Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, translational aktive Synapen aus der Hirnrinde der Maus unter Verwendung eines diskontinuierlichen Peral-Saccharose-Dichtegradienten zu präparieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die Mauskortikale gesammelt und homogenisiert und dann das Homogenat zentrifugiert wird. Anschließend wird das Zentrifugenhomogenat oder das Sup-Nativmittel auf den Preport per Co-Saccharose-Gradienten aufgetragen.

Der letzte Schritt besteht darin, die Synaptosomenfraktion zu zentrifugieren und zu sammeln. Letztendlich zeigen die Western-Blot-Analyse und S 35-Methionin-Einbauexperimente, dass die Synaptosomenfraktion synaptisch angereichert und translational aktiv ist. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Zentrifugation und Filtration bestehen darin, dass unsere erste mechanische Beschädigung durch die Verwendung von Dichtegradienten vermieden wird und die zweite pro Aufruf eine geringe Toxizität gegenüber den Zellen in ihren Bestandteilen aufweist.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, mit diesem Protokoll zu kämpfen haben, da das Timing eine Schlüsselrolle spielt. Sobald die Cortis entnommen wurde, sollte der Eingriff schnell abgeschlossen sein. Zu Beginn des Verfahrens bereiten Sie die Schichten mit 3, 10, 15 und 23 % Gradient vor, indem Sie die jeweiligen Mengen SIP, wie im begleitenden Manuskript beschrieben, zu GM-Puffer hinzufügen und gut mischen.

Gießen Sie Gradientenschichten, indem Sie jeweils zwei Milliliter aus den 23 15-, 10- und 3%igen isosmotischen Perollösungen in die Beckman-Zentrifugenröhrchen mit Verschlüssen pipettieren. Mit einer P 1000-Pipette sollte die Grenzfläche zwischen den Schichten deutlich erkennbar sein, ohne dass sich die Schichten vermischen. Lagern Sie die Gradienten von vier Grad Celsius vor der Verwendung mindestens 20 Minuten.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie andere notwendige Lösungen vor, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Euthanasieren Sie die Maus im Alter von P 13 bis P 21 und bereiten Sie sie für die Dissektion vor, indem Sie den Nacken und den Kopf mit 70%igem Ethanol besprühen. Schneide dann mit einer scharfen Schere das Rückenmark an der Schädelbasis durch.

Entfernen Sie als Nächstes die Haut von der Oberseite des Schädels. Schneiden Sie den Schädel seitlich zwischen dem Scheitelknochen und dem Zwischenschädelknochen oder zwischen dem Großhirn und der Rinderegion. Schneiden Sie danach den Schädel von der Basis bis zur Nase entlang der sagittalen Naht.

Entfernen Sie bei diesem Schritt vorsichtig den weichen Scheitelknochen, indem Sie jede Halbkugel zur Seite ziehen. Führen Sie danach den Spatel in das Gehirn oberhalb des Kleinhirns ein, um die Rinde herauszuschöpfen. Legen Sie es in eiskalten GM-Puffer und wiederholen Sie die Verfahren erneut, um mehr Kortex zu sammeln.

Spülen Sie nun die Kortiken in eiskaltem GM-Puffer aus. Übertragen Sie dann zwei Kortikale in einen Glas-Down-Homogenisator, der fünf Milliliter kalten GM-Puffer enthält. Homogenisieren Sie die Kortikale vorsichtig mit fünf bis 10 Stößeln Stößel A, dem losen Stößel, gefolgt von fünf bis 10 Stößeln Stößel B, dem Typ Stößel.

Die Anzahl der Hübe variiert je nach individuellem Homogenisator. Füllen Sie das Homogenat in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie es bei 1000 Mal.

10 Minuten lang bei vier Grad Celsius in einer Allegra Six KR Zentrifuge, um Zelltrümmer und Zellkerne zu pelletieren. Schichten Sie zwei Milliliter des Supinats für jeden Per- oder Saccharosegradienten mit einem Gradienten für jeden gesamten Kortex und verschließen Sie die Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie sie in einem Festwinkelrotor bei 32.500-facher Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius in einer Beckman J 2 21-Zentrifuge.

Wenn der Gradient mit geeigneten Adaptern abgeschlossen ist, sollte er eine starke SN-Bande abpipettieren und die Lösung oberhalb der SN-Bande verwerfen. Wenn eine Glaspasta-Pipette von der SN-Bande an der Grenzfläche von 15 bis 23 % pipettiert wird, ergibt ein Gradient im Allgemeinen etwa 0,9 bis 1,1 Milliliter SNS. Danach in ein konisches Röhrchen umfüllen und auf Eis lagern.

Passen Sie dann die Salzkonzentration des SNS an, indem Sie ein 10. Volumen des 10-fachen Stimulationspuffers hinzufügen. Optional wird das 1000-fache Calciumchlorid zugegeben, um eine Endkonzentration von 12 anomolaren zu erhalten. Als nächstes fügen Sie einen millimolaren TTX-Stamm hinzu, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar zu erhalten und die unspezifische Anregung zu unterdrücken.

Der nächste Schritt besteht darin, das SNS in der entsprechenden Downstream-Anwendung, wie z. B. in Proteintranslationsstudien, einzusetzen. Für andere Anwendungen kann SN-Lysat mit dem Pierce SDS Page Sample Prep Kit gereinigt oder konzentriert werden. Die Proteinkonzentration des SNS kann mit dem micro BCA Protein Assay Kit bestimmt werden.

Hier ist ein Beispiel für sechs Bänder oder Brüche. Bei der Homogenisierung und Trennung der Mausrinde auf diskontinuierlichen Perol-Saccharose-Gradienten, wobei die angereicherten SNS in Bande fünf an der 23 bis 15%-Grenzfläche enthalten waren, wurde diese Bande entfernt und elektronenmikroskopisch untersucht. Ein Beispiel für intakte synaptische Vesikel und die Erhaltung präsynaptischer und postsynaptischer Elemente ist hier im Western Blot dargestellt.

Es wird gezeigt, dass ein Anstieg der synaptischen Marker und eine Abnahme der Verunreinigungen in der SN-Bande durch einen diskontinuierlichen Persaccharosegradienten bestätigen, dass die Zunahme des Einbaus von S 35-Methionin bei Zugabe von Glutamat auf die de novo Proteinsynthese zurückzuführen ist. 40 mikromolare Anesa Mycin, ein Proteinsynthesehemmer, wurde zugesetzt. Diese Abbildung zeigt die deutliche Abnahme des Einbaus von S 35-Methionin in Gegenwart von Ansomycin mit oder ohne Glutamat im Vergleich zu den Basalspiegeln.

So erzeugen die diskontinuierlichen peralen Saccharosegradienten schnell hochaktive und relativ reine SNS, die zur Untersuchung der Proteintranslation verwendet werden können. Diese Abbildung zeigt, dass die fünfte Bande des diskontinuierlichen Saccharosegradienten pro Kern die höchsten Niveaus der De-novo-Proteinsynthese enthält. Das SNS, das hergestellt wurde, indem homogenisierter Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße geleitet und dann über einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten pro Kern zum Vergleich zentrifugiert wurde, enthält mehr gebrochene Membranen und weniger vollständiges SNS als SNS, das aus dem diskontinuierlichen Perol-Saccharose-Gradientenverfahren hergestellt wurde. Es wird gezeigt, dass SNS, das unter Verwendung des diskontinuierlichen Peral-Saccharose-Gradientenverfahrens hergestellt wurde, mehr de novo Proteinsyntheseaktivität enthält als SNS, das unter Verwendung des Filtrationsverfahrens hergestellt wurde.

Es wurde gezeigt, dass SNS, die von jüngeren Mäusen hergestellt wurden, eine größere translationale Aktivität aufweisen als ältere Mäuse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie translational aktive synaptische Neurozonen isolieren können, indem Sie Mauskortiken homogenisieren, das Homogenat in einem schwingenden Schaufelrotor zentrifugieren, den Überstand über einen Saccharosegradienten pro Aufruf in einem Rotor mit festem Winkel zentrifugieren und dann das resultierende synaptische Neurozonenband sammeln.