Name: Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung translationell aktiver Synaptoneurosomen aus dem Mäusekortex mittels diskontinuierlichem Percoll-Saccharose-Dichtegradienten. Diese Methode minimiert mechanische Schäden und ermöglicht präzise synaptische Proteinanalysen.

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Wir möchten BK August von der University of Wisconsin-Madison Electron Microscope Facility für die Elektronenmikroskopie danken. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01-DA026067 und P30-HD03352 (bis JSM) unterstützt.

1. Die Vorbereitungen 1-4 <ol><li> Bereiten Sie 500 mL Gradienten-Medium (GM)-Puffer durch Mischen von 50 mL einer 2,5 M Saccharose Gülle, 2,5 mL einer 1M Tris-HCl, pH 7,5 Lager, und 0,1 ml einer 0,5 m EDTA, pH 8,0 Lager mit Milli- Q-Wasser, um die Lautstärke. Filter sterilisieren die Lösung, Aliquot und speichern eingefroren. </li><li> Bereiten Sie eine 1000x Lager von Tetrodotoxin (TTX), indem Sie eine 1 mM Lösung in Milli-Q-H 2 O. Aliquots der TTX kann bei -20 ° C gelagert werden </li><li> Bereiten 10x Stimulation Buffer, indem eine Lösung von 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, und 800 mM NaCl in Milli-Q-Wasser. Lager kann bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Pre-cool-Zentrifugen auf 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von isosmotischen Percoll (SIP) durch Zugabe von 9 Volumina Percoll (18 ml) zu 1 Volumen von 2,5 M Saccharose (2 mL) in Milli-Q-Wasser und gut mischen. </li><li> Bereiten Sie die 3, 10, 15, und 23% Steigung Schichten, indem die jeweiligen Mengen von SIP auf GM-Puffer und Mischen jeder: </li></ol><img alt="Tabelle 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 0"><ol start="7"><li> Gießen Gradientenschichten durch Pipettieren 2 ml jeder der 23, 15, 10, und 3% isosmotischen Percoll-Lösungen in den Beckman Zentrifugenröhrchen mit Kappen mit einem P1000 Gilson Pipetman. Die Schnittstelle zwischen den Schichten sollten klar erkennbar ohne Vermischung der Schichten. Bewahren Sie die Gradienten bei 4 ° C für mindestens 20 min vor dem Gebrauch. Die Gradienten können bis zu 24 Stunden gelagert werden, obwohl am gleichen Tag verwenden wird empfohlen. [Unerfahrene Laborpersonal kann bereitet Gradienten, indem blauen Farbstoff der isomotic Percoll-Lösungen für die Visualisierung der Schicht Schnittstellen der Praxis.] </li></ol> 2. Maus Dissektion 1 <ol><li> Stellen Sie sicher, dass alle Maus Tierhaltung und Euthanasie Verfahren im Einklang mit NIH und der Universität Richtlinien durchgeführt werden. Euthanize Welpen (Alter P13 bis P21) durch Kohlendioxid Ersticken oder durch ein Verfahren genehmigt der in der Tier-Protokoll. </li><li> Pin mit der Maus ein Dissektion Bord und besprühen Sie die Rückseite des Halses und des Kopfes mit Ethanol. Mit einer scharfen Schere durch das Rückenmark an der Basis des Schädels schneiden, entfernen Sie die Haut von der Oberseite des Schädels, schneiden Sie den Schädel seitlich zwischen dem Scheitelbein und der interparietalen Knochen oder zwischen dem Großhirn und dem Cortex Regionen. Dann schneiden Sie den Schädel von der Basis an der Nase (entlang der sagittalen Naht), entfernen Sie vorsichtig den weichen Scheitelbein, indem jeder Hemisphäre auf die Seite und entfernen Sie die Rinde mit einem Spatel. Legen Sie den Spatel in das Gehirn über das Kleinhirn und dann schaufelt aus dem Cortex und legen Sie sie in eiskaltem GM-Puffer. Gehen Sie sofort auf die Homogenisierung Schritt. Lassen Sie sich nicht den Kortex sitzen in eiskaltem Puffer für sehr lange, da dies sich negativ auf die Bildung von SNS. </li></ol> 3. Vorbereitung von Homogenat und SNS 1-4 <ol><li> Spülen Sie den Kortex in eiskaltem GM-Puffer und übertragen zwei Kortex, ein Glas Dounce Homogenisator mit 5 ml kaltem GM-Puffer. </li><li> Vorsichtig homogenisiert den Kortex mit 5-10 Schläge des losen Pistill (Stößel "A"), um 5-10 Schläge der engen Pistill (Stößel "B") folgten. Strokes sollte schnell, aber langsam genug, um nicht Luftblasen verursachen. Ein Bild von dem Homogenat nach der Homogenisierung ist in Schema 1. Die Anzahl der Schläge variiert abhängig von der individuellen Homogenisator und begleitende Stößel. Wenn Sie fertig sind die Gradienten sollte eine starke SN Band geben, wenn nicht, stellen Sie die Anzahl der Schläge. </li><li> Übertragen Sie die Homogenat in ein 15 ml konische und Zentrifuge bei 1000xg für 10 min bei 4 ° C in einem Ausschwingrotor (Allegra 6KR Zentrifuge) zum Pellet Zelltrümmer und Zellkerne. Ein Bild des gesponnenen Homogenat wird in Schema 1. </li><li> Layer 2 mL des Überstandes pro Percoll-Saccharose-Gradienten, Kappe der Rohre und Zentrifuge bei 32.500 xg für 5 min bei 4 ° C in einem Festwinkelrotor (Beckman J2-21 Zentrifuge, JA-17 Rotor) mit entsprechenden Adaptern ( Siehe Reagenzien und Tabelle). </li><li> Pipette ab und entsorgen Sie die Lösung über dem SN-Band mit einem Glas Pasteur Pipette. Pipette aus der SN-Band auf der 15/23%-Schnittstelle, um einen konischen und speichere sie auf Eis zu übertragen. Jede Steigung oder eine Rinde produziert 0,9-1,1 mL SN. </li><li> Passen Sie die Salzkonzentration des SNS durch Zugabe von einem Zehntel Volumen von 10x Stimulation Puffer, fügen 1000x CaCl 2 zu einer Endkonzentration von 12 nM, und fügen Sie 1 mM TTX Lager, um eine endgültige Konzentration von 1 nM, um unspezifische Erregung zu unterdrücken. (Zusatz von CaCl 2 ist optional, wenn sie mit nachgeschalteten SN-Anwendungen stören). </li><li> Bestimmen der Proteinkonzentration der SNS mit dem Micro BCA Protein Assay Kit. (The Bradford-Protein-Assay ist nicht, weil der Schluß von der Percoll empfohlen.) </li><li> SNs können direkt und schnell für Protein-Übersetzungen verwendet werdenTION Studien. Für andere Anwendungen SN Lysat kann bereinigt werden oder konzentriert mit dem Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Wenn Maus Cortex homogenisiert wurde und diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten (Schema 1), 6 Bands oder Fraktionen getrennt gesehen wurden (Abbildung 1). Es war zuvor für Ratten gezeigt Großhirnrinde 3,5, dass die Bestandteile der hochmolekularen Bands Membran und Myelin gebrochen wurden und dass die pelletierte Material enthaltenen Mitochondrien oder Organellen (Tabelle 1). Die 23% / 15%-Schnittstelle (Band 5) enthalten die angereicherten SNS. Die Bande bei 23% / 15%-Schnittstelle, mit intakten SNs, wurde entfernt und durch Elektronenmikroskopie (EM) wie zuvor beschrieben untersucht. 2,6 EM das Vorhandensein von intakten synaptischen Vesikeln und die Erhaltung der präsynaptischen und postsynaptischen Elementen (Abbildung gezeigt 2). Isolierung von prä-und postsynaptischen Kompartimente für die Prüfung Signal-und Proteinsynthese, die in beiden Kammern tritt wichtig. 7-13 Die Percoll-Saccharose-Gradienten ist eine grobe Reinigung, so dass wir kleinere Zellen, Kern-und Organell Kontamination sah in der SN-Fraktion, aber die Gesamt-Trennung war gut. Wenn mittels Western Blot untersucht, enthielt die Percoll Fraktionen die erwarteten Protein-Marker mit einer Erhöhung der synaptischen Reinheit in der SN-Band (Abbildung 3, Tabelle 2). Synaptic und neuronalen Marker wurden in den angereicherten SN-Band (Band 5) beibehalten, aber die Fülle von anderen Markern deutlich reduziert werden. Insbesondere wurden die Anwesenheit von GFAP, ein Marker für Astrozyten und neoplastischen Zellen glialen Ursprungs, und Lamin-B1, eine nukleare Marker, vernachlässigbar, während strukturelle und synaptischen Marker wurden beibehalten oder ausgebaut. Darüber hinaus gab es Aufbewahrung von Markern für Organellen, wie Mitochondrien und Golgi, die eine Rolle spielen bei der Proteinsynthese. Typische Ausbeuten für die SN-Band wurden 250-500 ng Protein pro Mikroliter, wie BCA Protein Assay bestimmt. Die Aktivität des SNS wurde von der Menge des de novo Protein-Synthese ermittelt derzeit, wie überwacht werden [35S]-Met Aufnahme (Abbildung 4). 2 Basal translationale Aktivitäten betrug 1,56 fache erhöht, wenn SNs mit 50 uM glutamate/10 uM Glycin stimuliert wurden (Glu) oder 5.12 fache an, wenn mit der Pin1-Hemmer Juglon aktiviert. Pin1-Inhibition ist bekannt, dass eine erhöhte Proteinsynthese. 2 Resultat zu bestätigen, dass die Zunahme von [35S]-Met Einarbeitung durch de novo Proteinsynthese war, haben wir 40 uM Anisomycin, ein Protein-Synthese-Hemmer, und sah eine deutliche Abnahme der Inkorporation in Anwesenheit und Abwesenheit von Glu, wenn die Basis-Ebenen verglichen. Auch bei der Zugabe von 2% Triton-X 100, die die Integrität des SNS stört, wurde basal Übersetzung um 75% gesunken. 2 Darüber hinaus bei der Prüfung der Bänder (B4-B6), dass die meisten synaptischen Marker Bereicherung zeigten, die SNS oder Band 5 war die größte Aktivität für de novo Protein-Synthese (Abbildung 5). So der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten schnell einen hoch aktiven und bereichert SN Band, die verwendet werden, um Protein-Übersetzung Studie werden können. Die diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Gradienten Verfahren ist vorteilhafter als andere Methoden, weil mechanische Schäden, die durch härteren Bedingungen verursacht wird. Wenn die Filtration Methode, bei der kortikalen Homogenat gelöscht verglichen wird durch eine Reihe von Filtern, die Abnahme der Größe, Form 3,14-15 die Percoll-Methode mehr SNs mit größerer Aktivität vergangen. Wie in Abbildung 6, wenn ein Aliquot SNs durch die Filtration Methode hergestellt über einen Percoll-Saccharose-Gradienten gibt es weit weniger SNs am 15/23%-Schnittstelle und eine größere Menge von gebrochenen Membranen verabschiedet wurde gesehen. Wenn de novo Proteinsynthese über S35-met Aufnahme gemessen wurde, waren die SNS durch die Filtration Methode hergestellt weit weniger aktiv ist (Abbildung 7). Zur Maximierung der translationalen Aktivität verwenden wir Mäuse, die im Alter zwischen P14 und P18 sind. SN können aus adulten Mäusen hergestellt werden, aber wir beobachten signifikant erhöht translationalen Aktivität mit SN von jungen Mäusen (Abbildung 8) vorbereitet. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Bestandteile der Bands aus der diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Fraktionierungen von homogenisiert Maus Kortex. 3,5 <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 2"> Tabelle 2. Zusammenfassung der westlichen Bolzen Analyse der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Band Bestandteile. Relative Proteinkonzentrationen für jeden der Band Fraktionen isoliert mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurden mittels Western Blot bestimmt. No-Proteins vorhanden (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), oder&gt; 0,8 (+++) fach größer als Protein im Überstand (S, zentrifugiert Kortex Homogenat), Vertreter der n = 3. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Schema 1"> Schema 1: Schematische Darstellung einer SN Vorbereitung mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Maus Gehirn Kortex wurden seziert, homogenisiert und zentrifugiert bei geringer Geschwindigkeit auf nicht-homogenisierte Gewebe, Zellen, ganze Organellen wie Kerne und Membranen zu entfernen.. Die diskontinuierliche Gradienten sollten klar definierte Schichten. Das Bild Einschub zeigt ein Beispiel für die Schichten, die gefärbt sind blau lediglich zu illustrativen Zwecken, um die Schichten zu visualisieren. Der Überstand wird auf der Spitze eines diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten geschichtet und zentrifugiert bei mittlerer Geschwindigkeit. Die SN-Band wird dann aus der Steigung abgerufen und ist einsatzbereit. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Homogenat Fraktionierung auf einen diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten. Maus Cortex wurde homogenisiert und auf einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten, die zu 6 Bands oder Fraktionen. Das gereinigte, aktive SNs (*) wurden in Band 5 gefunden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. SN Präparate geben eine heterogene Mischung von SNS, die präsynaptischen und postsynaptischen Elemente behalten. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines SN-Präparation aus C57BL / 6 Mäuse (Alter P13 bis P21) wie zuvor beschrieben hergestellt und zeigt SNs wurde mit erhaltener präsynaptischen und postsynaptischen Elementen durchgeführt. 2 , 6 Rote Pfeile weisen auf post-synaptischen Dichten. Maßstabsbalken ist 1 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Western-Blot-Analyse von SN Präparate zeigten, dass synaptischen und neuronalen Marker im gereinigten SNs wurden beibehalten (Band 5), aber die Fülle von anderen Markern deutlich reduziert werden. Immunoblots der Überstand (S, zentrifugiert kortikalen Homogenat) und Bands 1-6 von einer diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurden für β-Actin (Struktur-, Be-Kontrolle), GFAP (Astrozyten), GP73 (Golgi), HSC70 (zytoplasmatische und nukleare), Lamin-B1 (Kernenergie), Prohibitin (Mitochondrien), PSD95 sondiert (postsynaptischen Dichte ), SNAP25 (synaptic), Synaptophysin (synaptic) und β3-Tubulin (Neuronen-spezifische). Die Banden wurden mit einem Sturm 860 Phosphorimager, Vertreter der n = 3. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. SNs sind aktiv und zeigen de novo Proteinsynthese über [35S]-Met Statuten. SNs wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann die SNS wurden unbehandelt oder vorbehandelt für 15 min mit 40 uM Anisomycin oder 1 uM Juglon bei 37 ° C durch Zugabe von [35S]-Met folgte, 20 ul Express Pro-Label-S35 Einfache Tag Mix, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Band 5 aus der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten enthielt die höchsten Ebenen der de novo Proteinsynthese. Bands 4, 5 und 6 und der Überstand (S, zentrifugiert kortikalen Homogenat) wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann [35S]-Met, Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag wurde hinzugefügt, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. SNs aus einer Filtration Verfahren hergestellten enthalten mehr gebrochen Membranen und weniger ganze SNs als SNs aus der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Verfahren hergestellt. SNs wurden, indem homogenisiert Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße wie zuvor beschrieben vorbereitet. 3,14-15 Ein Aliquot der SNS durch die Filtration Methode hergestellt über einen diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurde zentrifugiert und im Vergleich zu einer äquivalenten Menge Material unter Verwendung des diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. SNs aus einer Filtration Verfahren hergestellten enthalten weniger de novo Protein-Synthese-Aktivität als SNs her vorbereitetm der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode. SNs wurden, indem homogenisiert Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße wie zuvor beschrieben, 3,14-15 und durch den diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten Methoden hergestellt. SNs von beiden Präparate wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann [35S]-Met, Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag wurde hinzugefügt, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. SNs von jüngeren Mäusen (P14) haben eine größere translatorische Tätigkeit als ältere Mäuse (P85). SNs aus verschiedenen alten Mäusen unter Verwendung des diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode, voräquilibriert bei 37 ° C für 10 min wurden hergestellt, behandelt oder unbehandelt in der mit Glu Gegenwart von [35S]-Met (Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag) für 30 min, schockgefroren und später mit dem Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit gereinigt. Die SNS wurden dann auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel laufen, getrocknet und abgebildet auf einem Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. SNs von P14 Mäusen wurden mindestens 3-fach aktiver als P85 Mäusen.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Gradienten Vorbereitung hierin beschriebenen ist eine schnelle, zuverlässige Methode, um aktiv SNS, die in einer Vielzahl von synaptischen Übertragung Experimente verwendet werden können isolieren. Dieser Gradient-Methode, die auf der Methode von Dunkley et al., 3,4 entwickelten, ist eine subzelluläre Fraktionierung Gehirn Verfahren, das sowohl prä-und postsynaptischen Membran-derived Bläschen, die miteinander verbunden sind, isoliert. Ohne weitere Reinigung dieser SN...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Assay Kit </td><td> Durchstechen </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fischer </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2-Gas </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Fischer </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fischer </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fischer </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit </td><td> Durchstechen </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fischer </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Fischer </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Dissection-Tools </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce Homogenisator, 7 mL (kommt mit zwei Glas-Stößel mit der Aufschrift &quot;A&quot; und &quot;B&quot;) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR Centrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3,8 Rotor, Ausschwingrotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Zentrifuge </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman Röhrchen mit Kappen </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Weiß ummauerten Adapter </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Blau ummauerten Adapter </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, Festwinkelrotor </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle der Antikörper für Western Blots verwendet: <table border="1"><tbody><tr><th> Name der Antikörper </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Wirtsarten </th><th> Verdünnungsfaktor </th></tr><tr><td> β-Aktin </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> Maus </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65343 </td><td> Maus </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-134509 </td><td> Kaninchen </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> Maus </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-6261 </td><td> Ziege </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28259 </td><td> Kaninchen </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> Maus </td><td> 5 ug / ul </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> Kaninchen </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> Maus </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-Tubulin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80016 </td><td> Maus </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

vorbereitung der synaptoneurosomen von maus cortex mit einem diskontinuierlichen percoll-saccharose-dichtegradienten

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomen (SNS) sind nach der Homogenisierung und Fraktionierung von Maus Hirnrinde erhalten. Sie sind Vesikel oder isolierte Terminals, die ausbrechen aus Axonterminalen wenn die kortikale Gewebe wird homogenisiert und verschließen. Die SNS behält prä-und postsynaptischen Eigenschaften, wodurch sie sinnvoll in das Studium der synaptischen Übertragung. Sie behalten die molekulare Maschinerie in neuronalen Signalübertragung verwendet und sind in der Lage die Aufnahme, Speicherung und Freisetzung von Neurotransmittern. Die Herstellung und Isolierung von aktiven SNs kann problematisch mit Medien wie Ficoll, die zytotoxisch können und müssen verlängert Zentrifugation aufgrund der hohen Dichte und Filtration und Zentrifugation Methoden, die in geringer Aktivität durch eine mechanische Beschädigung der SNS können die Folge sein. Allerdings ist die Verwendung von diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten an SNS isolieren eine schnelle Methode, um gute Ausbeuten an translationsaktiven SNs produzieren. Die Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode ist schnell und sanft wie es isotonischen Bedingungen beschäftigt, hat weniger und kürzere Zentrifugation Spins und vermeidet Zentrifugationsschritte, dass Pellet SNs und mechanische Schäden verursachen.

Eine Methode, um translationsaktiven, intakte Synaptoneurosomen (SNS) von der Maus Hirnrinde vorbereiten beschrieben. Das Verfahren nutzt eine diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von aktiven SNS.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomen (SNs) werden durch Homogenisierung und Fraktionierung des Kortex eines Mäusegehirns gewonnen. Es handelt sich dabei um resiegelte Vesikel oder isolierte Terminalien, die ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, translationsaktive Synaptoneurosomen aus der Maushirnrinde mithilfe eines diskontinuierlichen Percoll-Sucrose-Dichtegradienten herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Maushirnrinden gesammelt und homogenisiert werden und anschließend das Homogenat zentrifugiert wird. Danach wird das zentrifugierte Homogenat oder der Überstand auf vorgefertigte Percoll-Sucrose-Gradienten aufgetragen.Der letzte Schritt besteht darin, die Synaptosomen-Fraktion zu zentrifugieren und zu sammeln. Schlussendlich zeigen Western-Blot-Analysen und S 35-Methionin-Inkorporationsversuche, dass die Synaptosomen-Fraktion synaptisch angereichert und translationsaktiv ist. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Zentrifugation und Filtration sind, dass erstens mechanische Schäden durch die Verwendung von Dichtegradienten vermieden werden und zweitens die Einzelzellen eine geringe Toxizität gegenüber den Zellen in ihren Bestandteilen aufweisen.Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten mit diesem Protokoll, da die zeitliche Abfolge eine entscheidende Rolle spielt. Sobald die Kortices

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Isolierung von Gehirnzellen und infiltrierten Immunzellen aus ischämischem Gehirngewebe von Mäusen durch enzymatische Verdauung, gefolgt von der Entfernung von Zelltrümmern und Myelin durch Dichtegradientenzentrifugation, um Entzündungsreaktionen in der Schlaganfallforschung zu untersuchen.

Gewinnung von Zellsuspensionen aus ischämischem Gewebe des Gehirns von Mäusen

Quelle: Lunelli, L., et. al. Blick auf Gehirnpolysomen mit Rasterkraftmikroskopie. J. Vis. Exp.(2016). Dieses Video zeigt die Bildgebung von Polysomen mittels Rasterkraftmikroskopie. Ein mit Nickelionen beschichtetes Glimmerblatt verankert RNA mit angehängten Ribosomen. Die Probe wird gewaschen, getrocknet und auf den Mikroskoptisch montiert. Die Cantilever-Spitze tastet die Probenoberfläche ab und zeichnet Laserablenkungen auf, um die Topologie abzubilden. Software wird eingesetzt, um...

 Bildgebung von Polysomen, die aus einem Mausgehirn isoliert wurden, mittels Rasterkraftmikroskopie

Dieser Artikel beschreibt die Anreicherung von Proteinen mit den synaptischen Plasmamembran durch Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten verbunden. Die anschließende Herstellung der postsynaptischen Dichte Proteine ​​wird ebenfalls beschrieben. Proteinpräparate eignen sich für Western-Blot-oder 2D-DIGE-Analyse.

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Obwohl die Ribosomenstruktur umfassend charakterisiert wurde, ist die Organisation von Polysomen noch wenig untersucht. Um diesen Wissensmangel zu überwinden, stellen wir Ihnen hier ein detailliertes Präparationsprotokoll für die genaue Abbildung von Säugetierpolysomen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) in Luft und Flüssigkeit vor.

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

Die Identifizierung von Molekülen und Signalwegen, die die synaptische Plastizität und das Gedächtnis steuern, ist immer noch eine große Herausforderung in den Neurowissenschaften. Hier wird ein Arbeitsablauf beschrieben, der sich mit der relativen Quantifizierung von synaptischen Proteinen befasst, die angeblich an der molekularen Reorganisation von Synapsen während des Lernens und der Gedächtniskonsolidierung in einem auditorischen Lernparadigma beteiligt sind.

Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Dieses Protokoll stellt eine robuste, detaillierte Methode dar, um hochreine Synaptosomen, synaptische Vesikel und andere synaptische Fraktionen aus dem Mausgehirn zu erhalten. Diese Methode ermöglicht die Bewertung synaptischer Prozesse, einschließlich der biochemischen Analyse der Proteinlokalisation und -funktion mit kompartimentärer Auflösung.

Subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung synaptischer Komponenten aus dem murinen Gehirn

Erfahren Sie die Isolierung translationell aktiver Synaptoneurosomen aus dem Mäusekortex mittels diskontinuierlichem Percoll-Saccharose-Dichtegradienten. Diese Methode minimiert mechanische Schäden und ermöglicht präzise synaptische Proteinanalysen.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

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