Name: Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Lernen Sie die Präparation koronaler Schnitte der Hypophyse bei entwickelnden Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Erhaltung der Gewebearchitektur für histologische Analysen und Untersuchungen zur Zellentwicklung.

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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (31201086, 31470759 und 31671219) und Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900) unterstützt.

C57BL/6 Mäusen werden in bestimmten Pathogen-freies Bedingungen gezüchtet. Alle tierische experimentellen Methoden sind nach den Richtlinien von Animal Care und Ethikkommission medizinischen Universität zweiten Militär genehmigt.
 1. Dissektion der postnatalen Entwicklung Hypophyse <ol><li>Perform-Anästhesie: Neugeborene Mäuse (P0 - P5) auf zerstoßenem Eis induzieren Hypothermie zu platzieren. Injizieren Sie bei Mäusen, die älter als 5 Tage alt 5 % Urethan (30 µL/g Körpergewicht) intraperitoneal, um Anästhesie zu induzieren. Antworten zu Tail/Prisen Toe zu beurteilen. Gehen Sie erst, nachdem die Maus reagiert nicht auf die Schmerzreize ist.</li>
	<li>Sichern die Maus in die Rückenlage (mit Gesicht nach oben auf dem Rücken liegend) durch den Vorderpfoten vorsichtig abkleben und Hinterpfoten auf eine Arbeitsfläche, die in der Lage ist, merken (z.B. Styropor) innerhalb einer chemischen Dampfhaube.</li>
	<li>Transcardial Perfusion führen.
	<ol><li>Schneiden Sie den Maus-Brustkorb mit Chirurgische Scheren, das Herz (und anderen thorakalen Organe) verfügbar zu machen.</li>
		<li>Sichern das schlagende Herz mit stumpfen Pinzette und Nadel 26G (0,45 mm) in den linken Ventrikel. Die Nadel ist beigefügt, um eine 10 mL Spritze mit heparinisierten Phosphat gepufferte Kochsalzlösung gefüllt (PBS; ergänzt mit Natriumnitrit 5 mg/mL und 10 U/mL Heparin, pH 7,4, warm auf 37 ° C vor der Verwendung). Sofort den rechten Vorhof mit einer feinen Schere geschnitten und beginnen, den Körper mit den warmen PBS durchspülen, bis die Flüssigkeit verlassen den rechten Vorhof ist. 
		Hinweis: Ca. 5-10 mL PBS für Neugeborene Mäuse erforderlich ist und 10-20 mL PBS für Erwachsene Mäuse.</li>
		<li>Bewahren Sie die Nadel auf und ändern Sie in eine andere Spritze gefüllt mit 4 % Paraformaldehyd (PFA; pH 7,4). Perfundieren 10 mL und 20 mL Fixiermittel für Neugeborenen und P21 Maus bzw.. 
		Achtung: PFA ist giftig. Es kann Haut und Atemwege Irritationen und Schädigungen des Auges führen. Tragen Sie Handschuhe und arbeiten unter einem chemischen Haube.</li>
	</ol></li> <li>Enthaupten die PFA-behoben: Maus und mit einer Schere aufschneiden der Schädelknochen.
	<ol><li>Heben Sie vorsichtig das Hinterhirn aus der Schädelbasis mit kleinen Zangen. Bei den ersten Anzeichen von der Sella Turcica Stop zu heben, aber halt das Hinterhirn Hypophyse Stiel und Nervenfasern Anschluss an der Unterseite des Gehirns mit einer feinen Schere schneiden. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Hypophyse nicht entfernt mit dem Gehirn aufgehoben wird.</li>
		<li>Dann halten das Gehirn anheben und entfernen Sie das gesamte Gehirn um die pituitäre Drüse voll verfügbar zu machen. Schneiden Sie die gesamte Sella-Region einschließlich der Hypophyse (Hirnanhangdrüse), seitliche Trigeminal Nerven, und die unter Sphenoid Knochen mit einer Schere (ca. 3 x 5 mm 2).</li>
	</ol></li> <li>Setzen die sezierte Gewebe in einer 35 mm-Schüssel oder einen Brunnen von einem 6-Well-Platte mit 2 mL kalten 4 % PFA (pH 7,4). Fix das Gewebe bei 4 ° C für 40 min. für P0 - P7 Hypophysen, 1 h für P14 Hypophysen, 1,5 h für P21 - P28 Hypophysen und 3 h für Erwachsene Hypophysen.</li>
	<li>Weitere Dissoziation der Hypophyse <ol><li>waschen das fixierte Gewebe mit 10 mL PBS, 5 Änderungen, 15 min. Die neonatale Hypophyse zusammen mit seinen umliegenden Gewebe und die unter Sphenoid Knochen direkt an Dehydrierung verarbeitet werden können. Jedoch sollte Hypophysen von Mäusen, die älter als 5 Tage getrennt werden weiter unter einem Stereomikroskop.</li>
		<li>Setzen das fixierte Gewebe in einer 35-mm-Schale mit 1 mL PBS. P5 - P14 Hypophysen, entfernen Sie die Bindegewebe Membranen zwischen den Nerven und Knochen mit feinen Zangen und Scheren und isolieren Sie sorgfältig der Hypophyse zusammen mit seitlichen Trigeminal Nerven als Ganzes, sondern verlassen die Sella Turcica. Die isolierten Drüse und Nerven sind durch Bindegewebe Membranen mit verbunden eine &#34; H &#34;-wie aussehen ( Abb. 1 b).</li>
		<li>Für P21 und Erwachsenen Hypophysen, entfernen Sie die Nerven und Bindegewebe Membranen um die Hypophyse und die Drüse aus dem umliegenden Gewebe frei. Die Hypophyse Gewebe mit Linsenreinigung Seidenpapier einwickeln und steckte es in eine Einbettung Kassette. 
		Hinweis: Die winzige Hypophyse mit Linsenreinigung Seidenpapier einwickeln hilft zu verhindern den potenziellen Verlust von Proben und Gewebe Integrität in der folgenden Prozedur Paraffin einbetten. Es möglicherweise nicht notwendig, die Hypophyse umbrochen, wenn sie in einer kleinen Flasche in der Cryo-Einbettung Prozedur verarbeitet wird.</li>
	</ol></li></ol> 2. Paraffin einbetten und Berandungen <ol><li>entwässern die Exemplare in Kassetten mit 50 %, 65 %, 75 % und 95 % Ethanol Lösungen für 15 min einbetten. Anschließend mit 3 Änderungen von reinem Ethanol, 3 min für P0 - P4 Drüsen, 4 min P5 - P14 Drüsen und 5 min für P21 und ältere Drüsen zu entwässern. Klar, mit Xylol ändert 3, 3 min für P0 - P4 Drüsen, 4 min P5 - P14 Drüsen und 5 min für P21 und ältere Drüsen. Mit geschmolzenem Paraffinwachs, 3 Änderungen, 7 min. für P0 - P4 Drüsen infiltrieren und zweimal 8 min gefolgt von 6 min. einmal für P5 und ältere Drüsen. 
	Hinweis: Die optimale Parameter für die Verarbeitung von Gewebe können empirisch angepasst werden. Um qualitativ hochwertige Teile zu erhalten, sind unzureichend oder über Dehydrierung zu vermeiden. Das gleiche gilt für das clearing der Gewebe mit Xylol.</li>
	<li>Orientierung beim Einbetten von <ol><li>auf ein Gewebe einbetten Konsolensystem, entfernen Sie das Exemplar aus der Kassette und legen Sie sie in eine Basis Form halb gefüllt mit geschmolzenem Paraffinwachs. Korrekte Ausrichtung der einbettenden Hypophyse ist unerlässlich für die Befriedigung der koronalen Abschnitte.</li>
		<li>Für P21 und Erwachsenen Hypophyse, positionieren Sie die Hypophyse mit seinen kurzen Achse senkrecht zur Bodenfläche einer base Form (die Schnittebene). Verwenden Sie Sphenoid Knochen und Trigeminal Nerven als anatomische Landmarken für P0 - P4 und P5 - P14 Hypophysen, beziehungsweise. Exemplare mit ihrer Trigeminal Nerven oder transversale Lamina Sphenoid Knochen senkrecht zur Bodenfläche einer base Form orientieren.</li>
		<li>Sanft halten das Gewebe in der gewünschten Position mit erwärmten feinen Pinzette bis das Wachs auf einer Kühlplatte halbfeste wird. Füllen Sie die Form mit flüssigem Paraffin Wachs. Ermöglichen den Paraffinblock abkühlen lassen, bis das Wachs vollständig verfestigt wird. 
		Hinweis: Die Hypophyse an embryonalen Tag 18,5 (E18.5) kann in die gleiche Weise wie die Neugeborenen Hypophyse behandelt werden. Aber die Hypophysen (Rathke &#39; s Beutel) jünger als E16.5 sollte mit den ganzen Kopf eingebettet und, die sagittale Achse (vom Mund zum Hinterhauptbein) senkrecht zur Bodenfläche einer base Form ausgerichtet.</li>
	</ol></li> <li>Chill Paraffinblock bei-20 ° C für 10-20 min und dann schneiden Sie es in dünne Scheiben (4 µm Dicke wird bevorzugt) mit einem Mikrotom. Um zufrieden stellende koronalen Abschnitte zu erhalten, eine Feinabstimmung der Position der Paraffin-Blöcke beim Schneiden. Montieren Sie die Gewebe-Scheiben auf Polylysin-beschichtete Glasplatten, Ablösung der Scheiben in den folgenden Verfahren zu verhindern. 
	Hinweis: Alternativ Proben können werden dehydriert in 15 %, 30 % (W/V) Saccharose-Lösungen (mit PBS-Puffer) bei 4 ° C bis sie auf den Boden sinken, in Cryo-Einbettung Verbindung mit der gleichen Ausrichtung Methode eingebettet, und schnell auf Trockeneis eingefroren. Dann schneiden Sie die gefrorenen Gewebe Blöcke in Scheiben von 8-10 µm mit einem Kryostat. Die Morphologie der Cryo-Abschnitten, ist jedoch oft schlechter als Abschnitte paraffin.</li>
</ol> 3. H &#38; E Färbung und Immunfluoreszenz Beschriftung <ol><li>Warm die Folien bei Hitze blockieren bei 55 ° C und Wachsentfernung mit Xylol, 2 Änderungen, 4 min. Die Proben mit 95 % igem Ethanol zweimal und 75 % Ethanol zweimal, 3 min zu entwässern. Waschen Sie die Folien mit destilliertem Wasser für 5 min auf einen Shaker.</li>
	<li>Für H &#38; E Färbung, die Abschnitte in Alaun Hämatoxylin Lösung für 6 min. Fleck, Spülen in RunnIng Leitungswasser für 2 min, mit 0,2 % Ammoniak Wasser für 45 s und wieder abspülen unter fließendem Wasser für 2 min zu unterscheiden. Dann pausiert die Abschnitte mit 95 % igem Ethanol für 1 min und Fleck mit Eosin für 2 min. nacheinander zu entwässern, klar, und montieren.</li>
	<li><ol><li>Immunfluoreszenz Kennzeichnung behandeln die Abschnitte mit Methanol mit 3 % H 2 O 2 und 0,01 % NaN 3 für 20 min bei Raumtemperatur, endogene Peroxidasen zu inaktivieren. Abrufen von Antigenen durch Kochen Abschnitte im Abruf Puffer (1 mM EDTA und 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) in einem Schnellkochtopf für 2 min. inkubieren die Abschnitte mit blockierenden Puffer (5 % Ziegenserum in PBS) für 30 min bei 37 ° c</li>
		<li>Inkubieren Sie Abschnitte mit Kaninchen Anti-Wachstumshormon (GH) Antikörper (1:2, 000) oder Kaninchen Anti-glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Antikörper (1:2, 000) verdünnt in blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° c</li>
		<li>Abschnitte mit Sekundärantikörper (Ziege Anti-Kaninchen IgG-HRP, 1: 300 in blocking-Puffer) inkubieren 35 min bei 37 ° c</li>
		<li>Verstärken die Signale mit Biotinyl Tyramide (01:50 in Tris gepufferte Kochsalzlösung mit 0,3 % H 2 O 2) für 15 min bei Raumtemperatur und visualisieren mit Streptavidin-Alexa594 oder 488 (1: 300 in blocking-Puffer, 30 min, 37 ° C).</li>
		<li>Die Kernen mit DAPI (50 mg/L mit PBS-Puffer) für 5 min bei Raumtemperatur counterstain. 
		Hinweis: Es kann nicht das Signal mit Tyramide Signal Verstärkung (TSA) System zu verstärken erforderlich. Alternativ kann ein Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper verwendet werden, um das Signal zu visualisieren.</li>
	</ol></li> <li>Acquire Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit DAPI, Texas Red und FITC Filtersätze × 4/0,13 × 40/0,75 Ziele und 5,0-Megapixel-Kamera ausgestattet. Verwenden Sie die 360, 488 und 594 nm Laser-Wellenlängen für bildgebende DAPI, Alexa 488- und Alexa 594-gefärbten Abschnitte bzw.. Optimieren Sie die Laserleistung (0,8 diente in der Regel) und Belichtungszeit auf das gewünschte Niveau für jeden Kanal. Erfassen Sie das Abbild von Bild-Datenerfassungs-Software gesteuert und überlagern die Fluoreszenzbilder nachträglich über Bildverarbeitungs-Software.</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+pituitary+development%3A+signaling+and+transcriptional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li>
<li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li>
<li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li>
<li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li>
<li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size%2C+shape%2C+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li>
<li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li>
<li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion%3A+proliferation%2C+progenitors%2C+and+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li>
<li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li>
<li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+%28lit%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für die Entwicklung von murinen Hypophysen, wurde es technisch schwierig, geeignete koronalen Abschnitte aufgrund ihrer winzig und zerbrechlich Funktionen und anatomische Besonderheiten6,8zu erhalten. Einige Forschungsgruppen wählte somit Mitte sagittale Abschnitte, die Morphologie der embryonalen und neonatale Hypophyse11,12zu analysieren. Mitte-sagittale Abschnitt der Hypophyse kann aber auch zeigen vor...

Die Hirnanhangdrüse oder Hypophyse ist ein wichtiges endokrine Organ Sekretion von Hormonen, die wichtig für die Homöostase1,2. Anatomisch ist die Hypophyse eine '' Two-in-One'' Struktur bestehend aus der Neurohypophysis und der Adenohypophysis. Diese Teile haben unterschiedliche embryonale Herkunft und Funktion sehr unterschiedlich. Die Neurohypophysis ergibt sich aus der neuralen Ektoderm und sondert Oxytocin und Antidiuretic Hormon. Die Adenohypophysis stammt aus Rathkes-Tasche und ist verantwortlich für die Freisetzung von Hormonen wie Wachstumshormon, Prolaktin, Schilddrüsenhormone – Förderung, Follikel – Förderung Hormon, luteinisierendes Hormon, adrenokortikotropes Hormon, und Melanozyten – Förderung Hormon3,4,5.
Die pituitäre Drüse ruht auf der dorsalen Oberfläche des Sphenoid Knochens (Sella Turcica) des Schädels Maus und wird auf den Boden des Gehirns durch einen fragilen Stiel befestigt. Es ist seitlich umgeben von Trigeminal Nerven und anterior von der Optik Chiasmus6,7. Die Drüse hat eine längliche ovale Form mit seiner Längsachse senkrecht zu der Leiter. Auf der dorsalen Oberfläche können die Neurohypophysis und die Adenohypophysis leicht, mit dem ehemaligen Besatzungsmacht der dorsalen medialen Region und die letzteren, die sich seitlich und ventral abgegrenzt werden. Während der postnatalen Entwicklung steigt die Größe der Hypophyse im ersten Monat nach der Geburt8,9. Dennoch bleibt die Maus Hypophyse sehr klein mit einem durchschnittlichen Gewicht von 1,9 mg und einem langen Achse Durchmesser von ~ 3 mm in Erwachsenen10, einem langen Achse Durchmesser von 2 bis 2,5 mm postnatale Tag 21 (P21) und nur 1-1,5 mm bei P0.
Ein koronaler Abschnitt wird bevorzugt, um Adenohypophysis und Neurohypophysis in eine einzige Scheibe der Hypophyse Maus angezeigt. Allerdings müssen einige technische Fähigkeiten erhalten koronalen Abschnitte der Hypophyse aus Entwicklungsländern Mäuse aufgrund seiner außergewöhnlich geringen Größe und unterschiedliche Anatomie zu befriedigen. In diesem video Artikel zeigen wir, wie zu sezieren Maus Hypophyse Hypophyse koronalen Abschnitte in verschiedenen Entwicklungsphasen.

<table><tbody><tr><td>Werkzeuge/Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere-gerade</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Feine Schere-strain</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Blunt Pinzette</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>zur Isolierung der Hypophysennadel</td></tr><tr><td>26G (0,45 mm)</td><td>HongDa</td><td></td><td>für die transkardiale Perfusion</td></tr><tr><td>Spritze (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Spritze (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>35-mm-Schüssel</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Linsenreinigungspapier</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Anatomisches Mikroskop</td><td></td><td>OLYMPUS SZX-ILLB2-200</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Einbettkassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Das Konsolensystem für Gewebeeinbettung</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>kann bei anderen Anbietern</td></tr> <tr>erworben werden<td>Mikrotom</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>kann von anderen Anbietern erworben</td></tr> werden <tr><td>Superfrost-Plus Objektträger</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>kann von anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>kann von anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>kann von anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td><stark>Name<</td><td>strong>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethan</td><td></td><td>BBI EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>für PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>für PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>für PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>für PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Injektion</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>für Perfusionssalzlösung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>für H& E-Färbung</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>für H& E Färbung</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Wachstumshormon (GH)</td><td>Nationales Hormon</td><td></td><td>zur Immunfärbung</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td>Hypophyse Programm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus GFAP Antikörper</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>zur Immunfärbung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>für Immunfärbung</td></tr><tr><td>TSA System</td><td>NEN Life Science Produkte</td><td>NEL700</td><td>für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>von Streptavidin, Alexa Fluor 594</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>von Anti-FITC, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>für die Immunfärbung</td></tr></tbody></table>

dissektion und koronale slice vorbereitung maus hypophyse zu entwickeln

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Die Hirnanhangdrüse oder Hypophyse ist ein wichtiges endokrine Organ Sekretion von Hormonen, die wichtig für die Homöostase. Es besteht aus zwei Drüsen mit getrennten embryonale Herkunft und Funktionen – die Neurohypophysis und die Adenohypophysis. Die entwickelnden Maus pituitäre Drüse ist klein und zart mit eine längliche ovale Form. Ein koronaler Abschnitt wird bevorzugt, um die Adenohypophysis und Neurohypophysis in eine einzige Scheibe der Hypophyse Maus angezeigt.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, richtige Hypophyse koronalen Abschnitte mit gut erhaltenen Gewebe Architekturen aus Entwicklungsländern Mäuse zu erreichen. In diesem Protokoll beschrieben detailliert wie man sezieren und Prozess Hypophyse richtig von Mäusen zu entwickeln. Erstens werden Mäuse durch Transcardial Perfusion von Formaldehyd vor der Präparation fixiert. Dann sind drei verschiedene sezierenden Techniken angewendet, um intakte Hypophyse je nach Alter von Mäusen zu erhalten. Für Fetale Mäuse bis 4 Tage embryonalen Tag(e) 17,5-18,5 und Neugeborene bis Jahren, werden die gesamte Sella Regionen einschließlich Sphenoid Knochen, Drüse und Trigeminal Nerven indiziert. Für Welpen sind Alter postnatale Tagen (P) 5-14, der Hypophyse verbunden mit Trigeminal Nerven als Ganzes seziert. Bei Mäusen über 3 Wochen alt sind die Hypophyse sorgfältig frei aus dem umliegenden Gewebe seziert. Gewusst wie: der Hypophyse einbetten in eine korrekte Ausrichtung mithilfe der umgebenden Gewebe als Landmarken zu befriedigen koronalen Abschnitte anzeigen Diese Methoden sind hilfreich bei der Analyse von histologischer und Entwicklungsstörungen Funktionen der Hypophyse bei der Entwicklung von Mäusen.

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Hypophyse aus Entwicklungsländern Mäuse zu sezieren. Für die Neugeborenen Maus, die gesamte Sella-Regionen mit der Hypophyse, die Trigeminal Nerven und der Unterseite Sphenoid Knochen wurden heraus von der Schädelbasis seziert. Die kleinen und zarten Hypophyse intakt geblieben während des Prozesses (Abbildung 1A). Bei Mäusen, die älter als 5 Tage, der Hypophyse, befestigt an den seitlichen Trigeminal Nerven wurden dann...

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Hypophyse zu sezieren und bereiten Hypophyse koronalen Abschnitte von Mäusen zu entwickeln.

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, korrekte Hypophysen-Koronalschnitte mit gut erhaltenen Gewebearchitekturen von sich entwickelnden Mäusen zu erhalten. Dieses Verfahren kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Hypophysenentwicklung zu beantworten, wie z. B. Hypophysenhistologie, Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sich entwickelnde murine Hypophysen ohne sichtbare Schädigung präpariert und richtig ausgerichtet werden können, um koronale Schnitte zu erzielen.Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass es für die Entwicklung von murinen Hypophysen technisch schwierig war, geeignete koronale Schnitte zu erhalten. Nachdem Sie die Mäuse gemäß dem Textprotokoll betäubt und fixiert haben, schneiden Sie den Schädelknochen mit einer Schere auf. Heben Sie dann mit einer Pinzette das Hinterhirn vorsichtig von der Schädelbasis an.Dann, beim ersten Anzeichen der sella turcica, hören Sie auf zu heben, sondern halten Sie das Hinterhirn fest und schneiden Sie mit einer feinen Schere den Hypophysenstiel und die Nervenfasern, die mit der Basis des Gehirns verbunden sind. Fahren Sie fort, das gesamte Gehirn anzuheben und zu entfernen, um die Hypophyse vollständig freizulegen. Die Hirnanhangdrüse ruht auf der dorsalen Oberfläche des Keilbeins und ist lateral von Trigeminusnerven umgeben.Schneiden Sie dann mit einer Schere die gesamte Sellarregion einschließlich der Hypophyse, der lateralen Trigeminusnerven und unter dem Keilbein durch. Legen Sie das Gewebe in eine 35-mm-Schale mit 4 % PFA und inkubieren Sie es je nach Alter 40 Minuten bis 3 Stunden lang bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie dann 10 ml PBS, um das fixierte Gewebe für fünf Wechsel à 15 Minuten zu waschen.Übertragen Sie das fixierte Gewebe in eine 35-mm-Schale, die 1 ml PBS enthält, und dissoziieren Sie unter einem Stereomikroskop die Hypophysen. Bei den Hypophysen P5 bis P14 entfernen Sie mit einer feinen Zange und einer Schere die Bindemembranen zwischen den Nerven und dem Knochen und isolieren die Hypophyse zusammen mit den lateralen Trigeminusnerven als Ganzes, wobei die Sella turcica belassen wird. Entfernen Sie bei P21 und erwachsenen Hypophysen die Nerven und Bindehäute um die Hypophyse und befreien Sie die Drüse vom umgebenden Gewebe.Nach der Dehydratisierung, der Xylol-Klärung und der Wachsinfiltration, die gemäß dem Textprotokoll durchgeführt wurde, wird die Probe auf einem Gewebeeinbettungskonsolensystem aus der Kassette entnommen und in eine zur Hälfte mit geschmolzenem Paraffinwachs gefüllte Grundform gelegt. Verwenden Sie für P21 und erwachsene Hypophysen eine erwärmte feine Pinzette, um die Hypophyse mit ihrer kurzen Achse senkrecht zur Unterseite einer Basisform zu positionieren. Richten Sie bei P0 bis P4 Hypophysen die Proben mit ihren Keilbeinknochen senkrecht zur Unterseite einer Basisform aus.Richten Sie bei den Hypophysen P5 bis P14 die Proben mit ihren Trigeminusnerven senkrecht zur Unterseite einer Basisform aus. Halten Sie das Gewebe nach dem Positionieren der Drüse mit einer erwärmten feinen Pinzette sanft in der gewünschten Position, bis das Wachs auf einer Kühlplatte halbfest wird. Füllen Sie die Form mit geschmolzenem Paraffinwachs auf.Lassen Sie den Paraffinblock abkühlen, bis das Wachs vollständig erstarrt ist. Kühlen Sie den Paraffinblock 10 bis 20 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius, schneiden Sie ihn dann mit einem Mikrotom in dünne Scheiben und stimmen Sie die Position des Paraffinblocks während des Schneidens fein ab. Führen Sie die Immunmarkierung gemäß dem Textprotokoll durch.Wie hier gezeigt, wurde zur Präparierung der Hypophyse von der neugeborenen Maus die gesamte Sellarregion, die die Hypophyse, die Trigeminusnerven und den darunter liegenden Keilbein enthält, aus der Schädelbasis präpariert. Die winzige und empfindliche Hypophyse blieb während des Prozesses intakt. Bei Mäusen, die älter als fünf Tage waren, wurden die Hypophysen, die an den lateralen Trigeminusnerven befestigt sind, isoliert.Die Wachstumsstruktur der aus der P7-Maus isolierten Hirnanhangdrüse blieb gut erhalten. Hier gelang es, die Hirnanhangdrüse der P21-Maus ohne sichtbare Schädigung zu isolieren und gleichzeitig das umliegende Gewebe zu entfernen. In dieser Abbildung zeigt die H&E-Färbung von richtig ausgerichteten koronalen Schnitten eine gut erhaltene Morphologie sowohl der Adenohypophyse als auch der Neurohypophyse in den Hypophysen P0, P7 und P21.Schließlich waren die prozessierten Objektträger auch mit der Immunfluoreszenzmarkierung kompatibel. Als Beispiel zeigten die Adenohypophyse und die Neurohypophyse eine spezifische Immunmarkierung von GH bzw. GFAP. Einmal gemeistert, kann der Prozess von der Dissektion bis zur Einbettung bei erwachsenen Mäusen in 7,5 Stunden durchgeführt werden und bei jüngeren Mäusen sogar noch weniger, wenn er richtig durchgeführt wird.Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die gesamte Sellarregion zu präparieren, um zu vermeiden, dass die Hypophyse mit chirurgischen Instrumenten berührt wird. Nach diesem Verfahren kann auch die Hypophyse, der kein Präfix vorangestellt wurde, isoliert werden. In diesem Fall ist mehr Vorsicht geboten, um unerwünschte Schäden zu vermeiden.Auch die Drüse sollte so schnell wie möglich präpariert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Hypophyse der Maus präpariert und die Koronaschnitte der Hypophyse in verschiedenen Entwicklungsstadien vorbereitet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

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