Name: Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprende análisis histológico cualitativo y cuantitativo de tejido cardíaco en embriones de ratón para estudiar defectos cardíacos congénitos. Este protocolo estandarizado mejora diagnósticos en cardiología.

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El Laboratorio Aguirre es apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio K01HL135464 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342.

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Los autores no tienen revelaciones que reportar.

Este protocolo explora las técnicas involucradas en el análisis del desarrollo cardíaco en corazones embrionarios. Algunas limitaciones de este método son la destreza física requerida para las técnicas preparatorias, que pueden requerir práctica, y habilidad con imágenes de microscopio. Si las rodajas obtenidas en el criostato son desordenadas, la tinción de hematoxilina y eosina no será clara, o si las imágenes tomadas en el microscopio tienen mala iluminación, entonces el método utilizado con ImageJ no funcionará. Una ...

Las CHD son el tipo más común de defecto de nacimiento en humanos y son la principal causa de muertes relacionadas con defectos de nacimiento1,2,3,4,5,6. Aunque alrededor del 90% de los niños recién nacidos sobreviven a la enfermedad coronaria, con frecuencia se asocia con una morbilidad significativa e intervenciones médicas a lo largo de los años, imponiendo una pesada carga sobre la vida de los pacientes y el sistema de salud7,8,9,10. Fuera de los factores puramente genéticos, las causas de la ENFERMEDAD se entienden mal4. Las causas no identificadas representan el 56-66% de todos los casos de CHD según la Asociación Americana del Corazón y otras fuentes2,3,4,11. Los factores bien conocidos incluyen mutaciones genéticas, CNVs, variantes de nucleótidos individuales de novo y aneuploidía. Se sospecha que los factores ambientales y dietéticos son también fuentes importantes que contribuyen a la enfermedad de Son obligatorias, como sugieren los estudios epidemiológicos que vinculan el estilo de vida materno2,12,la privación económica y la carrera13,y mediante la investigación en factores dietéticos como el ácido fólico11,14 y el ácido retinoico lipídico bioactivo15,16. Investigar los mecanismos y causas de la ENFERMEDAD y otros defectos cardiovasculares es importante desarrollar estrategias preventivas y nuevas opciones terapéuticas1,4,17,18,19.
El ratón en desarrollo es un modelo de piedra angular para el estudio de la CHD en mamíferos. Sin embargo, algunos de los métodos y análisis empleados, como las disecciones que preservan la morfología del corazón, el análisis de las etapas del desarrollo y la identificación de defectos asociados a la CHD, pueden ser desalentadores para los científicos que son nuevos en el análisis de los corazones murinos. El objetivo de los métodos descritos en este protocolo es ofrecer directrices cualitativas y cuantitativas para estos procesos. Así, en este protocolo explicamos cómo realizar aparejos cronometrados para producir embriones de la etapa gestacional deseada, diseccionar a las hembras embarazadas para la recuperación intacta del corazón (incluyendo los tejidos asociados como el tracto de salida), la fijación del corazón y la preparación para seccionamiento de criostatos, métodos de histología básica, análisis cuantitativos de defectos cardíacos comunes y análisis cualitativos de la compactación del músculo cardíaco, un fenotipo precursor común para algunos tipos de CHD.

<table><tbody><tr><td>Tubo(s) cónico(s) de 15 mlFisher</td> <td>Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Ratones</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de tinción Coplin (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos 24X50MM #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plato(s) de disecciónFisher</td> <td>Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinzas finas (x2)</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y Solution</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico (puro, 200 grados)</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td><td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Finas</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Estereoscópico Fluorescente Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Millipore Sigma</td><td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prisma 8 Software</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina de Mayer</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Punta(s) de micropipeta - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus CkX53</td><td>Pinceles Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(al menos 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>Convertir en solución al 4% (disuelto en PBS)</td></tr><tr><td>Pipeta(s) PasteurFisher</td> <td>Scientific</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>Diluir de 10 a 1 veces antes de usar</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Molde cuadrado</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>Para moldes OCT</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Millipore Sigma</td><td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo desechables Tissue-Tek Accu-Edge</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Báscula</td><td>de viaje Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos, afectando hasta el 1% de todos los nacimientos vivos. Sin embargo, las causas subyacentes de la ENFERMEDAD de Haya todavía se entienden mal. El ratón en desarrollo constituye un modelo valioso para el estudio de la CHD, ya que los programas de desarrollo cardíaco entre ratones y humanos están altamente conservados. El protocolo describe en detalle cómo producir embriones de ratón de la etapa gestacional deseada, métodos para aislar y preservar el corazón para el procesamiento posterior, métodos cuantitativos para identificar tipos comunes de CHD por histología (por ejemplo, septal ventricular defectos, defectos interauriculares, conducto arterial patentado) y métodos cuantitativos de histomorfometría para medir fenotipos comunes de compactación muscular. Estos métodos articulan todos los pasos involucrados en la preparación, recolección y análisis de muestras, permitiendo a los científicos medir correctamente y reproduciblemente la CHD.

El índice de compactación muscular se comparó entre corazones que se desarrollaron bajo dos ambientes diferentes, un control y un grupo experimental. Estos protocolos se utilizaron para analizar cuantitativamente la compactación del tejido muscular, lo que permitió el análisis estadístico. Se demostró que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales.
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En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.

Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Este protocolo estandariza las nuevas técnicas de análisis de tejidos para que puedan ser más utilizadas por otros grupos que también estudian defectos cardíacos congénitos. Como las técnicas de análisis cualitativo y cuantitativo tienen sus pros y sus contras, esta metodología utiliza ambas para abordar la más amplia gama de preguntas experimentales. Estas técnicas pueden tener un impacto positivo en los métodos de diagnóstico de cardiología.Por ejemplo, los patólogos podrían aplicar nuestras técnicas microscópicas de análisis de tejido cardíaco para diagnosticar enfermedades cardíacas humanas a partir de muestras de biopsia. Este protocolo se puede utilizar para la cardiología del desarrollo o la investigación general de cardiología. Sin embargo, estos métodos también proporcionan varias técnicas útiles que se pueden aplicar hacia cualquier análisis de tejido.Para recoger el día embrionario de 15 a 15,5 corazones, asegurar las extremidades de una presa embarazada y comenzando alrededor de la uretra hasta el esternón, cuidadosamente hacer una incisión en forma de I a lo largo del torso. Usando fórceps en un movimiento de scooping, levante suavemente el útero fuera de la cavidad abdominal agarrando los tejidos superficiales del útero según sea necesario con fórceps finos para ayudar en la extracción. Use tijeras para liberar el útero del abdomen.Después de remojar el útero en PBS helado, coloca el órgano en una bandeja de disección. Usando tijeras, corte el útero en secciones individuales cada una que contenga un embrión separado. Usando dos pares de fórceps finos, pela suavemente los embriones del tejido uterino y colóquelos en un nuevo plato de Petri que contenga cuatro grados Celsius PBS-EDTA.Para recoger los corazones, coloque el plato bajo un microscopio diseccionado y utilice dos pares de fórceps finos para colocar el embrión en la posición supina. Después de estabilizar el acceso al tórax, utilice el punto afilado de un segundo par de fórceps finos para hacer una incisión a lo largo del esternón del embrión que se extiende entre las clavículas hasta el ombligo. Haciendo incisiones muy finas y superficiales mientras se trabaja gradualmente hacia el interior de la cavidad torácica, abra el abdomen del embrión.Cuando el corazón se haga visible, usa un par de fórceps para apretar el torso ligeramente acodado a la caja torácica para pelar las costillas abiertas. Usando los lados de un par de fórceps, agarra suavemente los vasos sanguíneos pulmonares sin separar el tejido y saca el corazón de la cavidad. Limpie el corazón en PBS-EDTA fresco durante uno o dos minutos antes de fijar el tejido en 4%Paraformaldehído durante 45 a 60 minutos.Luego, lave el corazón tres veces durante 5 a 10 minutos por lavado en PBS complementado con glicina. Antes de almacenar los corazones en PBS a cuatro grados centígrados. Para preparar el corazón para la criocisión, coloque las muestras en un tubo de 30% sacarosa y PBS a cuatro grados centígrados durante 24 a 40 horas.Cuando los corazones se hayan hundido en la parte inferior del tubo, utilice una pipeta Pasteur con una punta modificada para transferir cuidadosamente cada corazón a un pedazo de pelusa libre de pelusas. Después de un breve secado al aire, coloque cada muestra en moldes de temperatura de corte óptimos individuales en las orientaciones deseadas para el corte. Sumerja los tejidos en un medio de temperatura de corte óptimo sin burbujas.Luego, almacene los moldes a 20 grados Celsius hasta unos días antes de congelar los tejidos a 80 grados Celsius durante al menos 24 horas antes de la criocciones. Para obtener secciones de criostato de las muestras, utilice un medio de corte de temperatura óptimo fresco para unir el bloque tisular de interés al mandril del criostato y permitir que el medio se congele hasta que sea blanco opaco. Inserte una nueva cuchilla y ajuste la distancia entre el bloque de tejido y la hoja para permitir la obtención de secciones.Recorte el bloque en rodajas de 10 micrómetros hasta que se alcance el punto de interés. Cuando se pueda observar el tejido, utilice un pequeño pincel plano para tirar suavemente de la rebanada contra el soporte en un movimiento de corte continuo. Una vez que el tejido se ha cortado por completo, utilice el cepillo de detalle para acariciar la rebanada hacia abajo contra el escenario.Mantenga la sección en su lugar durante aproximadamente 20 a 30 segundos antes de retirar el cepillo detallado y terminar el corte. Utilice ambos pinceles para aplanar suavemente la rebanada contra el escenario evitando cualquier balanceo y sostenga la sección del tejido contra la etapa. Después de 20 a 30 segundos, voltea la sección y aplana la parte contra el escenario de nuevo antes de colocar una diapositiva cargada electrostáticamente lo suficientemente cerca como para que la rebanada sea atraída y se adhiera a la diapositiva sin tener que tocar la diapositiva al escenario.Para evaluar las secciones del tejido cardíaco para detectar la presencia de defectos cardíacos comunes, utilizando un microscopio equipado con una cámara, obtenga imágenes de aumentos de 5 a 10X y 40X. Para el análisis de compactación muscular cardíaca, abra un tejido de interés en un programa de software de análisis de imágenes adecuado y establezca la imagen en 8 bits. Para establecer el umbral de la imagen, haga clic en Imagen, Ajustar y Umbral y mueva la barra superior para ajustar el umbral hasta que solo se seleccionen los píxeles del fondo.A continuación, utilice la herramienta selecciones de polígonos para dibujar una región de interés alrededor del tejido y, a continuación, haga clic en Analizar, Establecer medidas, área y Límite hasta umbral. Haga clic en Analizar y medir para medir el área de los píxeles resaltados para obtener el valor del área del espacio negativo. Para medir el área de toda la región de interés, haga clic en Analizar, Establecer medidas y anule la selección de Limitar al umbral.A continuación, seleccione Analizar y medir para medir toda el área de la región de interés seleccionada. Para calcular el área del tejido muscular, reste el área de espacio negativo del área de la región de interés. A continuación, dividir el área del tejido muscular por el área de la región de interés para calcular la compactación muscular y X.La tinción de las rebanadas de tejido de los corazones embrionarios cosechados, proporciona suficiente contraste para hacer los bordes del tejido, pero no es tan oscuro como para hacer que las características celulares indistinguibles.En este análisis representativo, se observó que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales. Estas muestras son valiosas y requieren mucho tiempo para crear. Durante las necropsias y la sección del criostato específicamente, asegúrate de ser intencional sobre cada acción que realices.La preservación de los tejidos en Paraformaldehído mantiene la actividad del antígeno permitiendo que las muestras se utilicen para pruebas como la tinción de aminofluoresceína que ayudan a identificar las causas patológicas encontradas durante la evaluación de la morfología. En nuestro laboratorio, obtuvimos representación cuantitativa de tratamientos experimentales que nos pueden ayudar a identificar el grado en que diferentes tratamientos afectan a nuestras muestras. El paraformaldehído puede fijar cualquier tejido que toque.Tenga cuidado de usar siempre guantes para minimizar la piel expuesta y trabajar en una capucha de película cada vez que trabaje con este producto químico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La muerte fetal y perinatal es una característica común en el estudio de las alteraciones genéticas que afectan el desarrollo cardíaco. Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido ha mejorado en 2-D y resolución pueden proporcionar información relevante sobre el desarrollo cardíaco temprano y es un método ideal para detectar el impacto en la estructura y función cardíaca antes de la muerte.

La ecocardiografía fetal murino

Ultra-alta frecuencia de ultrasonido es una poderosa herramienta de imágenes en directo para examinar anormalidades cardíacas en animales pequeños. Su carácter no invasivo permite el mantenimiento del estado fisiológico de los embriones. En este documento, se muestra el uso del modo M ultrasonido para medir el ritmo cardíaco de los embriones en E18.5 en el útero.

En el útero de medición de la frecuencia cardíaca en el ratón por no invasiva Ecocardiografía en modo M

Las mutaciones que conducen a defectos cardíacos congénitos se benefician de la investigación in vivo de la estructura cardíaca durante el desarrollo, pero los estudios estructurales de alta resolución en el corazón embrionario de ratón son técnicamente desafiantes. Aquí presentamos un método robusto de inmunofluorescencia y análisis de imágenes para evaluar las estructuras específicas de los cardiomiocitos en el corazón de ratón en desarrollo.

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

La examinación ecocardiográfica se utiliza con frecuencia en los ratones. Dispositivos de ecografía de alta resolución caro han sido desarrollados para este propósito. Este protocolo describe un procedimiento ecocardiográfico asequible combinado con análisis de morfometría histológica para determinar la morfología cardiaca.

Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

Aquí, describimos un protocolo para montaje entero de la inmunofluorescencia y análisis volumétrico cuantitativo basado en imágenes de embriones de ratón de etapa temprana. Presentamos esta técnica como un potente enfoque cualitativa y cuantitativamente evaluar estructuras cardiacas durante el desarrollo, y proponer que sea ampliamente adaptable a otros sistemas del órgano.

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

Proyección de imagen de ultrasonido de alta frecuencia del ratón fetal ha mejorado la resolución de imagen y puede proporcionar la precisa caracterización no invasiva de desarrollo cardíaco y defectos estructurales. El protocolo descrito en este documento está diseñado para realizar la ecocardiografía ratones fetales en tiempo real en vivo.

Proyección de imagen usando un sistema del ultrasonido de alta frecuencia (30 / 45MHZ) Cardiovascular fetal ratón

Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

Este artículo detalla los métodos de diagnóstico de cardiopatía congénita (CHD) murina mediante ecocardiografía fetal, necropsia y captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) mediante microscopía confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrucción tridimensional (3D).

Una tubería para caracterizar defectos cardíacos estructurales en el ratón fetal

Aquí divulgamos el etiquetado dual de las células de los nervios de la cresta y de los vasos sanguíneos usando el injerto intraespecies del tubo de los nervios del pollueloGFP combinado con la inyección intra-vascular de DiI. Esta técnica experimental nos permite visualizar y estudiar simultáneamente el desarrollo del sistema nervioso derivado de NCC (entérico) y del sistema vascular, durante la organogénesis.

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

A continuación, presentamos un protocolo para inyectar medios de contraste de microburbujas de ultrasonidos en la vida, aislados finales de la gestación de embriones murinos etapa. Este método permite el estudio de los parámetros de perfusión y de marcadores moleculares vasculares dentro del embrión utilizando imágenes de ultrasonido de alta frecuencia con contraste.

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Aprende análisis histológico cualitativo y cuantitativo de tejido cardíaco en embriones de ratón para estudiar defectos cardíacos congénitos. Este protocolo estandarizado mejora diagnósticos en cardiología.

Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos

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