Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, korrekte Hypophysen-Koronalschnitte mit gut erhaltenen Gewebearchitekturen von sich entwickelnden Mäusen zu erhalten. Dieses Verfahren kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Hypophysenentwicklung zu beantworten, wie z. B. Hypophysenhistologie, Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sich entwickelnde murine Hypophysen ohne sichtbare Schädigung präpariert und richtig ausgerichtet werden können, um koronale Schnitte zu erzielen.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass es für die Entwicklung von murinen Hypophysen technisch schwierig war, geeignete koronale Schnitte zu erhalten. Nachdem Sie die Mäuse gemäß dem Textprotokoll betäubt und fixiert haben, schneiden Sie den Schädelknochen mit einer Schere auf. Heben Sie dann mit einer Pinzette das Hinterhirn vorsichtig von der Schädelbasis an.

Dann, beim ersten Anzeichen der sella turcica, hören Sie auf zu heben, sondern halten Sie das Hinterhirn fest und schneiden Sie mit einer feinen Schere den Hypophysenstiel und die Nervenfasern, die mit der Basis des Gehirns verbunden sind. Fahren Sie fort, das gesamte Gehirn anzuheben und zu entfernen, um die Hypophyse vollständig freizulegen. Die Hirnanhangdrüse ruht auf der dorsalen Oberfläche des Keilbeins und ist lateral von Trigeminusnerven umgeben.

Schneiden Sie dann mit einer Schere die gesamte Sellarregion einschließlich der Hypophyse, der lateralen Trigeminusnerven und unter dem Keilbein durch. Legen Sie das Gewebe in eine 35-mm-Schale mit 4 % PFA und inkubieren Sie es je nach Alter 40 Minuten bis 3 Stunden lang bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie dann 10 ml PBS, um das fixierte Gewebe für fünf Wechsel à 15 Minuten zu waschen.

Übertragen Sie das fixierte Gewebe in eine 35-mm-Schale, die 1 ml PBS enthält, und dissoziieren Sie unter einem Stereomikroskop die Hypophysen. Bei den Hypophysen P5 bis P14 entfernen Sie mit einer feinen Zange und einer Schere die Bindemembranen zwischen den Nerven und dem Knochen und isolieren die Hypophyse zusammen mit den lateralen Trigeminusnerven als Ganzes, wobei die Sella turcica belassen wird. Entfernen Sie bei P21 und erwachsenen Hypophysen die Nerven und Bindehäute um die Hypophyse und befreien Sie die Drüse vom umgebenden Gewebe.

Nach der Dehydratisierung, der Xylol-Klärung und der Wachsinfiltration, die gemäß dem Textprotokoll durchgeführt wurde, wird die Probe auf einem Gewebeeinbettungskonsolensystem aus der Kassette entnommen und in eine zur Hälfte mit geschmolzenem Paraffinwachs gefüllte Grundform gelegt. Verwenden Sie für P21 und erwachsene Hypophysen eine erwärmte feine Pinzette, um die Hypophyse mit ihrer kurzen Achse senkrecht zur Unterseite einer Basisform zu positionieren. Richten Sie bei P0 bis P4 Hypophysen die Proben mit ihren Keilbeinknochen senkrecht zur Unterseite einer Basisform aus.

Richten Sie bei den Hypophysen P5 bis P14 die Proben mit ihren Trigeminusnerven senkrecht zur Unterseite einer Basisform aus. Halten Sie das Gewebe nach dem Positionieren der Drüse mit einer erwärmten feinen Pinzette sanft in der gewünschten Position, bis das Wachs auf einer Kühlplatte halbfest wird. Füllen Sie die Form mit geschmolzenem Paraffinwachs auf.

Lassen Sie den Paraffinblock abkühlen, bis das Wachs vollständig erstarrt ist. Kühlen Sie den Paraffinblock 10 bis 20 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius, schneiden Sie ihn dann mit einem Mikrotom in dünne Scheiben und stimmen Sie die Position des Paraffinblocks während des Schneidens fein ab. Führen Sie die Immunmarkierung gemäß dem Textprotokoll durch.

Wie hier gezeigt, wurde zur Präparierung der Hypophyse von der neugeborenen Maus die gesamte Sellarregion, die die Hypophyse, die Trigeminusnerven und den darunter liegenden Keilbein enthält, aus der Schädelbasis präpariert. Die winzige und empfindliche Hypophyse blieb während des Prozesses intakt. Bei Mäusen, die älter als fünf Tage waren, wurden die Hypophysen, die an den lateralen Trigeminusnerven befestigt sind, isoliert.

Die Wachstumsstruktur der aus der P7-Maus isolierten Hirnanhangdrüse blieb gut erhalten. Hier gelang es, die Hirnanhangdrüse der P21-Maus ohne sichtbare Schädigung zu isolieren und gleichzeitig das umliegende Gewebe zu entfernen. In dieser Abbildung zeigt die H&E-Färbung von richtig ausgerichteten koronalen Schnitten eine gut erhaltene Morphologie sowohl der Adenohypophyse als auch der Neurohypophyse in den Hypophysen P0, P7 und P21.

Schließlich waren die prozessierten Objektträger auch mit der Immunfluoreszenzmarkierung kompatibel. Als Beispiel zeigten die Adenohypophyse und die Neurohypophyse eine spezifische Immunmarkierung von GH bzw. GFAP. Einmal gemeistert, kann der Prozess von der Dissektion bis zur Einbettung bei erwachsenen Mäusen in 7,5 Stunden durchgeführt werden und bei jüngeren Mäusen sogar noch weniger, wenn er richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die gesamte Sellarregion zu präparieren, um zu vermeiden, dass die Hypophyse mit chirurgischen Instrumenten berührt wird. Nach diesem Verfahren kann auch die Hypophyse, der kein Präfix vorangestellt wurde, isoliert werden. In diesem Fall ist mehr Vorsicht geboten, um unerwünschte Schäden zu vermeiden.

Auch die Drüse sollte so schnell wie möglich präpariert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Hypophyse der Maus präpariert und die Koronaschnitte der Hypophyse in verschiedenen Entwicklungsstadien vorbereitet.