Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genfunktion von Mückenlarven mithilfe eines rekombinanten Mückendensovirus als Genübertragungssystem zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in virusbasierten Abgabesystemen zu beantworten, beispielsweise wie die damit verbundenen extrazellulären und intrazellulären Barrieren überwunden werden können. Die wichtigsten Vorteile dieser Techniken sind eine einfache Handhabung, eine hohe Transduktionseffizienz, langfristige und robuste Expression sowie die Fähigkeit, persistierende Effekte in vivo hervorzurufen.

Diese Arbeit zeigte, dass spezifische kleine RNAs oder Zielgene in Mückenlarven überexprimiert oder herunterreguliert werden können, unter Verwendung des entwickelten Densovirus-Transportsystems. Die Bedeutung dieser Technik erweitert die Anwendung der beschriebenen Expressionsstrategie zur Erforschung der Mückenbiologie, da diese Methode eine einfache Transduktion von Larven ermöglicht. Die Durchführung des Verfahrens wird Pei-Wen Liu, eine Doktorandin aus unserem Labor, demonstrieren.

Beginnen Sie mit der Beauftragung der chemischen Synthese von vollständigen cDNA-Sequenzen für die präkursorischen miRNAs, miRNA-Sponges und shRNA, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Nach Erhalt der bestellten DNA drehen Sie die Röhrchen mit den DNA-Blöcken, um sicherzustellen, dass sich die gesamte getrocknete DNA am Boden des Röhrchens befindet. Lösen Sie anschließend die DNA in DNase-freiem Wasser unter Erzielung einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Mikroliter.

Fügen Sie sechs Mikroliter XbaI hinzu, um das Plasmid-Backbone und die cDNA-Sequenzen zu verdauen, und setzen Sie die Reaktion eine Stunde lang auf 37 Grad Celsius. Dephosphorylieren Sie anschließend die Fünf-Prim-Enden des linearisierten Plasmid-Backbones mit kalb-intestinalem alkalischen Phosphatase gemäß den Herstelleranweisungen. Für eine effiziente Verpackung darf die Genomgröße 4.400 Nukleotide nicht überschreiten, was 110 % der Länge des Wildtyp-Mückendensovirusgenoms entspricht, oder intronische microRNA-Expression darf aus nicht mehr als 400 Nukleotiden bestehen, die in das Aedes aegypti-Genom eingeführt werden können.

Als Nächstes die alkalische Phosphatase bei 65 Grad Celsius hitzeinaktivieren. Anschließend die DNA auf einem 1 %igen Agarosegel laufen lassen und das linearisierte Backbone schneiden. Die DNA aus dem Gelschnitzel unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits gemäß den Herstelleranweisungen extrahieren.

Nach der Isolierung ligieren Sie das DNA-Fragment unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in das Vektorskelett. Anschließend transformieren Sie die Produkt der Ligationsreaktion mittels Hitzeschock in kompetente DH5-alpha E.coli-Zellen. Impfen Sie die transformierten Bakterien auf eine LB-Agarplatte, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält.

Am nächsten Tag eine einzelne Kolonie von der Platte entnehmen und eine Starterkultur mit drei Milliliter angereichertem Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält, ansetzen. Schließlich die Plasmid-DNA aus der Bakterienkultur mittels eines Miniprep-Kit gemäß den Herstelleranweisungen isolieren. Eine Probe der DNA zur Sequenzierung an ein DNA-Sequenzierungsunternehmen schicken.

Ligieren Sie die prä-miRNA oder shRNA in die HpaI-Stelle der AaeDV NS1-Kodierregion im pUCA-Plasmid-Backbone unter Verwendung der Methoden, die für die künstliche intronische Expressionskassette für kleine RNA gezeigt wurden. Anstelle von DH5-alpha-Zellen transformieren Sie die DNA in kompetente Stbl3 E.coli-Zellen. Danach plattieren Sie die transformierten Zellen auf eine LB-Agarplatte, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält, und stellen eine Starterkultur aus einem positiven Klon her. Extrahieren Sie danach das rAaeDV-Plasmid aus den bakteriellen Zellen unter Verwendung eines Maxiprep-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Am Tag null teilen Sie 90 bis 95 % konfluente Flaschen mit C6/36-Zellen im Verhältnis 1 zu 2 auf 10 T-25-Kulturflaschen auf. Inkubieren Sie die Flaschen 18 bis 20 Stunden bei 28 Grad Celsius, bis sie erneut 90 bis 95 % Konfluenz erreichen.

Am ersten Tag transfizieren Sie die Zellen mit den hergestellten rAaeDV-Plasmiden. Mischen Sie hierzu 10 Mikrogramm DNA in 600 Mikroliter RPMI-1640-Medium und rühren die Lösung vorsichtig um. Bereiten Sie in der Zwischenzeit pro Transfektion 600 Mikroliter RPMI-1640-Medium und 25 Mikroliter Transfektionsreagenz vor.

Inkubieren Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur mit der DNA. Anschließend geben Sie 625 Mikroliter der RPMI-1640-Transfektionsreagenz-Mischung zur Plasmid-DNA-Mischung hinzu und inkubieren diese Mischung 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit RPMI-1640-Medium und geben dann die Transfektionsmischung zu jedem der T-25-Kulturkolben hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen sechs Stunden lang bei 28 Grad Celsius in der Transfektionsmischung. Entfernen Sie nach sechs Stunden das Transfektionsmedium, waschen Sie die Zellen zweimal mit je fünf Milliliter RPMI-1640-Medium und geben Sie anschließend frisches RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS hinzu. Fünf Tage nach der Transfektion lösen Sie die Zellen mithilfe einer fünf Milliliter fassenden Glaspipette durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit dem Kulturmedium von der Unterlage und suspendieren Sie in der Platte.

Überführen Sie die Zellsuspensionen aus jedem Kolben in jeweils eigene sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Um ein Virus mit hoher Schwellenwertabhängigkeit zu gewinnen, ist es notwendig, die Zellen fünf Tage nach der Transfektion weiterzukultivieren. Gefrieren Sie die einzelnen Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius oder in einem Trockeneis-Ethanol-Bad für 30 Minuten ein.

Dann tauen Sie sie bei 37 Grad Celsius schnell auf und wirbeln die Zellsuspension eine Minute lang im Vortex. Danach sammeln Sie das Überstand von der zentrifugierten Probe und verwerfen das Pellet. Anschließend lassen Sie den Überstand durch einen sterilen Einweg-Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern laufen.

Aliquotieren und lagern Sie die endgültigen gereinigten Virionenbestände bei minus 80 Grad Celsius. Waschen Sie 100 erstinstarre A. albopictus-Larven dreimal mit entionisiertem Wasser. Anschließend überführen Sie die Larven in einen Becher, der 95 Milliliter entionisiertes Wasser enthält.

Geben Sie fünf Milliliter der rAaeDV-Stämme hinzu und inkubieren Sie die Larven 24 Stunden bei 28 Grad Celsius. Für einen erfolgreichen Larvenbefall ist es entscheidend, dass die Larven 24 bis 36 Stunden mit den Infektionsviruspartikeln in Kontakt bleiben, um hohe Infektionsraten sicherzustellen. Nach der Inkubation waschen Sie die Larven dreimal mit entionisiertem Wasser und überführen Sie sie anschließend zurück in die Platten. Füttern Sie die Larven regelmäßig. Überwachen Sie den Expressionsgrad des Zielgens in den Larven mittels quantitativer PCR oder Western Blot unter Verwendung standardisierter Techniken.

In diesem Beispiel wurden 100 Larven des ersten Instars auf ihre endogene miRNA-Expression nach Infektion mit dem rekombinanten Virus, das das aal-let-7-Expressionskassette enthält und eine Überexpression zeigt, analysiert.

Die Effizienz des Anti-let-7-Konstrukts ist rechts dargestellt und unterstreicht dessen Knockdown-Fähigkeiten. Um die Knockdown-Effizienz der rAaeDV-Vektoren hinsichtlich der V-ATPase-mRNA zu überwachen, wurden insgesamt 100 Larven im ersten Instar-Stadium mit gleichen Mengen unterschiedlicher rAaeDV-Typen behandelt, indem das Virus dem Wasser des Larvenhabitats zugesetzt wurde. Die V-ATPase-mRNA-Spiegel wurden signifikant durch einen miRNA-exprimierenden rAaeDV sowie durch einen intronischen shRNA-exprimierenden rAaeDV vermindert.

Unsere Ergebnisse bestätigen eine intronische Expressionsstrategie, die ein neues Paradigma darstellt und die Beschränkungen von Mücken-Densoviren mit defektem Genom überwinden kann, um die effiziente Einführung fremder Gene in Mücken zu ermöglichen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass ein intronisches Mikro-RNA-Expressionskassette von nicht mehr als 400 nt in das Genom von Aedes aegypti-Densovirus eingefügt werden kann. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forschungsarbeiten zur Herstellung nicht-defekter rekombinanter Mücken-Densoviren, die Mikro-RNAs überexprimieren oder herunterregulieren und so die Analyse der Funktion von Mückengenen ermöglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das entwickelte Mücken-Densovirus-Übertragungssystem nutzen können, um die Genfunktionen in Mückenlarven zu analysieren.