Gewinnung aktiv produzierter mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen aus humanassoziierten Proben mit vakuumgestützter Sorptionsmittelextraktion

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, flüchtige Metaboliten und aktiv produzierte flüchtige Stoffe aus mikrobiellen Organismen in einer Vielzahl von biologischen Proben leicht zu konzentrieren und zu identifizieren. VASE ist eine benutzerfreundlichere Methode zur Konzentration von Volatilen mit geringer Häufigkeit. Alles, was Sie brauchen, ist eine Probe unter Beinahe-Vakuum, und lassen Sie die Physik den Rest erledigen.

Der Zugang zur flüchtigen Analyse klinischer Proben hat wichtige Auswirkungen auf die Entdeckung metabolischer Biomarker in einer Reihe verschiedener Krankheitszustände. Beispielsweise konnte der Erregerantrieb und die Infektion oder der Erfolg einer antibakteriellen Therapie mit flüchtiger Analyse von Speichel-, Auswurf- oder Atemproben nachgewiesen werden. Um Stuhlproben vorzubereiten, fügen Sie einen Milliliter deionisiertes Wasser zu 100 Milligramm Kot in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und wirbeln Sie drei Minuten lang.

Bewahren Sie die Proben bei Nichtgebrauch auf Eis auf. Fügen Sie 485 Milliliter BHI-Medium mit 20-millimolärer 13C-Glukose oder BHI mit 30% Deuterium zu 15 Mikrolitern Fäkalien- und Wassermischung hinzu, um sicherzustellen, dass das endgültige Volumen der Probe 500 Mikroliter beträgt. Bereiten Sie Proben in technischen Triplikaten vor.

Um Abwasserproben vorzubereiten, fügen Sie 500 Mikroliter Abwasser zu 500 Mikrolitern BHI-Medium mit 13C Glukose oder 30% Deuterium für ein Gesamtvolumen von einem Milliliter hinzu. Bereiten Sie Proben in dreifacher Ausführung vor und bewahren Sie sie auf Eis auf. Um Speichelproben vorzubereiten, fügen Sie 50 Mikroliter Speichel zu 500 Mikrolitern BHI-Medium mit 13C Glukose oder 30% Deuterium für ein Gesamtvolumen von 550 Mikrolitern hinzu.

Bereiten Sie Proben in dreifacher Ausführung vor und bewahren Sie sie auf Eis auf. Um Sputumproben vorzubereiten, fügen Sie 15 Mikroliter Sputum in eine Durchstechflasche hinzu. Bereiten Sie Proben in dreifacher Ausfertigung vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.

Legen Sie leere VOA-Fläschchen auf die Kühlplatte und legen Sie die Kühlplatte auf Eis in die Biosicherheitshaube. Schalten Sie den 5600 SPEU ein und stellen Sie ihn auf die gewünschte Temperatur ein. Beschriften Sie 20-Milliliter-VOA-Fläschchen gemäß Proben, Replikaten und HSP-IDs mit einem wasserabweisenden Marker, der Wasser widersteht, falls sich auf Eis Kondenswasser an der Außenseite der Durchstechflasche bildet.

Schrauben Sie in der Biosicherheitshaube die weiße Kappe der Durchstechflasche ab, pipettieren Sie schnell die Probe in die Durchstechflasche und montieren Sie die Deckelfolie, die schwarze Kappe und das HSP. Legen Sie die Durchstechflasche mit der Probe und HSP wieder auf die Kühlplatte. Sobald alle Proben in den Glasfläschchen vorbereitet wurden, schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie die Durchstechflaschen unter Vakuum und entfernen Sie die Vakuumquelle.

Überprüfen Sie den Druck, nachdem Sie alle Proben mit dem Manometer unter Vakuum gestellt haben. Wenn eine Durchstechflasche undicht ist, stellen Sie sicher, dass die Kappe fest verschraubt ist und dass die weißen O-Ringe der HSP- und Deckelauskleidungen korrekt angebracht sind. Platzieren Sie Fläschchen im SPEU für die optimierte Zeit und Temperatur mit Rührung bei 200 U / min.

Extrahieren Sie Kulturen für eine Stunde bei 70 Grad Celsius und extrahieren Sie stabile Isotyp-Sondierungsexperimente mit Stuhl-, Abwasser-, Speichel- und Sputumproben für 18 Stunden bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie die Kühlplatte bei minus 80 Grad Celsius auf, um sie nach Ablauf der Extraktionszeit zu verwenden. Wenn die Extraktion abgeschlossen ist, legen Sie die Proben 15 Minuten lang auf die Kühlplatte, um Wasserdampf aus dem HSP- und Durchstechflaschenkopfraum zu entfernen, und übertragen Sie die HSPs dann auf ihre Hülsen.

Richten Sie die Reihenfolge der Beispiele in der Entech-Software ein. Öffnen Sie das Programm und wählen Sie 5800 und Sequenz in den Optionen rechts neben dem Dropdown-Menü Instrument. Speichern Sie die Sequenztabelle, wählen Sie auf der linken Seite Ausführen aus, und starten Sie dann mit Leerzeichen im Desorber, wenn der leere HSP nicht der Desorber ist.

Beachten Sie, dass HSPs vom SPR für jede Probe in der Sequenz behandelt werden. Lassen Sie den SPR aufwärmen. Erlauben Sie dem SPR, alle Samples automatisch auszuführen.

Die Sequenz auf der GC-MS-Seite zeichnet die Daten automatisch in separaten Dateien auf. Fügen Sie der Verarbeitungsmethode einen Peak hinzu, indem Sie unter Externe Standardverbindung die Option Kalibrieren und anschließend Verbindung bearbeiten, Name und Verbindung einfügen auswählen. Fügen Sie den Namen der Verbindungen, die Retentionszeit und das quantitative Signalzielion hinzu.

Addieren Sie die drei größten Peaks, die Verbindungen mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 75% enthalten, und stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung jedes identifizierenden Ions der Verbindung innerhalb des Zentrums des Peaks liegt. Speichern Sie es, indem Sie OK auswählen, gefolgt von Methode und Speichern. Sobald die Prozessmethode eingerichtet ist, fahren Sie mit Quantitieren und Berechnen, dann Anzeigen und QBEARBEITEN des Quant-Ergebnisses fort, um die Daten zu quantifizieren.

Hier folgte auf die vakuumunterstützte Sorptionsmittelextraktion eine thermische Desorption an einer GC-MS, um die flüchtigen Profile bakterieller Mono- und Co-Kulturen zu untersuchen und aktiv produzierte flüchtige Stoffe mit stabiler Isotopensondierung aus menschlichen Fäkalien, Speichel, Abwasser und Sputumproben zu identifizieren. Die Mono- und Co-Kulturen bestanden aus den Bakterienarten Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii. 43 annotierte flüchtige Moleküle wurden aus den Mono- und Co-Kulturen zu 24- und 48-Stunden-Zeitpunkten nachgewiesen.

Im Vergleich zum Deuterium wurde mehr 13C in vollständig markierte flüchtige Moleküle eingebaut. 13C wurde in 2-Butanon, 3-Hydroxy, 2, 3-Butandion Diacetyl, Essigsäure und Phenol für alle Stuhl-, Abwasser- und Speichelproben eingearbeitet. Aceton, Butansäure und Propansäure wurden als in Speichel und Abwasser markiert nachgewiesen.

während Dimethyltrisulfid und Disulfiddimethyl sowohl in Stuhl- als auch in Speichelproben angereichert wurden. Die flüchtigen Stoffe 1-Propanol, 2-Butanon, Benzophenon, Ethanol und Methylthiolacetat wurden nur im Abwasser und 2 ,3-Pentandion im Speichel angereichert. Deuterium wurde in die flüchtigen Essigsäure, Benzaldehyd, 4-Methyl-Dimethyltrisulfid und Phenol aus Speichel- oder Abwasserproben eingebaut.

Essigsäure, Dimethyltrisulfid, Aceton und Propanol-2-methyl waren in den kultivierten Sputumproben häufiger als unkultivierte Sputumproben. Eine permutierte multivariate Variantenanalyse, eine PERMANOVA, wurde an einer Bray-Curtis-Distanzmatrix der flüchtigen Häufigkeiten aus den Mukoviszidose-Sputumproben durchgeführt. Wir fanden heraus, dass der Proband, der die Probe gespendet hat, 51% der Variation in 13C-markiertem kultivierten Sputum und 33% der Variation in unkultiviertem Sputum erklärt.

Hier wird der Erfolg der stabilen Isotopenmarkierung mit 13C-Glukose in flüchtigen Stoffen aus kultivierten Sputumproben gezeigt, die von sieben Personen mit Mukoviszidose gesammelt wurden. Flüchtige Stoffe, die für die Mehrheit der Proben eine höhere 13C-Inkorporation aufweisen, sind in Panel 5A dargestellt, diejenigen mit niedrigerem 13C-Einbau in die Mehrheit der Sputumproben befinden sich in Panel 5B und Moleküle mit niedrigerem 13C-prozentualem Umsatz in einer Minderheit der Sputumproben sind in Panel 5C dargestellt. Überprüfen Sie den Druck Ihrer Durchstechflasche immer nach etwa einer Minute.

Ein gebrochenes Vakuum besiegt die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der VASE-Methode. Wenn nach diesem Verfahren eine Untersuchung stabiler Isotope durchgeführt wurde, kann die DNA aus dem verbleibenden Material extrahiert werden, um mikrobielle Organismen oder Spezies zu identifizieren, die zur Produktion der flüchtigen Moleküle beigetragen haben könnten. Diese Methode ist auch nützlich, um flüchtige Stoffe aus jedem Probentyp ohne Isotopensondierung nachzuweisen.

Mit den Vorteilen der Empfindlichkeit und des geringen Probenvolumens können viele Anwendungen von dieser Technik profitieren.