Matrixbasierte DNA-Extraktion für gezieltes Next-Generation-Sequencing an dekontaminierten Sputumproben

In unserer Forschung geht es darum, die Durchlaufzeit der TB-Diagnose und der anschließenden Einleitung durch die Einbeziehung von NGS in eine personalisierte Patientenversorgung zu verkürzen. Unser Protokoll optimiert TNGS für den routinemäßigen Einsatz, indem es die Integration von Arbeitsabläufen, die Kosten und die Durchlaufzeit berücksichtigt, um diagnostische Verzögerungen zu reduzieren und den rechtzeitigen Behandlungsbeginn zu verbessern.

Dieses Protokoll ermöglicht eine kostengünstige, schnelle und qualitativ ausreichende DNA-Extraktion aus klinischen Proben innerhalb von Stunden im Vergleich zu herkömmlichen CTAB-Methoden, die bis zu drei Tage dauern.

Unsere Ergebnisse werfen Schlüsselfragen zur Integration von TNGS in die Routinediagnostik und zur Optimierung von Extraktionsmethoden für abstrichnegative und spärliche Proben auf, um die Sensitivität und den klinischen Nutzen zu verbessern. Wir werden untersuchen, ob Restproben aus der Routinediagnostik für die nachgelagerte Sequenzierung verwendet werden können, einschließlich der direkten Sequenzierung des gesamten Genoms von Sputum, um die genomische Überwachung von TB zu rationalisieren und zu erweitern.

[Erzähler] Besorgen Sie sich zunächst ein hitzeinaktiviertes Sputumsediment. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.800 g oder 15 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit. Mit einer Pipette von 20 bis 200 Mikrolitern den Überstand vorsichtig ansaugen und entsorgen, um sicherzustellen, dass das Pellet ungestört bleibt. Schütteln Sie die Matrixsuspension vorsichtig, um sie zu mischen, und pipettieren Sie dann 200 Mikroliter der gut gemischten Matrix, um das Pellet wieder zu resuspendieren. Übertragen Sie das gesamte Volumen in ein 1,5-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen, das drei vorsterilisierte Glasperlen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern enthält. Legen Sie nun die Proben für 15 Minuten in einen Heizblock bei 56 Grad Celsius. Nach der Inkubation homogenisieren Sie die Proben 10 Sekunden lang mit einem Wirbel, um die Zellen zu dispergieren, und inkubieren Sie die Proben dann 10 Minuten lang in einem Heizblock bei 100 Grad Celsius. Homogenisieren Sie die Proben mit einem Hochgeschwindigkeits-Homogenisator mit einem Zyklus von 60 Sekunden bei 4,0 Metern pro Sekunde. Dann zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 12.000 g. Übertragen Sie 130 Mikroliter des DNA-haltigen Überstands in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung, ohne das Pellet zu stören. Entsorgen Sie das erste Röhrchen mit der Matrix und den Zelltrümmern. Um die DNA mit magnetischen Kügelchen zu reinigen, wirbeln Sie zuerst die magnetische Beadsflasche vor oder bereiten Sie das Aliquot gründlich vor, um die Kügelchen vor der Verwendung wieder zu resuspendieren, fügen Sie dann der extrahierten DNA das 1,2-fache Volumen der magnetischen Kügelchen hinzu, pipettieren Sie die Suspension 10 Mal, um die Proben zu mischen, bevor Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Proben drei Minuten lang auf ein 1,5-Milliliter-Röhrchen-Magnetgestell oder bis die Flüssigkeit klar wird, saugen Sie dann vorsichtig ab und entsorgen Sie den Überstand, ohne die Kügelchen zu stören. Fügen Sie mit den Röhrchen auf dem Magneten 200 Mikroliter 80%iges Ethanol hinzu, um sicherzustellen, dass die Kügelchen ungestört bleiben. Nach einer 30-sekündigen Inkubation das Ethanol vorsichtig aspirieren und entsorgen, ohne die Kügelchen zu stören. Entfernen Sie nach dem zweiten Waschen alle Ethanolreste mit einer Pipette von ein bis 10 Mikrolitern. Lassen Sie die Tuben offen, um die Perlen 10 Minuten lang an der Luft zu trocknen oder bis sie ein mattes Aussehen haben. Sobald die Kügelchen ein mattes Aussehen haben, entfernen Sie die Röhrchen vom Magneten und fügen Sie 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser direkt auf die Kügelchen in jeder Probe hinzu. Mischen Sie dann jede einzelne Probe, indem Sie sie 10 Mal pipettieren. Überprüfen Sie das Rohr auf darin steckende Perlen. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur legen Sie die Röhrchen für drei Minuten oder bis die Flüssigkeit klar ist, wieder auf das Magnetgestell. Mit den Röhrchen auf dem Magnetgestell wird der DNA-haltige Überstand in ein deutlich gekennzeichnetes steriles Röhrchen mit geringer Bindung überführt. Die DNA-Konzentration war in Sedimentproben von zwei Millilitern höher als bei 500 Mikrolitern bei allen Abstrichsorten. Eine größere Variabilität der DNA-Ausbeute wurde in 500-Mikroliter-Sedimentproben beobachtet. Die Abdeckungstiefe der Sequenzierungs-Reads war bei zwei Millilitern Sedimentproben höher als bei 500 Mikrolitern bei allen Abstrichsorten. Die Variabilität war bei drei Proben mit Abstrichqualität, die aus 500-Mikroliter-Sediment extrahiert wurden, größer. Die Akzeptanzwerte für die Sequenzierung waren im Allgemeinen bei Zwei-Milliliter-Proben höher als bei 500 Mikrolitern, mit einem größeren Anteil an sehr akzeptablen Ergebnissen. Abstrichproben mit hohem Grad drei plus wiesen den höchsten Anteil an akzeptablen Ergebnissen auf, verglichen mit Abstrichen mit den Abstrichen eins plus und zwei plus. In den 500-Mikroliter-Proben wurden mehr Fälle als inakzeptabel eingestuft oder nicht bestimmt.