Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genfunktion von Mückenlarven zu analysieren, wobei rekombinante Mücken-Densoviren als Gentransfer verwendet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in viralen Verabreichungssystemen zu beantworten, z. B. wie die damit verbundenen extrazellulären und intrazellulären Barrieren überwunden werden können. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind die einfache Manipulation, die hohe Transduktionseffizienz, die langfristige und robuste Verwendung von Expressionen und die Fähigkeit, in vivo anhaltende Effekte zu erzeugen.

Diese Arbeit zeigte, dass bestimmte kleine RNAs oder Zielgene in Mückenlarven mit Hilfe des entwickelten Densovirus-Verabreichungssystems überexprimiert oder ausgeschaltet werden können. Die Implikationen dieser Technik erweitern die Anwendungen der beschriebenen Expressionsstrategie zur Untersuchung der Mückenbiologie, da diese Methode eine einfache Transduktion von Larven ermöglicht. Das Verfahren wird von Pei-Wen Liu, einer Doktorandin aus unserem Labor, vorgeführt.

Beginnen Sie mit der Bestellung der chemischen Synthese von cDNA-Sequenzen in voller Länge für die Vorläufer-miRNAs, miRNA-Schwämme und shRNA, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Nachdem Sie die bestellte DNA erhalten haben, drehen Sie die Röhrchen mit den DNA-Blöcken, um sicherzustellen, dass sich die gesamte getrocknete DNA am Boden des Röhrchens befindet. Anschließend resuspendieren Sie die DNA in DNase-freiem Wasser, um eine Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen.

Fügen Sie sechs Mikroliter XbaI hinzu, um das Plasmidrückgrat und die cDNA-Sequenzen zu verdauen, und platzieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Dann werden die fünfprimigen Enden des linearisierten Plasmidrückgrats gemäß den Anweisungen des Herstellers mit alkalischer Phosphatase im Kalbsdarm dephosphoryliert. Für eine effiziente Verpackung darf die Genomgröße 4.400 Nukleotide nicht überschreiten, was 110 % der Länge des Wildtyp-Densovirus-Genoms der Mücke entspricht, oder die intronische microRNA-Expression besteht aus nicht mehr als 400 Nukleotiden und kann in das Genom von Aedes aegypti eingeführt werden.

Als nächstes inaktivieren Sie die alkalische Phosphatase bei 65 Grad Celsius. Führen Sie dann die DNA auf einem 1%igen Agarose-Gel aus und schneiden Sie das linearisierte Rückgrat ab. Extrahieren Sie die DNA aus der Gelscheibe mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Nach der Extraktion ligieren Sie das DNA-Fragment mit T4-DNA-Ligase in das Rückgrat. Verwenden Sie dann einen Hitzeschock, um die Produkte der Ligationsreaktion in kompetente DH5-alpha-E.coli-Zellen umzuwandeln. Die transformierten Bakterien werden auf eine LB-Agarplatte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin aufgebracht.

Nehmen Sie am nächsten Tag eine einzelne Kolonie vom Teller und erstellen Sie eine Starterkultur mit drei Millilitern angereichertem Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält. Extrahieren Sie schließlich die Plasmid-DNA aus der Bakterienkultur mit einem Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Senden Sie eine DNA-Probe zur Überprüfung an ein DNA-Sequenzierungsunternehmen.

Ligate pre-miRNA oder shRNA in die HpaI-Stelle der AaeDV NS1-kodierenden Region im pUCA-Plasmidrückgrat unter Verwendung der Methoden, die für die künstliche intronische kleine RNA-Expressionskassette gezeigt wurden. Anstatt DH5-alpha-Zellen zu verwenden, wandeln Sie die DNA in Stbl3-kompetente E.coli-Zellen um. Dann werden die transformierten Zellen auf eine LB-Agar-Platte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin aufgebracht und eine Starterkultur aus einem positiven Klon hergestellt.

Extrahieren Sie anschließend das rAaeDV-Plasmid aus den Bakterienzellen mit einem Maxiprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Am Tag Null werden 90 bis 95 % konfluente Kolben mit C6/36-Zellen eins bis zwei in 10 T-25-Kulturflaschen aufgeteilt. Inkubieren Sie die Kolben 18 bis 20 Stunden lang bei 28 Grad Celsius, bis sie wieder eine Konfluenz von 90 bis 95 % erreichen.

Am ersten Tag transfizieren Sie die Zellen mit den erzeugten rAaeDV-Plasmiden. Um dies zu erreichen, verdünnen Sie 10 Mikrogramm DNA in 600 Mikroliter RPMI-1640-Medium und mischen Sie die Lösung vorsichtig. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 600 Mikroliter RPMI-1640 Medium und 25 Mikroliter Transfektionsreagenz pro Transfektion vor.

Inkubieren Sie die Zellen mit der DNA für fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 625 Mikroliter des Transfektionsreagenzgemisches RPMI-1640 in das Plasmid-DNA-Gemisch und inkubieren Sie dieses Gemisch 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit RPMI-1640-Medium und geben Sie dann die Transfektionsmischung in jeden der T-25-Kulturkolben.

Inkubieren Sie die Zellen in der Transfektionsmischung für sechs Stunden bei 28 Grad Celsius. Entfernen Sie nach sechs Stunden das Transfektionsmedium, waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern RPMI-1640-Medium und fügen Sie dann frisches RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS hinzu. Fünf Tage nach der Transfektion verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Glaspipette, um die Zellen in den Schalen zu lösen und aufzuhängen, indem Sie mit dem Kulturmedium auf und ab pipettieren.

Die Zellsuspensionen aus jedem Kolben werden in ein eigenes steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Um eine hohe Schwelle zu ernten, ist es notwendig, die Zellen nach der Transfektion fünf Tage lang zu erhalten. Frieren Sie die einzelnen Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius oder in einem Trockeneis-Ethanolbad für 30 Minuten ein.

Tauen Sie sie dann schnell bei 37 Grad Celsius auf und wirbeln Sie die Zellsuspension eine Minute lang ein. Entnehmen Sie anschließend den Überstand aus der zentrifugierten Probe und entsorgen Sie das Pellet. Führen Sie dann den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Einweg-Spritzenfilter.

Aliquotieren und lagern Sie die endgültigen gereinigten Virionbestände bei minus 80 Grad Celsius. Waschen Sie 100 A.albopictus-Larven im ersten Stadium dreimal mit entionisiertem Wasser. Und dann geben Sie die Larven in ein Becherglas mit 95 Millilitern entionisiertem Wasser.

Geben Sie fünf Milliliter der rAaeDV-Brühen hinzu und inkubieren Sie die Larven 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Für den Erfolg einer Larveninfektion ist es wichtig, dass die Larven 24 bis 36 Stunden lang mit Infektionsviruspartikeln eingeschlossen werden, um hohe Infektionsraten zu gewährleisten. Waschen Sie die Larven nach der Inkubation dreimal mit entionisiertem Wasser und geben Sie die Larven dann zurück auf die Platten.

Füttern Sie die Larven regelmäßig. Überwachen Sie das Ausmaß der Zielgenexpression in den Larven mit quantitativer PCR oder Western Blot unter Verwendung von Standardtechniken. In diesem Beispiel wurden 100 First-instar-Larven auf ihre endogene miRNA-Expression nach Infektion mit dem rekombinanten Virus, das die aal-let-7-Expressionskassette enthält, analysiert, die eine Überexpression zeigt.

Die Effizienz des Anti-Let-7-Konstrukts ist auf der rechten Seite dargestellt und hebt seine Knockdown-Fähigkeiten hervor. Um die V-ATPase mRNA-Knockdown-Effizienz der rAaeDV-Vektoren zu überwachen, wurden insgesamt 100 First-instar-Larven mit gleichen Mengen an rAaeDV unterschiedlicher Art behandelt, indem das Virus in den Gewässer des Larvenhabitats gegeben wurde. Die V-ATPase mRNA-Spiegel wurden durch eine miRNA, die rAaeDV exprimiert, und durch intronische shRNA, die rAaeDV exprimiert, signifikant reduziert.

Unsere Ergebnisse validieren eine intronische Expressionsstrategie, die ein neues Paradigma bietet, das die Einschränkungen von Mückendensoviren mit defektem Genom überwinden kann, um eine effiziente Abgabe von Fremdgenen in Stechmücken zu ermöglichen. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass eine intronische microRNA-Expressionskassette von nicht mehr als 400 nt in das Densovirus-Genom von Aedes aegypti eingeführt werden kann. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Erforschung der Produktion von nicht defekten rekombinanten Mosquito-Densoviren, die microRNAs überexprimieren oder herunterregulieren können, und die Zielgene, um die funktionelle Analyse von Mückengenen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das entwickelte Mücken-Densovirus-Verabreichungssystem verwenden können, um die Genfunktionen in Mückenlarven zu analysieren.