Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

Die Technik des induzierten Sputums wurde Anfang der 90er Jahre entwickelt. Die Technik wurde vorgeschlagen, um neue Informationen über obstruktive Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD zu untersuchen, und in jüngster Zeit besteht auch ein Interesse daran, neue Informationen bei Lungenfibrose zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Gegensatz zur Bronchoskopie relativ nicht-invasiv ist.

Die Verarbeitung erfordert Laborarbeit, und sie braucht Zeit, also ist sie ziemlich anspruchsvoll, zeitaufwändig, und es erfordert eine gewisse Expertise im Labor, also ist es eindeutig eine Technik, die in jedem Zentrum schwer zu bekommen ist. Die Technik des induzierten Sputums besteht aus zwei Teilen, der erste Teil ist die Induktion und der zweite Teil ist die Verarbeitung. Bevor wir einen Auswurf induzieren, müssen wir eine Spirometrie durchführen, d. h. eine Beurteilung des Volumens und der Flussrate, die der Patient erzeugen kann.

Und das müssen wir tun, weil die Sputum-Induktion an sich Bronchiospasmus verursachen kann, also müssen wir unbedingt den Ausgangswert der Spirometrie der Patienten kennen. Wir führen also zuerst eine Spirometrie durch, dann geben wir den Patienten Bronchodilatatoren, wir geben in der Regel 400 Mikrogramm Salbutamol, um die Atemwege der Patienten maximal zu öffnen und auch um einen Bronchiospasmus zu verhindern, der während der Induktionsphase auftreten kann. Und nach 15 Minuten messen wir erneut die Spirometrie, um das zu erhalten, was wir den Ausgangswert der Spirometrie nennen, und insbesondere schauen wir uns den FEV1 an, das ist das Volumen, das der Patient innerhalb einer Sekunde ausatmen kann.

Gießen Sie destilliertes Wasser bis zum empfohlenen Füllstand in die Verneblerkammer. Stellen Sie einen sauberen Becher in die Verneblerkammer. Decken Sie die gefüllte Kappe mit dem entsprechenden Deckel ab.

Füllen Sie den Becher mit 50 ml hypertonischer Kochsalzlösung 5 %, wenn der FEV1 nach dem Bronchodilatator höher als 65 % ist, oder mit 50 ml isotonischer Kochsalzlösung 9 %, wenn der FEV1 nach dem Bronchodilatator weniger als 65 % vorhergesagt wird. Geben Sie 1,75 Salbutamolsulfatlösung in einer Konzentration von fünf Milligramm pro ml in die Tasse. Schließen Sie die Rohre und Ventile gemäß den Anweisungen des Herstellers an.

Die Technik muss unter ärztlicher Aufsicht durchgeführt werden. Erklären Sie dem Patienten das Prinzip des Tests. Bitten Sie den Patienten, eine Nasenklammer zu verwenden.

Starten Sie den Vernebler und wählen Sie die niedrigste Stufe der Aerosol- und Lüftereinstellung. Bitten Sie den Patienten, das Aerosol durch das Mundstück mit Gezeitenatmung einzuatmen. Die Einstellung des Aerosols und des Lüfters kann je nach Verträglichkeit des Patienten erhöht werden.

Im Falle eines Engegefühls in der Brust oder Atembeschwerden beenden Sie den Eingriff und führen Sie eine Spirometrie durch, um den FEV1-Wert des Patienten zu messen. Nach der fünfminütigen Inhalation oder bei Husten oder Übelkeit stoppen Sie den Vernebler. Bitten Sie den Patienten, die Nasenklammer zu entfernen, den Mund auszuspülen und zweimal mit Leitungswasser zu gurgeln und dieses Wasser in das Waschbecken zu werfen.

Dann hustet der Patient Auswurf aus und spuckt das, was aus dem Rachen kommt, in einen Plastikbehälter. Führen Sie das erste Atemmanöver zur Messung von FEV1 durch. Nach jedem Versuch der Sputumproduktion messen wir den FEV1-Wert.

Wenn der FEV1-Wert um mehr als 20% sinkt, beenden wir den Eingriff und vernebeln den Patienten Ipratropiumbromid, ein Anticholinergikum, das in Kombination mit Beta-2-Agonisten wirkt, die wir bereits während des Eingriffs verabreicht haben. Wenn der FEV1-Wert nicht um mehr als 20 % sinkt, führen wir den Eingriff für eine Gesamtzeit von 10 bis 20 Minuten durch, je nach Qualität und Menge des vom Patienten produzierten Sputums. Sobald Sie die Probe des Auswurfs erhalten haben, bewahren Sie sie bis zur Verarbeitung im Kühlschrank auf.

Der zweite Teil besteht also aus der Sputumverarbeitung, und dafür müssen wir zuerst die beiden Lösungen vorbereiten, die wir für diese Verarbeitung verwenden werden. Also müssen wir das Dithiothreitol, auch bekannt als DTT, vorbereiten. Die Lösung muss durch Verdünnung des DVB-Ts mit sterilem Wasser hergestellt werden, um eine 6,5 millimolare Lösung zu erhalten.

Sie müssen also vermeiden, das DVB-T der Umgebungsluft auszusetzen, und dafür verwenden wir eine Spritze und eine Nadel. Zweitens müssen Sie die Trypanblau-Lösung vorbereiten, und dafür müssen Sie eine Verdünnung von DPBS mit Trypanblau durchführen, um eine Lösung von 0,08% zu erhalten. Was den Sputum betrifft, so müssen Sie das gesamte Sputum in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen mit konischem Boden überführen und die Probe wiegen. Fügen Sie ein dreifaches Gewicht DPBS-Lösung hinzu.

Die Probe 30 Sekunden lang langsam vortexen, 10 Minuten bei 800 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand in einem 50-ml-Kunststoffröhrchen mit konischem Boden, nachdem Sie durch zwei einzelne Schichten steriler Gaze filtriert wurden. Den Überstand in 2-ml-Kunststoffröhrchen geben und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Es ist zu beachten, dass die überstehenden Proben für uns als dreiphasige Komponente des Sputums nützlich sind. Wenn das Volumen der Zellpalette weniger als 5 ml beträgt, fügen Sie DPBS hinzu, um ein Volumen von 5 ml Zellsuspension zu erreichen. Die Zellsuspension wird mit einem Volumen DTT bei 6,5 mmmolar verdünnt.

Schütteln Sie die Zellensuspension 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Tischarbeiter. Verdünnen Sie die Zellsuspension mindestens dreimal mit DPBS. Die verdünnte Zellsuspension wird bei 550 g 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zellpalette in etwa einem ml DPBS. Beurteilen und protokollieren Sie das genaue Volumen der Zellsuspension.

50 Mikroliter Zellsuspension zu 50 Mikrolitern der verdünnten Trypanblaulösung geben und homogenisieren. Legen Sie die Probe unter den Deckschirm eines Hämocil-Zytometers und legen Sie sie unter ein optisches Mikroskop. Beurteilen Sie die Zellkonzentration der Zellsuspension, den Prozentsatz der Plattenepithelzellen und den Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Nicht-Plattenepithelzellen.

Verdünnen Sie eine Zuteilung der Suspension mit DPBS, um mindestens 350 Mikroliter Zellsuspension bei 500.000 Zellen pro ml zu erhalten. Montieren Sie den Zellkonzentrator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jedes der drei Kompartimente des Zellkonzentrators.

Zwei Minuten bei 150 g bei Raumtemperatur in einer Zytozentrifuge schleudern. Entsorgen Sie den Überstand. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen.

Färben Sie den Objektträger mit div quick oder einem Nickelvalenz-Färbeset gemäß den Anweisungen des Herstellers. Montage mit Montagemedium und Deckglas. Legen Sie den Objektträger unter das optische Mikroskop mit Ölimmersionen.

Zählen Sie mindestens 500 Nicht-Plattenepithelzellen, Neutrophile, Eosinophile, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen und notieren Sie die absoluten Werte, den Prozentsatz und den Zelltyp. Was die Ergebnisse betrifft, so müssen wir mit dem Hämozytometer die lebenden Nicht-Plattenepithelzellen zählen, die ungefärbt sind. Auch die abgestorbenen nicht-plattenepithelfarbenen Zellen, die blau gefärbt sind.

Und die Plattenepithelzellen. Diese Zellen sind Epithelzellen, die aus dem Mund kommen. Sie sind groß, so dass sie im Vergleich zu den kleinen menschlichen Zellen leicht zu erkennen sind.

Man muss also vermeiden, auch Bakterien, Hefen oder Schrott zu zählen. Enthält die Zellsuspension mehr als 80 % Plattenepithelzellen, gilt diese Probe als minderwertig und für einen Cytospin-Objektträger ungeeignet. Diese Stichprobe gilt daher als nicht erfolgreich.

Die Zählung auf dem gefärbten Cytospin erfolgt entsprechend der Farbe der Zellen und ihrer Morphologie. Die Neutrophilen, das Hauptmerkmal ist der multilobulierte Kern, der die Zellen leicht zu identifizieren machte. Diese Zellen sind rund, klein und in neutralem Rosa gefärbt.

Die Eosinophilen, diese Zellen, bestehen aus roten Körnchen, die leicht zu identifizieren sind. Die Größe dieser Zellen liegt nahe an den Neutrophilen. Die Makrophagen sind zwei- bis fünfmal größer als die Neutrophilen und blau gefärbt.

Das Zytoplasma kann Ablagerungen und Vakuolen enthalten. Die Lymphozyten, diese Zellen, sind rund und klein, blau gefärbt und besitzen einen großen und dichten Kern. Die Epithelzellen haben eine säulenförmige Form, sind rosa gefärbt und weisen oft oben Zilien auf.

Hier sind einige Beispiele für unlesbare Cytospin-Proben mit mehr als 80% Plattenepithelzellen. Ich denke, es ist eine Technik, die sehr nützlich ist, aber wir müssen sehr vorsichtig sein, weil die Sputum-Induktion unter ärztlicher Aufsicht durchgeführt werden muss, aber die Technik der Sputum-Induktion gibt Ihnen viele Informationen über den Entzündungsstatus der Patienten in den Atemwegen. Es ermöglicht Ihnen, verschiedene biochemische Marker im Überstand zu messen, und Sie können auch verschiedene Dinge an den zellulären Teilen messen, so dass Sie mit induziertem Sputum Durchflusszytometrie, Proteomik, Transkriptomik und sogar Genomik durchführen können.