Name: Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Methode der Sputuminduktion für die Atemwegsforschung bei Asthma und COPD. Dieses nicht-invasive Verfahren ermöglicht die zelluläre Analyse von Atemwegserkrankungen.

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Diese Arbeit wurde von der Universität Lüttich Krankenhaus (CHU Lüttich) unterstützt. Wir anerkennen "Instants Produktionen" für die Videoproduktion. Wir anerkennen auch Cedric François, der Patient, der im Film erschien.

Alle in diesem Abschnitt beschriebene Methoden wurden von der Ethikkommission der Universität Krankenhaus Lüttich genehmigt worden und alle gesunde Probanden gab schriftliche Einwilligungserklärung zur Teilnahme.
1. Sputum Induktion
<ol>
	<li>Pre- und Post-Bronchodilatator Spirometrie
	<ol>
		<li>Führen Sie eine Spirometrie (exspiratorischen Volumen in 1 Sekunde [FEV1] gezwungen und forcierte Vitalkapazität [FVC] Manöver) nach der American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) Standardkriterien12.</li>
		<li>Verwalten Sie 400 µg von inhalativen Salbutamol von einem gemessenen Dosis Inhalator (MDI) durch ein Distanzstück Gerät. Hinweis: Bei Erwachsenen sind Nebenwirkungen von inhalativen Salbutamol Tremor und Tachykardie13.</li>
		<li>Wiederholen Sie Spirometrie (FEV1 und FVC-Manöver) 15 min später, nach der ATS/ERS Standardkriterien12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Ultraschall Vernebler Hinweis: Der Vernebler muss gründlich gereinigt und desinfiziert werden vor jedem Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers.<ol>
		<li>Füllen Sie die Verneblerkammer mit destilliertem Wasser bis zu den empfohlenen Wert.</li>
		<li>Stellen Sie eine saubere Tasse in der Verneblerkammer.</li>
		<li>Die Tasse mit dem entsprechenden Deckel abdecken.</li>
		<li>Füllen Sie die Tasse mit entweder 50 mL hypertonen Kochsalzlösung (5 %) für einen Patienten mit Post-Bronchodilatator FEV1 &#62; 65 % vorhergesagt oder 50 mL isotonische Kochsalzlösung (0,9 %) für einen Patienten mit Post-Bronchodilatator FEV1≤65 % prognostiziert.</li>
		<li>Fügen Sie 1,75 mL Salbutamol Sulfat-Lösung (5 mg/mL) auf der Tasse.</li>
		<li>Schließen Sie die Rohre und Ventile gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vernebelung und Auswurf Sammlung Hinweis: Führen Sie die Technik unter ärztlicher Aufsicht.<ol>
		<li>Erklären Sie den Ablauf für den Patienten.</li>
		<li>Lassen Sie den Patienten eine Nasenklammer verwenden.</li>
		<li>Schalten Sie den Vernebler und wählen Sie die unterste Ebene der Aerosol und Lüfter-Einstellungen.</li>
		<li>Bitten Sie den Patienten, das Aerosol durch das Mundstück mit Gezeiten Atmung für 5 min zu inhalieren. Hinweis: Aerosol und Lüfter Einstellungen können je nach Toleranz des Patienten erhöht werden.<ol>
			<li>Im Falle einer unerträglichen Husten oder Übelkeit das Verfahren einzustellen und gehen zu Schritt 1.3.5.</li>
			<li>Im Falle von Engegefühl in der Brust oder respiratorischen Beschwerden gehen Sie zu Schritt 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Deaktivieren Sie den Vernebler.</li>
		<li>Lassen Sie den Patienten die Nasenklemme entfernen, spülen den Mund mit Wasser und Gurgeln zweimal, bevor Sie in die Spüle verwerfen. Hinweis: Speichel Zellen können Sputum Probe verunreinigen und führen zu einer unbrauchbaren Probe.</li>
		<li>Bitten Sie den Patienten zu Husten, Auswurf in einen Kunststoffbehälter.</li>
		<li>Führen Sie eine Spirometrie (erzwungene exspiratorischen Manöver) zur Messung der FEV1.</li>
		<li>Die FEV1 Fall wie folgt zu bewerten: (FEV1 gemessen bei Schritt 3,8 [mL]) - (Post-Bronchodilatator FEV1 gemessen am Schritt 1.3 [mL]) / (Post-Bronchodilatator FEV1 gemessen am Schritt 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>Fällt die FEV1 um 20 % oder mehr von der Post-Bronchodilatator Wert, einzustellen Sie das Verfahren. FEV1 wieder 10 min. später zu messen. Fällt die FEV1 20 % oder mehr, Fragen Sie den Arzt zu verwalten vernebelt Ipratropium Bromid (0,25 mg/2 mL) und der Patient unter ärztlicher Aufsicht zu halten. Gehen Sie zu Schritt 1.3.10.</li>
			<li>Wenn die FEV1 nicht um 20 % oder mehr von der Post-Bronchodilatator Wert fällt, wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.9 ein-bis dreimal hintereinander insgesamt Vernebelung von 10 bis 20 min zu erreichen. Hinweis: Die gesamte Vernebelung Zeit Qualität (Vorhandensein von Steckern oder Viskose Teile) und der Auswurf Probenmenge hängt. Die Probenqualität und/oder Quantität ist schlecht nach 10 min der Vernebelung, sollte das Verfahren verlängert werden, um eine totale Vernebelung Zeit von 15 bis 20 min zu erreichen.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Halten Sie die Auswurf-Probe gekühlt bis zur Verarbeitung.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sputum Verarbeitung
Hinweis: Bearbeiten der Auswurf innerhalb von 3 Stunden der Probenahme für optimale Zellviabilität.
Achtung: Tragen Sie einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille.
<ol>
	<li>Erste Vorbereitungen
	<ol>
		<li>Machen Sie eine 10-divisibel Verdünnung der Lösung konzentrierte Dithiothreitol (schleimlösende Agent) mit sterilem destilliertem Wasser 10 mL einer Lösung von 6,5 mM, gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erhalten. Hinweis: Zur Vermeidung von konzentrierten Dithiothreitol Lösung Vermischung mit Umgebungsluft zurückziehen der Lösung aus der Durchstechflasche mit eine sterile Spritze und Nadel. Nach dem Öffnen werden die Durchstechflasche konzentrierte Lösung bei Raumtemperatur aufbewahrt und innerhalb von 5 Tagen genutzt. Die verdünnte Lösung wird täglich frisch zubereitet. Achtung: Wegen Augen- und Hautreizungen Gefahr, tragen Sie Schutzausrüstung (Kleidung, Handschuhe und Schutzbrille).</li>
		<li>Machen Sie eine 5-fold Verdünnung der Lösung Trypan blau (0,4 %) mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) eine 0,08 % ige Lösung zu erhalten. Diese verdünnte Lösung bei Zimmertemperatur aufbewahren und innerhalb von 2 Wochen. Achtung: Wegen der krebserzeugenden Gefahren tragen Sie Schutzausrüstung (Kleidung, Handschuhe und Schutzbrille).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sammlung von Sputum überstand
	<ol>
		<li>Übertragen Sie ganze Sputum in ein 50 mL konischen Boden Kunststoffrohr und Wägen Sie die Probe.</li>
		<li>Fügen Sie ein 3-fold Gewicht des DPBS Lösung.</li>
		<li>Langsam Wirbel der Probe für 30 s.</li>
		<li>Zentrifuge bei 800 X g und 4 ° C für 10 Minuten.</li>
		<li>Filtern der Probe durch 2 Einzellagen steriler Gaze und den Überstand in ein 50 mL konischen Boden Kunststoffrohr zu sammeln.</li>
		<li>Aliquoten Überstand in 2 mL Kunststoff Rohre und bei-80 ° c aufbewahren Hinweis: Überstand Proben sind nützlich, um Sputum Fluiden Phase Komponenten bestimmen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sputum Mucolysis
	<ol>
		<li>Falls erforderlich, fügen Sie DPBS zum Zelle Pellet, ein Gesamtvolumen von 5 mL Zellsuspension zu erreichen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellsuspension mit 1 Volumen von 6,5 mM Dithiothreitol. Verwenden Sie einen Bank-Rocker die Zellsuspension für 20 min bei Raumtemperatur zu rocken.<ol>
			<li>Wiederholen Sie mindestens 3 Mal mit DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die verdünnter Zellsuspension bei 550 x g und 4 ° C für 10 min.</li></ol></li></ol>Verwerfen Sie den überstand.
		<li>Die Zelle-Pellets in etwa 1 mL des DPBS aufzuwirbeln.</li>
	
	
	<li>Bewertung der qualitativen Eigenschaften der Sputum Probe (Zellkonzentration, Plattenepithelkarzinom Kontamination und Lebensfähigkeit von Trypan blau-Ausschluss-Methode) von Hemocytometer Graf
	<ol>
		<li>Bewerten Sie und notieren Sie die genaue Menge der Zellsuspension.</li>
		<li>50 µL der Lösung 0,08 % Trypan blau 50 µL Zellsuspension hinzu und homogenisieren.</li>
		<li>Legen Sie die Probe unter dem Deckglas ein Hemocytometer (Thoma-Kammer) und legen Sie es unter dem Lichtmikroskop (400 X).</li>
		<li>Die Plattenepithelzellen, die lebenden nicht-Plattenepithelkarzinom Zellen (ungefärbt) und die Toten Plattenepithelkarzinom Zellen zählen (blau gefärbte Zellen). Hinweis: Bei zu niedriger oder zu hoher Zelldichte, konzentrieren Sie oder verdünnen Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie die Schritte 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Zellkonzentration der Suspension, den Prozentsatz der Plattenepithelzellen und der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der nicht-Plattenepithelien. Hinweis: Berechnen Sie die gesamten nicht-Plattenepithelkarzinom Graf/g Sputum: Handy-Konzentration der Suspension (Schritt 5.4) * Volumen der Zellsuspension (Schritt 4.8) * % der nicht-Plattenepithelien / Gewicht der Sputum Probe (Schritt 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der gefärbten Cytospin schieben mit der Zellsuspension und Speicherung der verbleibenden Zellen bei Bedarf Hinweis: Wenn die Zellsuspension enthält mehr als 80 % Plattenepithelkarzinom Zellen, die Probe gilt als Armen Qualität und ungeeignet für eine Cytospin Folie14. In diesem Fall die Verarbeitung unterbrechen und betrachten in diesem Beispiel nicht erfolgreich.<ol>
		<li>Ein Aliquot der Zellsuspension mit DPBS mindestens 350 µL Zellsuspension bei 500.000 Zellen/mL zu verdünnen.</li>
		<li>Montieren Sie die Zelle Konzentrator gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Füllen Sie jede der 3 Fächer des Konzentrators Zelle mit 100 µL dieser Zellsuspension.</li>
		<li>In einem Cytocentrifuge spin für 2 min bei 150 x g und Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Überstände.</li>
		<li>Zerlegen des Zelle Konzentrators gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen. Hinweis: In diesem Stadium können verbleibende Zellen in einem ausreichenden Puffer gespeichert werden bei Bedarf für weitere Experimente.</li>
		<li>Fleck, die Folie mit einem kommerziellen Färbung kit (siehe die Tabelle der Materialien), gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Montieren Sie die Folie mit einer geeigneten Eindeckmittel und einem Deckglas.</li>
		<li>Legen Sie die Folie unter dem Lichtmikroskop (600 X) mit Ölimmersion.</li>
		<li>Zählen Sie mindestens 500 nicht-Plattenepithelien: Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen. Hinweis: Differential Zellenzahl erfolgt in der Regel nur von einem oder zwei gewidmet und geschulte Beobachter, interobserver Diskrepanzen zu begrenzen.</li>
		<li>Rekord Absolute Werte und Prozentangaben der einzelnen Zelle.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts%3A+their+usefulness+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li>
<li>Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+induced+sputum+to+investigate+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">The use of induced sputum to investigate airway inflammation.</a> Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).</li>
<li>Leigh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+induction+for+diagnosis+of+Pneumocystis+carinii+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia.</a> The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).</li>
<li>Pin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+induced+sputum+cell+counts+to+investigate+airway+inflammation+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma.</a> Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).</li>
<li>Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+sputum+induction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Safety of sputum induction.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).</li>
<li>Delvaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulised+salbutamol+administered+during+sputum+induction+improves+bronchoprotection+in+patients+with+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma.</a> Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).</li>
<li>Efthimiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+sputum+processing+for+cell+counts%2C+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).</li>
<li>Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12361360">Analysis of fluid-phase mediators.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).</li>
<li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+sputum%3A+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li>
<li>Vignola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Future directions.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).</li>
<li>Brightling, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16685028">Clinical applications of induced sputum.</a> Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).</li>
<li>Miller, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16055882">Standardisation of spirometry.</a> European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).</li>
<li>Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ginasthma.org/">http://www.ginasthma.org/</a> (2017).</li>
<li>Szefler, S. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3390196/">Asthma outcomes: biomarkers.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).</li>
<li>Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-eosinophilic+asthma%3A+importance+and+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms.</a> Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).</li>
<li>Schleich, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+concomitant+local+and+systemic+eosinophilia+in+uncontrolled+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma.</a> The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).</li>
<li>Demarche, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+sputum+and+systemic+inflammation+in+asthma+phenotypes%3A+are+paucigranulocytic+asthmatics+really+non-inflammatory%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+pulmonary+medicine%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory?</a> BMC pulmonary medicine. 16, 46(2016).</li>
<li>Pavord, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+assessment+of+airway+inflammation+using+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum.</a> The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s(2002).</li>
<li>Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+biomarkers+in+IPF%3A+Evidence+for+raised+gene+expression+and+protein+level+of+IGFBP-2%2C+IL-8+and+MMP-7%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0171344(2017).</li>
<li>Green, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+exacerbations+and+sputum+eosinophil+counts%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial.</a> Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).</li>
<li>Siva, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophilic+airway+inflammation+and+exacerbations+of+COPD%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial.</a> European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).</li>
<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+infiltration%2C+ICAM-1+expression%2C+and+eosinophil+chemotactic+activity+in+asthmatic+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).</li>
<li>Maes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+inflammatory+phenotypes+show+differential+microRNA+expression+in+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).</li>
<li>Moermans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+systemic+cellular+inflammation+and+cytokine+release+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).</li>
<li>Gibson, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://erj.ersjournals.com/content/20/37_suppl/44s">Sputum induction in children.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).</li>
<li>Reddel, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Official+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society+Statement%3A+Asthma+Control+and+Exacerbations%3A+Standardizing+Endpoints+for+Clinical+Asthma+Trials+and+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).</li>
<li>Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+eosinophil+apoptosis+in+induced+sputum+correlates+with+asthma+severity%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity.</a> The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).</li>
<li>Demarche, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+Control+and+Sputum+Eosinophils%3A+A+Longitudinal+Study+in+Daily+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%3A+In+Practice%22%5BJournal%5D)">Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).</li>
<li>Belda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts in healthy adults.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).</li>
<li>Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+airway+neutrophilia+and+ageing+in+asthmatics+and+non-asthmatics%3A+Airway+neutrophilia+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing.</a> Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).</li>
<li>Thomas, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+age+on+induced+sputum+differential+cell+counts+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects.</a> Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).</li>
<li>Chalmers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking+and+airway+inflammation+in+patients+with+mild+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma.</a> Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).</li>
<li>Hansel, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+Nasal+and+Bronchial+Cytokines+and+Chemokines+Following+Experimental+Rhinovirus+Infection+in+Allergic+Asthma%3A+Increased+Interferons+%28IFN-%CE%B3+and+IFN-%CE%BB%29+and+Type+2+Inflammation+%28IL-5+and+IL-13%29%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13).</a> EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).</li>
<li>Popov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis).</a> European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).</li>
<li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li>
<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li>
<li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li>
<li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum%3A+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die induzierte Sputum-Methode ist ein nützliches Werkzeug, um die Atemwege Fach zu studieren. Es gibt mehrere mögliche Anwendungen dieser Technik. Erstens kann es wissen über Immunzellen und Mechanismen, die in verschiedenen Erkrankungen der Atemwege verbessern. Zum Beispiel dieser Technik hat die Untersuchung der Atemwege Entzündung im großen Kohorten von Patienten erlaubt, und es hat sich gezeigt, dass etwa die Hälfte der Asthma-Patienten durch eine abnorme Atemwege Eosinophile Entzündung15, gekennzeichnet sind 16 , 17, während COPD-Patienten weisen in der Regel eine erhöhte Sputum Neutrophilen zählen18. Diese Technik hat auch beigetragen, um bessere Charakterisierung der Entzündung der Atemwege bei Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose und Beweise Mediatoren, die zu dieser Krankheit19beitragen können. Zweitens kann die Technik induzierte Sputum vorherzusagen Reaktion auf die Behandlung hilfreich sein. Zum Beispiel das Vorhandensein einer abnormen Prozentsatz der Auswurf Eosinophile nachweislich eine prädiktive Marker Kortikosteroid Reaktionsfähigkeit11,18sein. Asthma und COPD zeigte Anpassung der Dosis von Kortikosteroiden, den Prozentsatz der Auswurf Eosinophile normalisieren sich mehr wirksam bei der Verringerung der Zahl der Exazerbationen als Anpassung der Behandlung nach den aktuellen klinischen Richtlinien11 ,20,21. Drittens kann Sputum Analyse helfen, um gezielte Therapien zu entwickeln. Zum Beispiel hat die Anwesenheit von eine abnorme Anzahl von neutrophilen Granulozyten Sputum in COPD und Asthma-Patienten zur Entwicklung der antineutrophilic Behandlungen11geführt. Viertens kann die Technik eine Rolle bei der Diagnose. Das Vorhandensein von Sputum Eosinophilie ist beispielsweise notwendig, um eine Diagnose von nicht-asthmatischen Eosinophile Bronchitis11.
Neben der Erlangung einer differenziellen Zellzahl, erlaubt die Technik der Induktion Auswurf auch die Durchführung von viele zusätzliche Analysen, durch das Studium entweder Sputum überstand oder Sputum Zellen. Beispiele mit Sputum überstand die Analyse der Mediatoren8,19,22 und die Bewertung der chemotaktische Aktivität der Probe für Eosinophile22. Aus Sputum Zellen RNA kann extrahiert und verwendet für MicroRNA oder Genexpression analysiert19,23 . Die Auswurf-Zellen können auch durch Flow Cytometry9,23 ermöglicht unter anderem die Immunphänotypisierung und Sortieren von Zellen analysiert werden. Darüber hinaus kann Sputum Zellen kultiviert10sein können, und ihre Vermittler-Produktion gemessene in-vitro-24. Es ist erwähnenswert, dass in diesem Fall, der Mediator Inhalt unterscheidet sich von was im Sputum überstand gefunden werden kann. In der Tat können Mediatoren im Sputum Überstand durch Sekrete aus den Atemwegen resident Zellen und Plasma Exsudation, im Gegensatz zu den Auswurf Zelle Kultur Modell24beeinflusst werden. Zu guter Letzt kann Immunocytochemistry und in Situ Hybridisierung auch mit Auswurf Zellen7durchgeführt werden.
Die induzierte Sputum-Technik hat einige Einschränkungen. Die Induktion muss unter ärztlicher Aufsicht durchgeführt werden. Es ist auch wichtig für den Betreiber, genaue Anweisungen für die Patienten zu geben. Andere Einschränkungen umfassen die Zusammenarbeit und den Gesundheitszustand des Patienten, wie respiratorische Anstrengungen erforderlich sind. Bezüglich der Machbarkeit dieser Technik bei Kindern haben mehrere Studien berichtet, dass es erfolgreich und sicher bei Kindern älter als 6 Jahre alt25war. Daten über Kinder der &#60; 6. Lebensjahr fehlen25, aber es ist wahrscheinlich, dass Sputum Induktion schwierig in diesen Kindern14durchzuführen ist. Die Technik beschränkt sich derzeit auf Dienstleistungen und spezialisierten Zentren zu erforschen, weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal1 erfordert. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Technik der Auswurf Induktion und Analyse ist nicht immer erfolgreich, was bedeutet, dass eine lesbare Cytospin26nicht immer erreicht wird. Die Erfolgsquote ist jedoch in der Regel ca. 80 % in verschiedenen Kohorten von Patienten4,26,27,28,29. Zu guter Letzt muss Vorsicht beim Vergleich verschiedener Kohorten von Patienten über die passenden Alters, wie es gezeigt wurde, um die Auswirkungen der Auswurf Zelle zählen30,31. Ebenso haben andere Parameter wie Geschlecht und Tabak Gewohnheiten angepasst werden, da sie auch mit dem Sputum Zelle zählen29,32stören können. Wenn Patienten Abgleich nicht möglich ist, ist eine weitere Möglichkeit, Alter, Geschlecht oder Rauchen Status berücksichtigen die statistische Auswertung für diese Eigenschaften anzupassen.
Im Vergleich zu anderen Techniken, die es ermöglichen, sammeln von Zellen von Airways, wie Biopsien und alvéolaire Lavages hat induzierte Sputum-Methode die Vorteile des Seins einfach, gut verträglich, sicher, reproduzierbar, kostengünstig und nicht-invasive. Diese Vorteile ermöglichen die induzierte Sputum-Technik in großem Maßstab und wiederholt im Laufe der Zeit durchgeführt werden, und machen es zu einer Alternative der Wahl für die Atemwege Probenahme. Bronchosorption ist eine andere Technik ermöglicht die Sammlung der Schleimhaut Flüssigkeit um Atemwege Mediatoren33zu bewerten. Während diese Technik (die Bronchoskopie) mehr invasiv als induzierte Sputum ist, hat es die Vorteile der Vermeidung von Verunreinigungen mit Speichel und höhere Konzentrationen von Mediatoren als alvéolaire Lavage33erhalten.
Wichtige Schritte brauchen Aufmerksamkeit im Protokoll. Erstens muss Vorsicht über die saline Konzentration und die Zeit der Induktion, weil diese beiden Parameter können Einfluss auf die Ergebnisse und daher standardisierte34,35 müssen. Zweitens ist die Mucolysis mit DVB-t-ein wichtiger Schritt der Verarbeitung. Im Vergleich zu PBS zeigte sich DVB-t besser Sputum Zellen7, zu zerstreuen, die verbessert die Cytopsin Folie und ist sehr wichtig, eine reproduzierbare Zelle zählen2. Jedoch kann die schleimlösende Agent mit der Messung von biochemischen Komponenten stören.Spick Experimente sollten dann durchgeführt werden, wenn eine neue biochemische Verbindung36messen. Schließlich ist ein weiterer wichtiger Schritt des Verfahrens der Zelle zählen Schritt, die von einem geschulten Techniker, zuverlässig und interpretierbare Ergebnisse gewährleisten durchgeführt werden müssen.
Eine alternative Methode mit Auswurf Stecker (zähflüssig oder dichteren Teile), statt die ganze Sputum wird auch in der Literatur7beschrieben. Beide Verfahren haben vor- und Nachteile. Die ganze Sputum-Technik ermöglicht die schnellere Verarbeitung7, aber ist häufig kontaminiert mit Speichel, die die Probe verdünnt und kann die Qualität der Cytospins2,7reduzieren. Mit der Stecker-Auswahl-Technik wird die Speichel Kontamination reduziert, was bedeutet, dass Proben oft von besserer Qualität für die Dosierung von Fluiden Phase Mediatoren und Cytospin Folien7. Die Verarbeitung ist jedoch länger7 und ausgewählten Stecker möglicherweise nicht repräsentativ für die gesamte Probe-37. Es ist auch erwähnenswert, dass nicht alle Proben Stecker, enthalten, die begrenzt werden können. Beide Methoden sind validierte und reproduzierbare und derzeit gibt es keine Beweise, dass die differenzielle Zellenzahlen von beiden Methoden erhalten verschiedene14,38.
In Zukunft könnte induzierte Sputum als klinische Werkzeug Biomarker für die Untersuchung, Diagnose und Behandlung aller Arten von entzündlichen Erkrankungen der Atemwege zu verwendet werden.

Verschiedene Methoden werden verwendet, um Entzündungen der Atemwege zu untersuchen: direkte Messungen (wie bronchiale Biopsien oder alvéolaire Lavages) und indirekte Methoden (wie Symptom Bewertung, Bluttests Probe Analyse und Lunge Funktion)1. Die direkte Techniken haben den Vorteil, zuverlässig beurteilen die Entzündung der Atemwege, aber sie sind invasive und nicht machbar im großen Maßstab wegen Patienten Beschwerden und das Risiko entstehen1. Wie bei der indirekten Methoden korrelieren sie schlecht mit der direkten Beurteilung der Atemwege Entzündung1.
Sputumansammlung ist eine weitere Möglichkeit, Sample-Zellen der Atemwege und ermöglicht die direkte Beurteilung der Entzündung der Atemwege. Dennoch produzieren Sputum spontan zu Proben von schlechter Qualität führen kann und ist nicht für alle Patienten2möglich. Dieses Problem konnte gelöst werden, mithilfe von Ultraschall vernebelt hypertonen Kochsalzlösung Sputum Produktion2induzieren. Diese Methode diente zunächst zur Diagnose von Pneumocystis-Carinii -Pneumonie-3 bei Patienten mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert und wurde für gesunden Probanden und Asthmatiker in 19924angepasst. Sputum Induktion kann auch bei schweren Patienten mit isotonischer Kochsalzlösung5. Obwohl in der Regel gut vertragen, kann die Inhalation von Kochsalzlösung Bronchospasmus bei Patienten mit hyperreaktiven Airways5führen. Daher wird es empfohlen, einen kurzwirksamen Beta-Agonisten vor dem Verfahren1. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt, dass die Salzlösung in der Ultraschallvernebler Salbutamol hinzufügen weiter dieses Risiko6 verringert. Die Vorteile der Auswurf Induktion ist, dass es nicht-invasive2 und sichere, wenn die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden5.
Für die Verarbeitung von Sputum Proben, werden derzeit zwei Methoden in der Literatur verwendet: die ganze Sputum-Technik und die Stecker Auswahl7. In unserem Labor erfolgt die gesamte Sputum-Technik. Das primäre Ziel der Auswurf-Verarbeitung ist eine differenzielle Zellzahl um die Art der Entzündung in das Lumen der Atemwege vorhanden Studie zu erhalten. Viele weitere Analysen sind jedoch auch möglich, weitere entzündliche Prozesse und Abwehrmechanismen, durch das Studium der Mediatoren im Sputum überstand8 oder indem die Detailuntersuchung auf Auswurf Zellen untersuchen (z.B. , flow Cytometry9, Zelle Kulturen10, Genomics10, Proteomics10, Immunocytochemistry7, in Situ Hybridisierung7, etc.)
Die Technik der Auswurf Induktion und Analyse beschränkt sich derzeit auf Dienstleistungen und spezialisierten Zentren in der klinischen Praxis zu erforschen, weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal1 erfordert. Entzündungen der Atemwege kann mit dieser Methode für verschiedene Erkrankungen der Atemwege wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), chronischer Husten oder idiopathischer Lungenfibrose11untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>Spirometer - Spirobank</td><td>MIR Frankreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>Siehe Medikament erhältlich im Land</td></tr><tr><td>Vernebler UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb Einwegbecher & Deckel</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>DeVilbiss Bakterienfilter für UltraNeb-Vernebler</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>Einwegventile</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>Einwegventile</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol-T-Verbinder</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>Beatmungskreislauf Einarm-Wellpappe</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&nbsp;</td><td>/</td><td>/</td><td>Hergestellt von unserer Krankenhausapotheke</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0,9%</td><td>B.Braun Medical&nbsp; Diegem Belgien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol sulfat 5 mg/mL - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>Siehe Medikament im Land erhältlich</td></tr><tr><td>Ipratropiumbromid 0,25 mg/2 mL - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Deutschland</td><td>CNK: 1543-305</td><td>Siehe Medikament im Land erhältlich</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline</td><td>LONZA Belgien</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Sputolysin Reagenz</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau 0,4% Lösung 100 mL</td><td>LONZA Bio Whittaker Belgien</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer - Thoma chamber</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor Färbeset</td><td>Merck Belgien</td><td>1116610001</td><td>Alternatives Produkt: Diff Quik Färbeset &nbsp; Medion Diagnose&nbsp;</td></tr><tr><td>Eindeckmedium - Entellan</td><td>Merck Belgium</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Belgien</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

methodik für sputum induktion und labor-verarbeitung

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Die Technik der Auswurf Induktion und Verarbeitung ist eine anerkannte nicht-invasive Methode ermöglicht die Erfassung und Analyse von Zellen aus den Atemwegen in interessante verschiedene Erkrankungen der Atemwege wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), chronischer Husten oder idiopathischer Lungenfibrose. Diese Technik ist gut verträglich, sicher und nicht-invasive, aber beschränkt sich derzeit auf Forschungsservice und spezialisierten Zentren in der klinischen Praxis weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal erfordert. Die Erfolgsquote der Auswurf Induktion und Analyse ist etwa 80 %.
Hier beschreiben wir die Induktion und Labor Verarbeitung von Sputum Proben. Auswurf wird durch das Einatmen von hypertonen oder isotonische Kochsalzlösung mit Salbutamol induziert. Für die Verarbeitung verwenden wir die ganze Sputum-Technik. Dithiothreitol (DTT) wird verwendet, um Mucolysis von Sputum Proben zu ermöglichen. Das primäre Ziel der Auswurf-Verarbeitung ist eine differenzielle Zellzahl zur Untersuchung in das Lumen der Atemwege vorhanden Zelltypen zu erhalten. Zusätzliche Analysen können auch durchgeführt werden, auf Sputum überstand und Auswurf-Zellen, die weitere Untersuchung entzündliche Prozesse und Abwehrmechanismen ermöglichen können. Beispiele hierfür sind Mediatoren im Sputum überstand zu studieren und ein breites Spektrum von Analysen auf der Auswurf Zellen wie Durchflusszytometrie, Genomik und Proteomik.
Schließlich werden repräsentative Ergebnisse der Auswurf Analyse in gesunden Kontrollpersonen, Asthmatiker und COPD-Patienten dargestellt.

Hemocytometer Ein typisches Bild ist in Abbildung 1 dargestellt, die mit dem Mikroskop mit Hilfe der Hemocytometer visualisiert wird. Plattenepithelien sind leicht erkennbar, da sie viel größer als die nicht-Plattenepithel-Zellen sind. Diese Plattenepithelzellen sind Epithelzellen aus dem Mund kommen. Beide Arten von Zellen werden durch Trypan blau, wenn tote gefärbt. Vorsicht muß genommen werden, zu zählen, Hefen, Bakterien und Schrott.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Hemocytometer Abbildung (A) ihren Lebensunterhalt nicht-Plattenepithelkarzinom, (B) einen Toten nicht-Plattenepithelkarzinom und (C) ein Plattenepithelkarzinom Zelle. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Cytospin Folie: Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Bild der Cytospin Folie nach Auswurf Verarbeitung erhalten. Die verschiedenen Zelltypen (Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen) können durch ihre Morphologie und Färbung unterschieden werden. In einigen Fällen Kontamination durch Plattenepithelien kann wichtig sein und wenn der Prozentsatz der Plattenepithelien größer als 80 % ist, gilt die Probe erfolglos (Abbildung 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Cytospin Folie Bild (A) eine Neutrophilen, (B) eine Makrophage, (C) eine Eosinophilen (D) eine Lymphozyten und (E) eine Epithelzelle. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Beispiel für eine schlechte Qualität Cytospin Folie mit &gt; 80 % der Plattenepithelzellen. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Erfolgsquote In unserer Abteilung die Erfolgsrate des Verfahrens (eine Kombination aus einer erfolgreichen Einarbeitung und eine lesbare Cytospin), basierend auf einer Stichprobe von 1.129 Patienten (gesunden Probanden, Asthma oder COPD-Patienten), 82 % (924/1.129). In einem Sub-Analyse nach der Art des Patienten ist die Erfolgsquote bei 75 % (57/76) bei gesunden Probanden, 82 % (827/1.004) bei Asthmatikern und 82 % (40/49) bei COPD-Patienten.
Ergebnisse bei gesunden Probanden In einer retrospektiven Analyse einer Reihe von 289 gesunden Probanden aus unserer Abteilung, der Median (Interquartilbereich) Auswurf Gewicht war 3,72 g (Interquartilbereich 2,46 g - 5,54 g) und die mittlere total nicht-Plattenepithelkarzinom Graf/g Sputum 0,59 x6 (10) Interquartilbereich 0,37 x 106 - 1,29 x 106).
Bei den gesunden Probanden der Anteil der Plattenepithelien ist gering und liegt bei 19 % (10 % bis 34 %) und die Lebensfähigkeit ist hoch bei 66 % (54-78 %). Bezüglich der Anteil der verschiedenen Zelltypen werden die Ergebnisse in Abbildung 4Azusammengefasst. Wir können beobachten, dass der Prozentsatz von Makrophagen (49 % [31-68 %]) ist höher als der Anteil der Neutrophilen (34 % [14 % - 60 %]), während der Anteil der Lymphozyten (2 % [1-3]), eosinophile (0 % [0-0 %]) und Epithelzellen (4 % [2-11 %]) sind niedrig. Diese Ergebnisse ähneln, wenn Daten in absoluten Werten (Abbildung 4 b) ausgedrückt werden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse für die differenzielle Zellzahl bei gesunden Probanden, ausgedrückt als Prozentsätze (A) oder (B) Absolutwerte beobachtet. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Es ist auch wichtig, das Alter der Patienten zu berücksichtigen. In der Tat ist eine starke Korrelation zwischen Alter des Patienten und der Anteil der Neutrophilen im Sputum Proben (Abbildung 5). Ebenso, wenn Patienten nach 10-Jahres-Altersgruppen (Abbildung 6) klassifizieren, beobachteten wir eine deutliche Zunahme der Neutrophilen Anteil mit zunehmendem Alter. Daher diese Variable betrachtet werden, wenn Sie Ergebnisse aus verschiedenen Kohorten zu vergleichen, und Vorsicht getroffen werden, in die passenden Themen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Korrelation zwischen Alter und Auswurf Neutrophilenzahl Prozentsatz. Die Korrelation wurde berechnet mit der Spearman-Test. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Evolution der Neutrophilen Anteil entsprechend der Lebensaltersstufe. Der p-Wert von ANOVA war &lt; 0,0001 für den Vergleich der Neutrophilen Prozentsatz zwischen Altersklassen. Mehrere Vergleiche wurden mit Dunns multiple Vergleiche-Test gemacht. Die p-Werte sind wie folgt dargestellt: * p &lt; 0,05, ** p &lt; 0.01 und *** p &lt; 0,001. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergebnisse bei Patienten mit Erkrankungen der Atemwege Die Technik der induzierte Sputum wird häufig verwendet, das entzündliche Zelle Profil bei asthmatischen Patienten beurteilen.Diese Technik kann auch für Patienten mit COPD, einer anderen entzündlichen Erkrankung der Atemwege angewendet werden. Beim Vergleich von gesunden Probanden, Asthmatiker und COPD-Patienten (die 3 Gruppen für Alter, Geschlecht und Tabak Gewohnheiten verglichen wird), haben wir beobachtet, dass die entzündlichen Zelle Profil zwischen diese Kohorten (Abbildung 7 unterscheidet). In der Tat, Asthma-Patienten in der Regel erhöhte Sputum Eosinophile, zeichnen sich durch während der Anteil der Neutrophilen Auswurf bei COPD-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen in der Regel höher ist, ist mit der Schwere der Erkrankung verbunden.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
Abbildung 7 : Sputum entzündliche Zelle Profil von gesunden Probanden (n = 45), Asthma-Patienten (n = 108), und COPD-Patienten (n = 54). Die drei Gruppen wurden für Geschlecht, Alter und Tabak Gewohnheiten abgestimmt. Die p-Werte der ANOVA waren &lt; 0,05, &lt; 0,0001, und &lt; 0,0001 für den Vergleich der Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten und Makrophagen zwischen Gruppen, beziehungsweise. Mehrere Vergleiche wurden mit Dunns multiple Vergleiche-Test gemacht. Die p-Werte sind wie folgt dargestellt: * p &lt; 0,05 und *** p &lt; 0,001. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier beschreiben wir die Technik der Auswurf Induktion. Dieses Protokoll erklärt auch das Sputum Verarbeitung auszuführenden differenzielle Zellzahl und Auswurf überstand zu sammeln und Zellen zur weiteren Analyse.

Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Die Technik des induzierten Sputums wurde Anfang der 90er Jahre entwickelt. Die Technik wurde vorgeschlagen, um neue Informationen über obstruktive Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD zu untersuchen, und in jüngster Zeit besteht auch ein Interesse daran, neue Informationen bei Lungenfibrose zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Gegensatz zur Bronchoskopie relativ nicht-invasiv ist.Die Verarbeitung erfordert Laborarbeit, und sie braucht Zeit, also ist sie ziemlich anspruchsvoll, zeitaufwändig, und es erfordert eine gewisse Expertise im Labor, also ist es eindeutig eine Technik, die in jedem Zentrum schwer zu bekommen ist. Die Technik des induzierten Sputums besteht aus zwei Teilen, der erste Teil ist die Induktion und der zweite Teil ist die Verarbeitung. Bevor wir einen Auswurf induzieren, müssen wir eine Spirometrie durchführen, d. h. eine Beurteilung des Volumens und der Flussrate, die der Patient erzeugen kann.Und das müssen wir tun, weil die Sputum-Induktion an sich Bronchiospasmus verursachen kann, also müssen wir unbedingt den Ausgangswert der Spirometrie der Patienten kennen. Wir führen also zuerst eine Spirometrie durch, dann geben wir den Patienten Bronchodilatatoren, wir geben in der Regel 400 Mikrogramm Salbutamol, um die Atemwege der Patienten maximal zu öffnen und auch um einen Bronchiospasmus zu verhindern, der während der Induktionsphase auftreten kann. Und nach 15 Minuten messen wir erneut die Spirometrie, um das zu erhalten, was wir den Ausgangswert der Spirometrie nennen, und insbesondere schauen wir uns den FEV1 an, das ist das Volumen, das der Patient innerhalb einer Sekunde ausatmen kann.Gießen Sie destilliertes Wasser bis zum empfohlenen Füllstand in die Verneblerkammer. Stellen Sie einen sauberen Becher in die Verneblerkammer. Decken Sie die gefüllte Kappe mit dem entsprechenden Deckel ab.Füllen Sie den Becher mit 50 ml hypertonischer Kochsalzlösung 5 %, wenn der FEV1 nach dem Bronchodilatator höher als 65 % ist, oder mit 50 ml isotonischer Kochsalzlösung 9 %, wenn der FEV1 nach dem Bronchodilatator weniger als 65 % vorhergesagt wird. Geben Sie 1,75 Salbutamolsulfatlösung in einer Konzentration von fünf Milligramm pro ml in die Tasse. Schließen Sie die Rohre und Ventile gemäß den Anweisungen des Herstellers an.Die Technik muss unter ärztlicher Aufsicht durchgeführt werden. Erklären Sie dem Patienten das Prinzip des Tests. Bitten Sie den Patienten, eine Nasenklammer zu verwenden.Starten Sie den Vernebler und wählen Sie die niedrigste Stufe der Aerosol- und Lüftereinstellung. Bitten Sie den Patienten, das Aerosol durch das Mundstück mit Gezeitenatmung einzuatmen. Die Einstellung des Aerosols und des Lüfters kann je nach Verträglichkeit des Patienten erhöht werden.Im Falle eines Engegefühls in der Brust oder Atembeschwerden beenden Sie den Eingriff und führen Sie eine Spirometrie durch, um den FEV1-Wert des Patienten zu messen. Nach der fünfminütigen Inhalation oder bei Husten oder Übelkeit stoppen Sie den Vernebler. Bitten Sie den Patienten, die Nasenklammer zu entfernen, den Mund auszuspülen und zweimal mit Leitungswasser zu gurgeln und dieses Wasser in das Waschbecken zu werfen.Dann hustet der Patient Auswurf aus und spuckt das, was aus dem Rachen kommt, in einen Plastikbehälter. Führen Sie das erste Atemmanöver zur Messung von FEV1 durch. Nach jedem Versuch der Sputumproduktion messen wir den FEV1-Wert.Wenn der FEV1-Wert um mehr als 20% sinkt, beenden wir den Eingriff und vernebeln den Patienten Ipratropiumbromid, ein Anticholinergikum, das in Kombination mit Beta-2-Agonisten wirkt, die wir bereits während des Eingriffs verabreicht haben. Wenn der FEV1-Wert nicht um mehr als 20 % sinkt, führen wir den Eingriff für eine Gesamtzeit von 10 bis 20 Minuten durch, je nach Qualität und Menge des vom Patienten produzierten Sputums. Sobald Sie die Probe des Auswurfs erhalten haben, bewahren Sie sie bis zur Verarbeitung im Kühlschrank auf.Der zweite Teil besteht also aus der Sputumverarbeitung, und dafür müssen wir zuerst die beiden Lösungen vorbereiten, die wir für diese Verarbeitung verwenden werden. Also müssen wir das Dithiothreitol, auch bekannt als DTT, vorbereiten. Die Lösung muss durch Verdünnung des DVB-Ts mit sterilem Wasser hergestellt werden, um eine 6,5 millimolare Lösung zu erhalten.Sie müssen also vermeiden, das DVB-T der Umgebungsluft auszusetzen, und dafür verwenden wir eine Spritze und eine Nadel. Zweitens müssen Sie die Trypanblau-Lösung vorbereiten, und dafür müssen Sie eine Verdünnung von DPBS mit Trypanblau durchführen, um eine Lösung von 0,08% zu erhalten. Was den Sputum betrifft, so müssen Sie das gesamte Sputum in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen mit konischem Boden überführen und die Probe wiegen. Fügen Sie ein dreifaches Gewicht DPBS-Lösung hinzu.Die Probe 30 Sekunden lang langsam vortexen, 10 Minuten bei 800 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand in einem 50-ml-Kunststoffröhrchen mit konischem Boden, nachdem Sie durch zwei einzelne Schichten steriler Gaze filtriert wurden. Den Überstand in 2-ml-Kunststoffröhrchen geben und bei minus 80 Grad Celsius lagern.Es ist zu beachten, dass die überstehenden Proben für uns als dreiphasige Komponente des Sputums nützlich sind. Wenn das Volumen der Zellpalette weniger als 5 ml beträgt, fügen Sie DPBS hinzu, um ein Volumen von 5 ml Zellsuspension zu erreichen. Die Zellsuspension wird mit einem Volumen DTT bei 6,5 mmmolar verdünnt.Schütteln Sie die Zellensuspension 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Tischarbeiter. Verdünnen Sie die Zellsuspension mindestens dreimal mit DPBS. Die verdünnte Zellsuspension wird bei 550 g 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zellpalette in etwa einem ml DPBS. Beurteilen und protokollieren Sie das genaue Volumen der Zellsuspension.50 Mikroliter Zellsuspension zu 50 Mikrolitern der verdünnten Trypanblaulösung geben und homogenisieren. Legen Sie die Probe unter den Deckschirm eines Hämocil-Zytometers und legen Sie sie unter ein optisches Mikroskop. Beurteilen Sie die Zellkonzentration der Zellsuspension, den Prozentsatz der Plattenepithelzellen und den Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Nicht-Plattenepithelzellen.Verdünnen Sie eine Zuteilung der Suspension mit DPBS, um mindestens 350 Mikroliter Zellsuspension bei 500.000 Zellen pro ml zu erhalten. Montieren Sie den Zellkonzentrator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jedes der drei Kompartimente des Zellkonzentrators.Zwei Minuten bei 150 g bei Raumtemperatur in einer Zytozentrifuge schleudern. Entsorgen Sie den Überstand. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen.Färben Sie den Objektträger mit div quick oder einem Nickelvalenz-Färbeset gemäß den Anweisungen des Herstellers. Montage mit Montagemedium und Deckglas. Legen Sie den Objektträger unter das optische Mikroskop mit Ölimmersionen.Zählen Sie mindestens 500 Nicht-Plattenepithelzellen, Neutrophile, Eosinophile, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen und notieren Sie die absoluten Werte, den Prozentsatz und den Zelltyp. Was die Ergebnisse betrifft, so müssen wir mit dem Hämozytometer die lebenden Nicht-Plattenepithelzellen zählen, die ungefärbt sind. Auch die abgestorbenen nicht-plattenepithelfarbenen Zellen, die blau gefärbt sind.Und die Plattenepithelzellen. Diese Zellen sind Epithelzellen, die aus dem Mund kommen. Sie sind groß, so dass sie im Vergleich zu den kleinen menschlichen Zellen leicht zu erkennen sind.Man muss also vermeiden, auch Bakterien, Hefen oder Schrott zu zählen. Enthält die Zellsuspension mehr als 80 % Plattenepithelzellen, gilt diese Probe als minderwertig und für einen Cytospin-Objektträger ungeeignet. Diese Stichprobe gilt daher als nicht erfolgreich.Die Zählung auf dem gefärbten Cytospin erfolgt entsprechend der Farbe der Zellen und ihrer Morphologie. Die Neutrophilen, das Hauptmerkmal ist der multilobulierte Kern, der die Zellen leicht zu identifizieren machte. Diese Zellen sind rund, klein und in neutralem Rosa gefärbt.Die Eosinophilen, diese Zellen, bestehen aus roten Körnchen, die leicht zu identifizieren sind. Die Größe dieser Zellen liegt nahe an den Neutrophilen. Die Makrophagen sind zwei- bis fünfmal größer als die Neutrophilen und blau gefärbt.Das Zytoplasma kann Ablagerungen und Vakuolen enthalten. Die Lymphozyten, diese Zellen, sind rund und klein, blau gefärbt und besitzen einen großen und dichten Kern. Die Epithelzellen haben eine säulenförmige Form, sind rosa gefärbt und weisen oft oben Zilien auf.Hier sind einige Beispiele für unlesbare Cytospin-Proben mit mehr als 80% Plattenepithelzellen. Ich denke, es ist eine Technik, die sehr nützlich ist, aber wir müssen sehr vorsichtig sein, weil die Sputum-Induktion unter ärztlicher Aufsicht durchgeführt werden muss, aber die Technik der Sputum-Induktion gibt Ihnen viele Informationen über den Entzündungsstatus der Patienten in den Atemwegen. Es ermöglicht Ihnen, verschiedene biochemische Marker im Überstand zu messen, und Sie können auch verschiedene Dinge an den zellulären Teilen messen, so dass Sie mit induziertem Sputum Durchflusszytometrie, Proteomik, Transkriptomik und sogar Genomik durchführen können.

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