el extremo romo de unas tijeras finas. Corta la caja torácica por ambos lados paralelos al esternón. A continuación, mueva el esternón en dirección a la cabeza.

Localiza el corazón en el tórax. Con pinzas finas, sostenga el tronco vascular del corazón y use tijeras finas para cortar por debajo del órgano. A continuación, mida el peso del corazón y establezca una relación entre el corazón y el peso corporal.

Transfiera el corazón a dos mililitros de solución de formalina tamponada neutra al 10% en un tubo de 15 mililitros y fije el órgano a cuatro grados centígrados durante la noche. Para realizar la tinción con aglutinina de germen de trigo o WGA, coloque los portaobjetos previamente preparados en WGA conjugado con tetrametilrodamina e incube las muestras a temperatura ambiente en una cámara húmeda durante sesenta minutos. Use PBS para lavar las muestras tres veces durante cinco minutos cada una.

A continuación, utilice el medio de montaje de fluorescencia que contiene DAPI para montar las secciones. Guárdelos a cuatro grados centígrados en la oscuridad antes de analizarlos. Estos registros ecocardiográficos representativos demuestran la utilidad de la ecocardiografía para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente.

La diferencia entre un ratón con una función cardíaca normal y un animal con un ventrículo izquierdo dilatado o VI y una función LV reducida se puede identificar fácilmente. Aquí se muestra una comparación de las mediciones del diámetro de los cardiomiocitos en animales sin hipertrofia cardíaca y con hipertrofia cardíaca utilizando secciones de corazón de parafina teñidas con H&E y mediciones de secciones longitudinales de tejido cardíaco. Esta figura ilustra la medición de los diámetros transversales de los cardiomiocitos utilizando secciones de parafina teñidas con WGA de corazones de ratones control y animales con hipertrofia cardíaca.

Estos paneles muestran la utilidad de la inmunohistoquímica PECAM1 de secciones cardíacas para determinar la densidad de vasos del tejido cardíaco normal y los corazones con angiogénesis aumentada.