Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Pathogenese, die humoralen Reaktionen und die Schutzwirksamkeit, die durch Influenza-A-Wildtyp-Viren oder Influenza-Impfstoffe induziert werden, anhand eines Mausmodells der Infektion zu bewerten. Diese Methode kann helfen, die Fragen zur Biologie von Influenza-A-Viren zu beantworten, wie z. B. die virale Pathogenese, Immunantworten und Wirksamkeit von Influenza-Impfstoffen sowie Virenschutzmitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Maus über ein ähnliches Immunsystem wie der Mensch verfügt und mehrere Stämme zur Verfügung stehen, die genutzt werden können, um die genetische Basis von Influenza-A-Virusinfektionen zu bewerten.

Da diese Methode Aufschluss über die Wirksamkeit neuer Influenza-Impfstoffe geben kann, kann sie auch auf ältere Systeme angewendet werden, z. B. bei der Bewertung potenzieller antiviraler Behandlungen, einschließlich der Adressierung von Antikörpern oder Medikamenten. Nach der Aufzucht und Markierung von sechs bis acht Wochen alten C57B6-Mäusen unter pathogenfreien Bedingungen und der Herstellung von Influenza-A-Virus- oder IAV-Verdünnungen unter aseptischen Bedingungen. Verwenden Sie eine Waage, um die Mäuse zu wiegen und das Gewicht aufzuzeichnen.

Sobald eine Maus betäubt ist und die Narkosetiefe gemäß dem Textprotokoll überprüft wurde, legen Sie die Maus in dorsale Liege. Führen Sie eine Pipettenspitze mit 30 Mikrolitern des Virusinokulums in das Nasenloch ein und stoßen Sie die Lösung langsam, aber stetig aus. Zur Bewertung der Morbidität und Mortalität infizieren drei bis vier Gruppen weiblicher Mäuse mit 10 vollen Dozes des PR8-Wildtyps, wie im Textprotokoll beschrieben.

Überwachen und wiegen Sie die Mäuse in den nächsten 14 Tagen, ungefähr zur gleichen Zeit, um Gewichtsschwankungen durch Nahrungsaufnahme zu minimieren. Nach der Einschläferung der Tiere, die die Virusinfektion überlebt haben, und der Berechnung der viralen 50%igen tödlichen Mausdosis oder MLD50 gemäß dem Textprotokoll. Infizieren Sie weibliche sechs bis acht Wochen alte Mäuse mit Virusdosen von 10 bis 10 bis zur vierten fluoreszierenden Einheit oder FFU des PR8-Wildtyps.

An den Tagen zwei und vier, um die Lungen und die Nasenschleimhaut der Maus für die Auswertung zu sammeln. Nachdem Sie die Tiere eingeschläfert haben, legen Sie ein Tier in die Rückenlage und verwenden Sie 70%iges Ethanol, um das Fell über dem Brustkorb zu desinfizieren. Schneide die Haut mit einer Schere von der Basis des Bauches bis zum Brustbein ab.

Machen Sie dann mit einer Schere einen Zentimeter großen Schnitt von der Basis des Einschnitts bis zu den seitlichen Teilen der Maus. Entfernen Sie die Haut vom gesamten oberen Teil der Maus bis zur Basis des Bauches, wo der erste Schnitt gemacht wurde. Schneiden Sie dann mit der Schere den Kopf ab und legen Sie ihn in eine trockene, sterile Petrischale.

Schneide mit einer Schere die Verbindungen zwischen Oberkiefer und Unterkiefer ab und entsorge den Unterkiefer. Machen Sie dann mit der Schere zwei Schnitte an den Enden der Jochbögen und entfernen Sie diese. Verwenden Sie eine Präparierzange, um die Augen zu entfernen.

Halten Sie dann mit der Präparierzange den Schädel fest und schneiden Sie ihn mit einem Skalpell entlang der sagittalen Naht. Hebe die beiden Hälften des Schädels mit dem Gehirn an, um die Nasenschleimhaut zu sehen. Schneiden Sie mit dem Skalpell den Teil des Schädels mit dem Gehirn ab und entsorgen Sie ihn.

Legen Sie den restlichen Schädel mit der Nasenschleimhaut in ein steriles Röhrchen. Lagern Sie das Röhrchen auf Eis, wenn die Proben am selben Tag verarbeitet werden, oder frieren Sie es schnell auf Trockeneis ein, wenn die Proben später verarbeitet werden. Um eine Kontamination der Proben zu vermeiden, verwenden Sie ein Desinfektionsmittel mit Chlordioxid, um die Präparierwerkzeuge zwischen jedem entnommenen Gewebe und zwischen den einzelnen Tiersektionen zu reinigen und zu desinfizieren.

Um dann die Lungen zu sammeln, legen Sie das Tier in die Rückenlage und schneiden Sie die Plura mit einer Schere ab. Beginnend an der Basis des Brustkorbs schneidest du die Rippen mit einer Schere einen Zentimeter auf beiden Seiten des Brustbeins bis zum oberen Teil der Rippen ab. Machen Sie mit der Schere einen Querschnitt zwischen den beiden Schnitten im oberen Teil des Brustkorbs und entfernen Sie die Bruststelle.

Halten Sie die Lunge mit der Pinzette fest, machen Sie einen Schnitt am Ende der Luftröhre kurz vor der Lunge und legen Sie die Lunge in einen sterilen Schlauch. Geben Sie die Lunge oder Nasenschleimhaut in einen sterilen dounce Homogenisator und fügen Sie einen Milliliter Erkältungsinfektionsmedium hinzu. Die Probe wird homogenisiert, indem der Stößel etwa eine Minute lang bei Raumtemperatur auf und ab bewegt wird, bis die Lunge vollständig zerstört ist.

Geben Sie die homogenisierte Probe in ein steriles Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x G für fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen sterilen Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.

Lagern Sie den Überstand bei vier Grad Celsius, wenn die Virustitration am selben Tag durchgeführt wird. Am Tag vor der Titration werden 96-Well-Platten mit MDCK-Epithelzellen in Gewebekulturmedium besiedelt, so dass sie eine Konfluenz von etwa 80 bis 90 % erreichen. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5% Kohlendioxid über Nacht.

Um eine bis 10 Verdünnungen der homogenisierten Lungen- oder Nasenschleimhautproben herzustellen, geben Sie 90 Mikroliter Infektionsmedium in jede der Vertiefungen einer 96-Well-Platte. 10 Mikroliter des Überstands aus einer der homogenisierten Proben werden in die Vertiefungen A1, A2 und A3 gegeben, um den Virustitel jeder Probe zu bewerten und zu verdreifachen. Dann werden 10 Mikroliter eines weiteren Überstands der homogenisierten Proben in die Vertiefungen A4, A5 und A6 gegeben. Nachdem Sie den Probenüberstand zu Reihe A hinzugefügt haben, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette zum Mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.

10 Mikroliter von Reihe A in Reihe B umfüllen und gut vermischen. Wechseln Sie die Spitzen zwischen den Verdünnungen und wiederholen Sie den Transfer von Reihe B nach Reihe C und fahren Sie auf ähnliche Weise fort, bis Sie die letzte Reihe erreichen. H. Entfernen Sie mit einem Vakuum-Aspirator-Mehrkanaladapter das Gewebekulturmedium von den MDCK-Zellen in den 96-Well-Platten und verwenden Sie 100 Mikroliter pro Well 1x PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Beginnend mit den höheren Verdünnungen und zu den niedrigeren Verdünnungen werden 50 Mikroliter pro Vertiefung des seriell verdünnten Überstands der homogenisierten Proben auf die 96-Well-Platte der MDCK-Zellen übertragen, wobei die höheren Verdünnungen von Reihe H in Reihe A der Zellen übertragen werden.

Stellen Sie die 96-Well-Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf eine Schaukelplattform, um die Virusabsorption zu ermöglichen. Entfernen Sie dann mit einem Vakuum-Aspirator-Mehrkanaladapter das Inokulum und fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung Postinfektionsmedium hinzu. Inkubieren Sie die infizierten Zellen acht Stunden lang in einem 33 Grad Celsius oder 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Fahren Sie mit der Fixierung, Färbung, Bildgebung und Berechnung des Virustitels fort, wie im Textprotokoll beschrieben. In diesem Experiment wurden Mäuse mit unterschiedlichen Dosen des PR8-Wildtyps infiziert. Das Körpergewicht und das Überleben von fünf Mäusen pro Gruppe wurden 14 Tage nach der Infektion gemessen.

Mäuse, die mit einer höheren FFU des PR8-Wildtyps immunisiert waren, verloren schneller und schwerer an Gewicht und starben alle an den Folgen. Der MLD50 des PR8-Wildtyps in diesem Experiment, berechnet mit der Schilf- und Muench-Methode, betrug 1,5 x 10 zum zweiten FFU. Um die humoralen Reaktionen zu analysieren, die gegen eine IV-Infektion induziert wurden, wurden 14 Tage nach der Immunisierung Mäuse geblutet, um das Vorhandensein von Antikörpern gegen die Gesamtzahl der viralen Proteine und das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern zu analysieren, die auf das virale HA-Protein abzielen, wobei eine Hämoagglutinationshemmung oder HAI und ein Virus-Mikroneutralisations- oder VN-Assay verwendet wurden.

Wie hier zu sehen ist, deuten die Ergebnisse des Assays darauf hin, dass die Seren von Mäusen, die mit einer höheren Dosis des abgeschwächten PR8-Lebendinfluenzavirus (LAIV) immunisiert wurden, höhere Antikörpertitel gegen Gesamt-PR8-Proteine aufwiesen als Seren von Mäusen, die mit einer niedrigeren Dosis immunisiert wurden. Unter Verwendung der HAI- und VN-Assays hatten Seren von Mäusen mit der größten Menge an PR8 LAIV einen höheren Titel als neutralisierende Antikörper, während das Serum einer Maus, die mit der niedrigeren Dosis immunisiert wurde, den niedrigsten Titel als neutralisierende Antikörper gegen PR8 aufwies. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mäuse mit Influenza-A-Viren infiziert, wie man sie anhand ihrer Pathogenese, humoralen und Immunreaktionen und der Bioreplikation in den oberen und unteren Atemwegen bewertet.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Influenza-A-Virus, um die Pathogenität, Immunogenität und Schutzwirkung von Lebendantikörper-Impfstoffen anhand eines Mausmodells der Infektion zu untersuchen.