Name: Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Genfunktionen in Mückenlarven mit rekombinantem Aedes aegypti Densovirus als Gentransfersystem. Diese Methode ermöglicht effiziente Überexpression oder Knockdown spezifischer Gene in vivo.

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Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung von National Key Research and Development Program of China (2016YFC1200500, Xiao Guang Chen), der National Natural Science Foundation of China (81672054 und 81371846), das Team Forschungsprogramm des natürlichen Science Foundation von Guangdong (2014A030312016), und die wissenschaftliche und technologische Programm von Guangzhou (201508020263). Wir erkennen dankbar Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) für freundlicherweise die pUCA und p7NS1-GFP Plasmide und kritisch lesen dieses Manuskript.

alle Protokolle wurden von den ethischen Komitees der Southern Medical University angenommen.
 1. entwerfen eine künstliche Intron Hinweis: die künstliche Intron in dieser Arbeit verwendeten ist 65 bp in der Länge, und die Reihenfolge ist 5 &#39; - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 &#39;.
<ol><li>Legen die Hpa ich Beschränkung site an beiden Enden des künstlichen Intron so dass Hpa ich Verdauung kann loslassen das Intron aus Plasmide (siehe Abbildung 1 A).</li>
	<li>Legen Sie die zwei Xba ich Einschränkung Websites in der Intron so dass Xba ich Verdauung kann verwendet werden, um kleine RNA Ausdruck Sequenzen einfügen.</li>
	<li>Bestellen die chemische Synthese von durchgehenden DNA-Sequenzen der künstlichen Intron einem DNA-Hersteller. Das synthetische DNA erstellt von Klonen in ein Plasmid pUC19 standard ist. 
	Hinweis: Die wesentlichen Bestandteile der künstlichen Intron enthalten mehrere Konsens Nukleotid-Elemente, einschließlich einer 5 &#39; Spleiß Entnahmestelle (DS) mit der Sequenz GUAAGAGU, eine erhaltene Verzweigungspunkt Sequenz (BPS) mit der Sequenz UACUAAC, eine Poly-Pyrimidine Darm-Trakt (PPT) mit der Sequenz UCUUC(U) 10 und 3 &#39;-Akzeptor Splice Site (AS) mit der Sequenz GAUAUCCUGCAG ( Abb. 1 A). Zwei Xba ich Restriktionsschnittstellen wurden zwischen DS und BPS, die einzufügende Ausdruck klein-RNA-Sequenzen verwendet werden kann. Die Möglichkeit dieser künstlichen Intron aus Säugetieren und Mücke Zellen effektiv Splice wurde zuvor bestätigten 14.</li>
</ol> 2. Gestaltung eines künstlichen intronischen kleine RNA Expressionskassette Hinweis: Überexpression oder Knockdown von endogenen MiRNA, Sequenzen, die Codierung Precursor MiRNA oder MiRNA Schwamm zwischen DS und BPS eingefügt wurden. Um als Vorbild dienen, wählte man eine endogene Precursor MiRNA aus Ae. Albopictus Aal-Let-7, rekombinante virale Vektoren für MiRNA Überexpression und Zuschlag zu konstruieren. Ein let-7 Schwamm wurde nach zuvor beschriebenen Methoden 15 entwickelt. Um knock down Zielgene in Larven, entwarfen wir bestimmte künstliche MiRNA (AmiRNA) oder kurze Haarnadel (ShRNA) RNA-Sequenzen mit Onlinesoftware 16 , 17; als ein Beispiel, V-ATPase Untereinheit eine mRNA dienen (Beitritt nein. AY864912) wurde als ein Zielgen in dieser Studie ausgewählt. Die AmiRNA wird, als AmiVTP bezeichnet werden. Alle Sequenzen Details des Pre-MiRNA, Schwamm, AmiRNA und ShRNA werden in ergänzenden Tabelle1 beschrieben.
<ol><li>Die chemische Synthese von in voller Länge cDNA-Sequenzen der Vorläufer MiRNAs, MiRNA Schwämme und ShRNA mit Xba bestellen ich Restriktionsschnittstellen an beiden Enden eines DNA-Herstellers.</li>
	<li>Nach Erhalt der bestellten DNS Spin die Rohre mit DNA-Blöcken bei 10.000-14.000 x g für 1 min um sicherzustellen, dass alle DNA getrocknet ist an der Unterseite des Rohrs.</li>
	<li>Aufschwemmen die getrockneten DNA in DNase-freies Wasser um eine Endkonzentration von 10 ng/µL zu erreichen.</li>
	<li>Verdauen das Plasmid-Rückgrat und DNA-Sequenzen mit Xba ich bei 37 ° C für 1 h und dann die 5 dephosphorylate &#39; Enden des linearisierten Plasmid-Backbones mit Kalb Darm alkalische Phosphatase (CIAP) nach Angaben des Herstellers &#39; s-Protokoll .</li>
	<li>Inaktivieren CIAP durch Erhitzen für 60 min bei 65 ° c</li>
	<li>Führen eine 1,0 % Agarosegel und schneiden das linearisierte Rückgrat. Ziehen Sie dann die DNA aus den Gel-Scheibe mit einem Gel Extraction Kit nach dem Hersteller &#39; Anweisungen s.</li>
	<li>Ligate das DNA-Fragment in der Backboneby-T4 DNA-Ligase (5 U/µL) bei 22 ° C für 1 h.</li>
	<li>Die Produkte der Ligatur Reaktion aus Schritt 2.7 in kompetenten Escherichia coli (E. Coli) Zellen und Platte auf einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit Ampicillin (in einer Konzentration von 100 µg/mL) zu verwandeln.
	<ol><li>Führen die Transformation durch eine Hitze Schock Methode 18 und Nutzung der entsprechenden E. Coli-Stamm. Z. B. E. Coli-Stamm DH5α für Hitze Schock Transformation.</li>
	</ol></li> <li>Pick eine einzige Kolonie von 2,8 Schritt und inkubieren Sie in einer Kultur von 3 mL bereichert mittlere mit Ampicillin (in einer Konzentration von 100 µg/mL).</li>
	<li>Das Plasmid DNA extrahieren die Bakterienkultur mit einem Mini-Prep Kit nach dem Hersteller &#39; Anweisungen. Senden Sie die Probe auf eine DNA-Sequenzierung Unternehmen. 
	Hinweis: Für die Überexpression oder Knockdown von endogenen MiRNA, die Codierung Precursor MiRNA oder MiRNA Schwamm Sequenzen eingefügt wurden zwischen den beiden Xba ich Websites. Alle MiRNA Ausdruck oder Schwamm Konstrukte muss kürzer als 400 bp (10 % von der Länge des Virusgenoms) aufgrund der Verpackung Begrenzung des Virus 19.</li>
</ol> 3. Generierung von ein rAeaDV Konstrukt durch Klonen einer MiRNA oder ShRNA Expressionskassette in ein Plasmid-Backbone Hinweis: pUCA, eine infektiöse Klon, bestehend aus einem pUCA Plasmid, das AaeDV Genom enthält (3.981 nt) 19, wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Jonathan Carlson und wurde zuvor im Detail 11 beschrieben. p7NS1-DsRed drückt eine nichttragende Protein 1 (NS1)-rot fluoreszierenden Proteins (DsRed) Schmelzverfahren Protein aus dem p7-Promotor und wurde 14 an anderer Stelle ausführlich beschrieben. Ein Mensch-spezifische MiR-941-1 Vorläufer- 20 und der Schwamm, eine verschlüsselte ShRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), waren auch in AaeDV als Negativkontrolle subcloned.
<ol><li>Verbinden die Pre-MiRNA, Schwamm, ShRNA oder eine Expressionskassette AmiVTP in Hpa I Seite der AaeDV NS1-kodierende Region im pUCA Plasmid Rückgrat wie beschrieben im Protokoll Schritt 2,4 bis 2,7.</li>
	<li>Verwandeln sich die DNA in Stbl3 kompetenten E. Coli-Zellen und wählen Sie einen positiven Klon wie beschrieben im Schritt 2,8 bis 2.10.</li>
	<li>Im Anschluss an diese, entziehen die Bakterienzellen mit einem Maxi Prep Kit nach dem Hersteller der rAaeDV Plasmid &#39; Anweisungen s. 
	Hinweis: Für rAaeDV DNA-Transformation, unerwünschte ITR Rekombination zu minimieren sollten Stbl3 oder Stbl4 E. Coli Zellen genutzt werden. Maxi Vorbereitung sollte verwendet werden, um das Plasmid rAaeDV um eine große Menge an DNA zu erhalten zu extrahieren (&#62; 100 µg). Vor der Generierung des Virus, die Sequenz-Integrität des Plasmids rAaeDV sollte immer durch DNA-Sequenzierung 21 analysiert werden.</li>
</ol> 4. Transfecting C6/36 Zellen mit rAaeDV Plasmide <ol><li>Kultur C6/36 Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin in einem Inkubator 28 ° C.</li>
	<li>Am Tag 0, Platte Zellen in zehn 25 cm 2 Kulturflaschen 18-20 h vor Transfektion durch die Spaltung von 90-95 % konfluierende Zellen in einer Verdünnung von 1:2. 
	Hinweis: Tag 1, die Zellen sollten erreichen 90-95 % Zusammenfluss.</li>
	<li>Am 1. Tag, transfizieren die Zellen mit der Serie rAaeDV Plasmide 22.
	<ol><li>10 µg DNA in 600 µL RPMI-1640 Medium in einem Microcentrifuge Schlauch zu verdünnen und vorsichtig mischen. Unterdessen bereiten 600 µL RPMI-1640 Medium und 25 µL Transfection Reagens pro Transfektion.</li>
		<li>Inkubation für 5-10 min bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie dann 625 µL des Gemisches 1640-Transfection Reagens, das 1640-Plasmid-DNA-Gemisch.</li>
		<li>Inkubieren Sie diese Mischung für 20-30 min bei RT Vor Transfektion, waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL RPMI-1640 Medium.</li>
		<li>Nach RT Inkubation (Schritt 4.3.3), 25 cm 2 Kultur Kolben the1640-Transfection Reagens DNA Plasmid Mischung hinzu und inkubieren Sie für 6 h bei 28 ° c</li>
		<li>Bei ca. 6 h nach Transfektion, entfernen die Transfektion Medien, waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL RPMI-1640 Medium, und fügen Sie RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS. 
		Hinweis: rAaeDV zeigt hohe Rate der Infektion (95 %) in Ae. Albopictus Larven, aber nach unserer Erfahrung in fast 50 % der infizierten Larven, die Infektion beschränkte sich auf Primärinfektion Websites (z.B. anal Papillen und Borsten Zellen) ohne Verbreitung 23. Wenn besteht die Notwendigkeit, Larven in mehrere Gewebe zu infizieren, sollte ein defektes rekombinantes Virus mit dem Ausdruck fluoreszierenden Proteins Co-infizierte ermöglichen die Visualisierung der Infektion Websites daher. Zum Beispiel um defekte rekombinanten Virus mit dem Ausdruck DsRed zu produzieren, sollte p7NS1-DsRed Co transfected mit einem Helfer-Plasmid in C6/36 Zellen nach dem oben beschriebenen Verfahren werden (die Cotransfection-Konzentration-Verhältnis sollte 2:1).</li>
	</ol></li></ol> 5. Ernte rAaeDV Virionen aus transfiziert C6/36 Zellen <ol><li>Ernten der Zellen 5 Tage nach Transfektion. Verdrängen und die Zellen in den Gerichten durch eine 5 mL Glas Pipette Pipettieren rauf und runter mit dem Kulturmedium auszusetzen. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen auf sterile 15-mL-Tuben.</li>
	<li>Einfrieren bei-80 ° C oder in einem Trockeneis/Ethanol-Bad für 30 min und dann Auftauen bei 37 ° C. Vortex für 1 min. die Gefrier-Tau-Prozedur 3 x wiederholen.</li>
	<li>Zentrifugieren die Probe bei 4.800 x g für 20 min bei 4 °C.Collect überstand und entsorgen das Pellet. Dann übergeben Sie des Überstands durch einen 0,22 µm Einwegspritze Filter. Aliquoten und laden die endgültige gereinigte Virion Aktien bei-80 ° c 
	Hinweis: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-wechseln.</li>
</ol> 6. Quantifizierung der rAaeDV <ol><li>Vorbereitung der DNA-Normen. Alle rAaeDV-Plasmide mit Hpa linearisieren ich, und reinigen die verdauliche Produkte mit einem Gel Extraction Kit 24.</li>
	<li>Die absolute quantitative Standardkurve zu konstruieren und messen die Titer der Virus nach der zuvor beschriebenen Methoden 25.</li>
</ol> 7. Mosquito Transduktion <ol><li>Wash 100 1 St Instar Ae. Albopictus Larven dreimal mit entionisiertem Wasser, und übertragen Sie anschließend die Larven in ein Becherglas mit 95 mL entionisiertem Wasser. Geben Sie 5 mL der rAaeDV Aktien (Endkonzentration von 1,00 x 10 10 Kopien/mL).</li>
	<li>Brüten für 24 h bei 28 ° C, die Larven drei Mal mit entionisiertem Wasser zu waschen, und übertragen Sie dann die Larven zurück auf die Platten und regelmäßig zu ernähren.</li>
	<li>Überwachen die Ziel-gen-Expression in die Larven mit qPCR oder Western-Blot (Vertreter Ergebnisse, in den Figuren 3 und 4 angezeigt werden). 
	Hinweis: Die Fluoreszenz Signal Erkennungsmethode kann verwendet werden, um die infizierten Larven genauer zu isolieren. Beispielsweise um fluoreszierende Signale von Larven infiziert mit rekombinanten Virus mit dem Ausdruck DsRed zu erkennen, können die Larven auf eine Konkavität Folie gelegt und beobachtet unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop alle 8 Std. bis 2 Tage nach der Infektion. Sobald fluoreszierende Larven entdeckt werden, sollten sie in Kunststoff Einzeltest Tassen für anschließende kontinuierliche Beobachtung ermöglichen getrennt werden. Larven mit mehreren Gewebe infiziert mit dieser Methode identifiziert werden können.</li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.cppah.com/article/S1538-5442(09)00014-5/fulltext">Mosquito-borne diseases.</a> Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).</li>
<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).</li>
<li>Roberts, D. R., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+issues+in+vector-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance issues in vector-borne disease control.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).</li>
<li>Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risks+on+the+backs+of+the+poor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing risks on the backs of the poor.</a> Nature medicine. 6, 729-731 (2000).</li>
<li>Volohonsky, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+the+Anti-parasitic+Factor+TEP1+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS pathogens. 13, 1006113(2017).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature communications. 5, 3977(2014).</li>
<li>Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+rabbit+out+of+the+hat%3A+Radiation%2C+transgenic+and+symbiont-based+approaches+for+sustainable+management+of+mosquito+and+tsetse+fly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+tropica%22%5BJournal%5D)">More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations.</a> Acta tropica. 157, 115-130 (2016).</li>
<li>Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvised+microinjection+technique+for+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Improvised microinjection technique for mosquito vectors.</a> The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).</li>
<li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+science%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> Journal of insect science. 13, (Online) 69(2013).</li>
<li>Ward, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+transducing+densovirus+pathogenesis+and+expression+in+Aedes+aegypti+and+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae.</a> Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).</li>
<li>Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densoviruses+for+control+and+genetic+manipulation+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+virus+research%22%5BJournal%5D)">Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes.</a> Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).</li>
<li>Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+the+Aedes+albopictus+parvovirus+%28AaPV%29%2C+a+denso-like+virus%2C+for+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes.</a> Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+non-defective+recombinant+densovirus+vectors+for+microRNA+delivery+in+the+invasive+vector+mosquito%2C+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus.</a> Scientific reports. 6, 20979(2016).</li>
<li>Ortega, M. M., Bouamar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+Designing+MicroRNA+Sponges%3A+From+Construction+to+Stable+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line.</a> Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).</li>
<li>BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/">http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/</a> (2017).</li>
<li>GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e253(2007).</li>
<li>Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densovirus+of+Aedes+aegypti+as+an+expression+vector+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells.</a> Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).</li>
<li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+human-specific+microRNA+miR-941%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Evolution of the human-specific microRNA miR-941.</a> Nature communications. 3, 1145(2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).</li>
<li>Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+AeDNA+containing+the+insect-specific+toxin%2C+BmK+IT1%2C+displayed+an+increasing+pathogenicity+on+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).</li>
<li>Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serious+overestimation+in+quantitative+PCR+by+circular+%28supercoiled%29+plasmid+standard%3A+microalgal+pcna+as+the+model+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene.</a> PloS one. 5, 9545(2010).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Es ist wichtig, zwei der wichtigsten Hindernisse zu überwinden, die rAaeDV Konstruktion zu begrenzen. Die erste ist die Produktion von defekten rekombinanten Virus. Es wurde berichtet, dass MDV als ein Vektor angemessen zum Ausdruck bringen fremde Gene, wie Skorpion Insekt-spezifische neurotoxins20 und das GFP-Protein Größe verwendet werden kann; aber unabhängig von der Aufbau-Strategie, können nicht sobald die ORFs MDV eingefügt oder mit exogenen Gene ersetzt Virionen selbständig bilden, wenn ein Helfer Plasmid cotransf...

Moskitos übertragenen Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, Zika-Fieber und Gelbfieber, sind große internationale öffentliche Gesundheitsprobleme, die weiterhin ein beträchtlicher Teil des globalen Infektionskrankheit Last1,2ausmachen. Herkömmliche Insektizide, die als Reaktion auf Vektoren verwendet wurden, sind ein wichtiger Bestandteil des nachhaltigen integrierten Moskito Regelstrategie für die Prävention von Moskitos übertragenen Krankheiten. Aber erwiesen solche Strategien sich als relativ unwirksam oder nicht wünschenswert aufgrund der damit verbundenen negativen Umweltauswirkungen sowie die Entwicklung von Resistenzen in Mücke Bevölkerung3,4. Aus diesen Gründen gibt es ein dringender Bedarf an alternativen Methoden der Mücke, Kontrolle und die Verwendung von transgenen Methoden, sterile männliche Mücken zu produzieren und die Freigabe der Erreger resistent Mücken entstanden als viel versprechende neue Bekämpfungsstrategien. Entwickeln wirksame neue control-Methoden, wie sichere und wirksame Ansätze zur in-Vivo -gen Lieferung, die umfassende Analyse der Genfunktion Moskito ist erforderlich.
Direkte Mikroinjektion von Plasmid DNA, doppelte stranded RNA (DsRNA) oder kleine interferierende RNA (SiRNA) ist die am häufigsten verwendeten in Vivo gen Übermittlungsmethode in Mücken. In der Tat die Herstellung transgener Linien von Mücken noch verlassen sich auf einen Prozess der Embryo Mikroinjektion5,6,7. Mikroinjektion hat jedoch einige Einschränkungen. Zuerst, diese Technik ist technisch anspruchsvoll und komplizierte Verfahren beinhaltet. Zweitens verursacht Injektion eine körperliche Beleidigung des Embryos, Larven, Puppen und Erwachsenen, die direkten Einfluss auf die Lebensfähigkeit des Zielorganismus. Drittens ist es schwierig, Mückenlarven für die Mikroinjektion zu immobilisieren, weil die meisten in einem aquatischen Lebensraum leben und besitzen eine charakteristische Bewegung zappelt. Viertens ist die Größe der 1St-2Nd Instar Larven 10 bis 20 Mal kleiner als die 4th Instar und älteren Larven und die Nagelhaut der erstere empfindlicher sind. Diese Funktionen machen es schwierig, 1St-2Nd Instar Larven im Vergleich zu denen in älteren Stadien zu manipulieren. Kombiniert, tragen diese Faktoren zu einer reduzierten nach der Injektion Überlebensrate für Larven (ca. 5 %) im Vergleich zu Erwachsenen8. Viral-basierte Systeme wurden entwickelt, um die damit verbundenen extrazellulären und intrazellulären Barrieren zu überwinden. Diese Systeme haben den Vorteil der einfachen Handhabung, hohe Transduktion Effizienz, langfristige und stabile Ebenen des Ausdrucks und die Fähigkeit, dauerhafte Effekte in Vivozu produzieren. Daher verwendet gen, die Nutzung der Retroviren, Lentiviren und Adenoviren-Delivery-Systeme weit verbreitet gewesen sein Inmammalian Zelllinien und Modell-Arten. Sindbis Virus Expressionssystems hatte früher die Genfunktion in der Erwachsenmoskito zu analysieren; Neben der biologischen Sicherheit Bedenken ist die Injektion noch ein notwendiger Prozess für virale Infektion9. Obwohl die mündlichen Lieferung durch Larven in der DsRNA-Lösung einweichen vorher als möglich Lieferung Methode berichtet worden ist, ist es für kleine RNA Funktion Analyse10ungeeignet. Also, müssen wirksame virale Liefermethoden für Mücken noch entwickelt werden.
Moskito-Densoviruses (MDVs) sind Teil der Unterfamilie Densovirinae Parvoviridaeund alle außer einem Fall innerhalb der Gattung Brevidensovirus11. MDV Virionen sind unbehüllte und bestehen aus einem Genom einzelsträngiger DNA (SsDNA) und einem ikosaedrischen Kapsid (20 nm im Durchmesser). Das virale Genom ist etwa 4 kb groß und wird in den Kernen der Wirtszellen repliziert. MDVs sind relativ stabil in der Umgebung und zeigen einen schmalen Wirtsspektrums mit hoher Spezifität für Moskitos. Diese Viren haben das Potenzial, zu verbreiten und natürlich in Moskito-Populationen bestehen und fast allen Organen und Geweben von diesen Insekten, darunter den Mitteldarm Malpighian Tubuli, fetten Körper, Muskulatur, Neuronen und Speicheldrüsen12eindringen können.
Intakte MDV Genome können in Plasmid-Vektoren, Plasmid-basierte infektiöse Klone produzieren subcloned; Wenn diese Klone in Mücke Zellen geliefert werden, das virale Genom wird gewonnen aus dem Plasmid-Vektor und infektiöse Viruspartikel produziert. Da MDV eine kleine SsDNA Genom hat, kann infektiöse Klone sind leicht gebaut und das virale Genom leicht manipulierbar11,13. Diese Eigenschaften machen MDV ein wertvolles Mittel für die Prüfung von Moskito-Biologie. Da fast alle das virale Genom-Sequenz ist unerlässlich für die virale Verbreitung, die Schaffung von rekombinanten Virus durch den Ersatz oder Einbau von fremden Genen verursacht jedoch einen Verlust in virale Verpackung und/oder Replikation Fähigkeiten schafft eine Hindernis für die Entwicklung der MDVs gen Lieferung Vektoren. Hier berichten wir mit einer künstlichen intronischen kleine RNA-Ausdruck-Strategie eine mangelfreie rAaeDV in Vivo RNA-Delivery-System zu entwickeln, die hat die Vorteile der einfachen Plasmid Bau und die Wartung eines funktionalen Virus, die produzieren kann stabile und langfristige Ausdruck in Wirtszellen ohne die Notwendigkeit der Wildtyp Virus. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für die einfache Transduktion von Larven.
Die Protokolle für die folgenden Schritte werden in dieser Studie beschrieben: (1) Design der Codierung eine intronischen kleine RNA Expressionskassette, 2) die Produktion von rekombinanten Virus-Partikel mit der Verpackung Zelle C6/36 rAaeDVs Linie, Quantitative Analyse (3) der zellfreien rAaeDV Genom kopieren Zahlen und 4) Infektion von Ae. Albopictus Larven durch direkte Einschleppung des Virus in den Wasserkörper des larvalen Lebensraums. Insgesamt zeigte diese Arbeit, dass bestimmten kleinen RNAs oder Zielgene überexprimiert oder klopfte in Mückenlarven mit den entwickelten MDV-Delivery-System.

<table><tbody><tr><td>Zentrifugenmaschine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugensystem</td><td>Beckman Schar</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Gel-Extraktionskit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigter Agar</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>FastAP Thermosensitive alkalische Phosphatase (1 μμ; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaIThermo</td> <td>Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase (5 U/&Mikro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 Chemisch kompetente Zelle</td><td>Beijing Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von einem rekombinanten moskito densovirus als gen lieferung vektor für die funktionelle analyse von genen in mückenlarven

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In Vivo Mikroinjektion ist die am häufigsten verwendeten Gen Übertragung Technik für die Analyse der Genfunktionen in einzelne Mücken. Allerdings ist diese Methode erfordert eine technisch anspruchsvollere Betrieb und beinhaltet komplizierte Verfahren, besonders beim Einsatz in Larven aufgrund ihrer geringen Größe, relativ dünne und empfindliche Nagelhaut und hohe Sterblichkeit, die ihre Anwendung einschränken. Im Gegensatz dazu wurden virale Vektoren für gen-Lieferung entwickelt, um die extrazelluläre und intrazelluläre Barrieren zu überwinden. Diese Systeme haben den Vorteil der einfache Handhabung, hohe gen Transduktion Effizienz, langfristige Erhaltung der Genexpression und die Fähigkeit, dauerhafte Effekte in Vivozu produzieren. Moskito-Densoviruses (MDVs) sind Moskito-spezifische, kleine einzelsträngigen DNA-Viren, die effektiv ausländische Nukleinsäuren in Mücke Zellen liefern können; den Ersatz oder die Einfügung von Fremdgenen rekombinante Viren erstellen in der Regel verursacht jedoch einen Verlust von Verpackung und/oder Replikation Fähigkeiten, der ein Hindernis für die Entwicklung dieser Viren als Vektoren der Lieferung ist.
Hier berichten wir mit einer künstlichen intronischen kleine RNA-Ausdruck-Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Modalitäten für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren und Larven Infektion werden beschrieben.
Diese Studie zeigt zum ersten Mal die Möglichkeit der Entwicklung eines mangelfreien rekombinante MDV micro RNA (MiRNA) Ausdruck, und so bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die funktionelle Analyse von Genen in Mücke und eine Grundlage für die Anwendung des viralen Paratransgenesis zur Steuerung von Moskitos übertragenen Krankheiten. Wir gezeigt, dass Aedes Albopictus 1St Instar Larven infiziert sein könnte durch die Einführung des Virus in den Wasserkörper der Larven Zucht Website einfach und effektiv und entwickelte rAaeDVs verwendet werden könnte, um overexpress oder niederzuschlagen die Ausdruck eines bestimmten Ziel-Gens in Larven, und ein Tool für die funktionelle Analyse von Moskito Gene anbieten.

Strategien für rAaeDV Bau Ein defekten rAaeDV Vektor wurde generiert, um die DsRed gen in Mückenlarven exprimieren. Die daraus resultierende Plasmid enthalten eine NS1-DsRed Fusion Protein Kassette mit dem VP-Protein gelöscht (Abb. 1A). rAaeDV Plasmide mit Ausdruck Konstrukte für MiRNA, wurden MiRNA Schwamm, ShRNA und AmiRNA (dargestellt in Abbildung 1B) ausgelegt. Zum Beispie...

Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genfunktion von Mückenlarven mithilfe eines rekombinanten Mückendensovirus als Genübertragungssystem zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in virusbasierten Abgabesystemen zu beantworten, beispielsweise wie die damit verbundenen extrazellulären und intrazellulären Barrieren überwunden werden können. Die wichtigsten Vorteile dieser Techniken sind eine einfache Handhabung, eine hohe Transduktionseffizienz, langfristige und robuste Expression sowie die Fähigkeit, persistierende Effekte in vivo hervorzurufen.Diese Arbeit zeigte, dass spezifische kleine RNAs oder Zielgene in Mückenlarven überexprimiert oder herunterreguliert werden können, unter Verwendung des entwickelten Densovirus-Transportsystems. Die Bedeutung dieser Technik erweitert die Anwendung der beschriebenen Expressionsstrategie zur Erforschung der Mückenbiologie, da diese Methode eine einfache Transduktion von Larven ermöglicht. Die Durchführung des Verfahrens wird Pei-Wen Liu, eine Doktorandin aus unserem Labor, demonstrieren.Beginnen Sie mit der Beauftragung der chemischen Synthese von vollständigen cDNA-Sequenzen für die präkursorischen miR

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll zeigt eine Methode, mit der James-Labor verwendet werden, um dsRNA in weibliche A. aegypti Moskitos, die Dengue-Virus Hafen zu injizieren. Die Technik für die Kalibrierung von Injektionsnadeln, die Manipulation der Injektion Setup, und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Die Injektion von dsRNA in Female A. aegypti Mosquitos

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

In diesem Interview, konzentriert sich George Dimopoulos auf die physiologischen Mechanismen von Mücken verwendet werden, um Plasmodium falciparum und Dengue-Virus-Infektionen zu bekämpfen. Erklärung dafür, wie Schlüssel feuerfesten Gene gegeben ist, sind die Gene, die Resistenz gegen Pathogene Vektor, in der Mücke identifiziert und wie dieses Wissen genutzt, um transgene Moskitos, die nicht in der Lage, die Malaria-Parasiten oder Dengue-Virus in sich tragen sind zu generieren.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

Oligonukleotide können die Besucher genutzt werden speziell Ersatz eines einzelnen Nukleotids von transfizierten Zielgene in...

Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide

In diesem Protokoll kombinieren wir RNAi-vermittelte Gen-Silencing mit...

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

In diesem Video demonstrieren wir die Verabreichung des Gene-Drive-Konstrukts in den Embryo der Anopheles gambiae Mücke durch die Mikroinjektionstechnik des Embryos. Dieses Verfahren ermöglicht die Integration des gelieferten DNA-Konstrukts durch homologe Rekombination in die Keimbahnzellen, um eine transformierte Mückenpopulation zu erzeugen.

Mikroinjektion von Mückenembryonen: Eine Technik zur Verabreichung exogener DNA in das Eigelb des Embryos von Anopheles gambiae, um Keimbahnmutationen zu erzeugen

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroinjektion Methodik, die wir standardisiert und für mehrere Jahre verwendet, um bestimmte Mengen von Nukleinsäuren liefern direkt an die Hämolymphe von Mücken und Stubenfliegen. Dieses Protokoll führt zu minimalen Injektion Sterblichkeit und ermöglicht Dosismessungen korreliert der Fruchtbarkeit.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Das bipartite GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges Werkzeug zur Modifikation der Genexpression in kontrolliert raumzeitlicher Weise, das eine funktionelle genetische Analyse in Anopheles gambiae ermöglicht. Die beschriebenen Verfahren für die Verwendung dieses Systems sind eine semi-standardisierte Klonierungsstrategie, Sexing und Screening von Puppen auf fluoreszierende Proteinmarker und Embryofixierung.

Einsatz des GAL4-UAS-Systems für die funktionelle Genetik bei Anopheles gambiae

Erfahren Sie die Analyse von Genfunktionen in Mückenlarven mit rekombinantem Aedes aegypti Densovirus als Gentransfersystem. Diese Methode ermöglicht effiziente Überexpression oder Knockdown spezifischer Gene in vivo.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven (Video) | JoVE Journal

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

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