Name: Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Lernen Sie die Protokolle zur Erfassung und DNA-Extraktion von betrieblichen Luftproben zur Analyse der Pilzdiversität. Diese Methode ermöglicht die umfassende Identifizierung potenzieller Gesundheitsgefahren am Arbeitsplatz.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen NIOSH und NIEHS (AES12007001-1-0-6) unterstützt.

1. Vorbereitung des NIOSH-Aerosol-Samplers
Hinweis: Der NIOSH-Aerosol-Sampler ist ein zweistufiges Zyklon Aerosol-Sampler, der mit zwei Stichproben-Rohren und Polytetrafluorethylen (PTFE) Filter Bioaerosole sammelt.
<ol><li>Überprüfen Sie vor der Montage sorgfältig den Sampler. Überprüfen Sie um sicherzustellen, dass der Sampler ist nicht beschädigt, alle Schrauben sind vorhanden und gemütlich und das Dichtband um die Naht gebildet, indem die beiden Hälften ist intakt. Den o-Ring, um sicherzustellen, dass es kein Kerben, Risse oder Tränen und hat eine sehr dünne Schicht Silikonfett-Sampler zu inspizieren. Hinweis: Der Sampler enthält einen 37-mm-3 µm-PTFE-Filter in einem Polystyrol oder Polypropylen dreiteilige FILTERKASSETTE.<ol>
<li>FILTERKASSETTE indem ein Cellulose oder Kunststoff Unterstützung Filtervlies (Filter im Lieferumfang) auf die gerasterten Oberfläche des Basis montieren (siehe Abbildung 1). Verwenden Sie Filter Zange Filter oben auf das Filtervlies Unterstützung mit der Sammlung-Seite nach oben zu setzen.</li>
		<li>Die Filterkassetten mit Hilfe einer manuellen oder pneumatischen Press zu versiegeln. Hand-Verschluss lassen Luft zu lecken um den Filter und reduzieren die Abscheideleistung. Legen Sie das ringförmige Stück (die Erweiterung Motorhaube), und verwenden Sie die Presse es fest und gleichmäßig nach unten drücken. Drücken Sie die Erweiterung Motorhaube auf den Filter fest genug um sicherzustellen, dass die Luft um den Filter nicht leckt. Hinweis: Das obere Stück der Kassette wird nicht verwendet, während der Probenahme aber sollten gespeichert werden, um den Filter zu decken, sobald die Probenahme abgeschlossen ist.</li>
		<li>Die montierte Kassette auf der Oberseite des Samplers passen und so weit wie möglich nach unten drücken. Wickeln Sie ein Stück Klebeband 19 mm (3/4 Zoll) auf der Außenseite der FILTERKASSETTE und Sampler zu FILTERKASSETTE in Position zu halten und zu handeln als backup Dichtung um Leckagen zu vermeiden.</li>
		<li>Schrauben Sie jedes Rohr fest und vollständig in die Sampler bis es Talsohle und Wrap Dichtband um jedes Rohr als Sekundärdichtung gegen Lecks ein. Hinweis: Die erste Tube, 15 mL Polypropylen Rohr, sammelt nicht Lungengängige Partikel mit einem aerodynamischen Durchmesser von > 4 µm. Die zweite Röhre, einen 1,5 mL Polypropylen Microcentrifuge Schlauch sammelt Lungengängige Partikeln zwischen 1 bis 4 µm. Die verbleibenden kleineren Teilchen < 1 µm werden gesammelt auf PTFE Filtern (siehe Abbildung 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrieren Sie den Luftstrom durch die NIOSH-Sampler mit Kanope Kalibrierung vor jedem Gebrauch als Unterschiede in den Filtern und Sampler werden dazu führen, dass des Luftstroms zu variieren.<ol>
<li>Um eine Kalibrierung Glas zu verwenden, einfügen Sie das Glas Luer Formstück in den oberen Teil der FILTERKASSETTE, legen Sie den Sampler in das Glas und verschließen Sie das Glas.</li>
		<li>Schließen Sie die Kalibrierung Jar an eine Kalibrierung-Flow-Meter und die Probenahme-Pumpe. Schalten Sie den Durchflussmesser und lassen Sie ihn für ein paar Minuten aufwärmen. Beachten Sie, dass der Durchflussmesser muss immer einen Filter angebracht, seine Einlass zur Vermeidung einer Kontamination der Durchflussmesser und dem Sampler.</li>
		<li>Die Probenahme-Pumpe einschalten und laufen für ein paar Minuten zum Aufwärmen und stabilisieren lassen.</li>
		<li>Stellen Sie die Pumpe, um die korrekte Durchflussmenge bei 3,5 L/min eingestellt. Hinweis: Die Durchflussmenge für den NIOSH-Aerosol-Sampler ist in der Regel bis 3,5 L/min eingestellt. Bei diesem Durchflussrate entspricht der Sampler an die ACGIH/ISO-Kriterien für Lungengängige Partikel Probenahme16. Andere Durchflussmengen können verwendet werden, wenn unterschiedliche Cut-Off-Größen erwünscht sind oder um den Lärmpegel zu reduzieren aber seien Sie sich bewusst, dass wenn eine unterschiedliche Fließgeschwindigkeit verwendet wird, dann der Sampler nicht mehr die lungengängigen Probenahme-Kriterien entspricht.</li>
		<li>Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, schalten Sie die Pumpe und Durchflussmesser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. statische und persönliche Aerosol Probenahme
<ol><li>Richten Sie die NIOSH-Aerosol-Generator für entweder persönlich oder statischen Bereich Probenahme. Hinweis: Statische Probenahme bezieht sich auf die Verwendung des Aerosol-Samplers, während sie ein Stativ oder anderen Haltevorrichtung befestigt ist (siehe Abbildung 3), da im Vergleich zu persönlichen Probenahme bei der Sampler und die Pumpe auf den Menschen untersucht (siehe Abbildung 4) montiert werden.<ol>
<li>Für die statischen Bereich Probenahme, halten die Sampler so nah wie möglich an den bestimmten Bereich untersucht. Halten Sie die Sampler Lufteinlässe, Zimmer Eingänge und interessanten Plätzen, die in den Pfad des Luftstroms möglicherweise entfernt. Hinweis: Aerosol-Konzentrationen können auch über kurze Distanzen unterschiedlich vor allem, wenn die Aerosol-Quelle in den Raum17.</li>
		<li>Für persönliche Probenahme der Sampler innerhalb der Person Atemzone eingerichtet. Der Revers, Schulter oder Brust beimessen Sie den Sampler, und platzieren Sie die Probenahme-Pumpe an der Taille oder in einem Rucksack. Hinweis: Die Atemzone wird allgemein angenommen, zu einer 30 cm Halbkugel rund um eine Person, die Nase, von denen die Mehrheit der Luft während der Inhalation17gezeichnet wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Sampler Schläuche auch frei von den Sampler-Inlets und nichts ist die Einlässen zu behindern oder den Luftstrom in den Sampler stören. Der Sampler Schläuche muss nicht eingeklemmt oder geknickt werden. Jede Blockade wird dazu führen, dass die Pumpe stoppt.</li>
	<li>Die Pumpen schalten. Überprüfen Sie nach einer Minute oder zwei, ob die Pumpen noch laufen. Hinweis: Verhalten Luft Probenahme für Zeiträume von weniger als 10 min bis hin zu einer Arbeitsschicht volle 8 h, je nach Umgebung10,18,19. In Abbildung 6 dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für eine 60 min. Abtastperiode in Innenräumen.</li>
	<li>Nach Abschluss der Luftproben sammeln Sie das Probenröhrchen und Filter. Entfernen Sie das Dichtband, Schrauben Sie die Rohre und verschließen sie. Platzieren Sie das dritte Stück der FILTERKASSETTE über den Filter. Speichern Sie Proben bei 4 ° C bis zur Verarbeitung bereit.</li>
</ol>3. die Extraktion von genomischer DNA aus Luftproben
<ol><li>Jede Stufe des Samplers NIOSH BC251 genomischen DNA (gDNA) entziehen. Verarbeiten der Luft Probenahme primärgefäßen und separat zu filtern, um zur Bestimmung von lungengängigen und nicht-Lungengängige mikrobiellen Aerosolen in der Probe zu ermöglichen. Hinweis: Alternativ, die drei Stufen können kombiniert und extrahiert, wenn Probe Inokulum zu klein ist.<ol>
<li>In einer Klasse II biologische Sicherheitswerkbank oder Laminar-Flow sauberen Werkbank aseptisch entfernen Sie den Filter. Wischen Sie die Probenahme-Kassette mit 70 % Ethanol und hebeln die Probenahme-Kassette mit Kassette Öffnungswerkzeug öffnen aus. Verwenden Sie ein Filter-Lifter, um Filter und Support-Pad nach oben schieben. Fassen Sie den Filter mit Filter Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie den Filter in 6 gleich große Stücke und legen Sie sie in ein 2 mL verstärkt Röhrchen mit 300 mg Glasperlen (0,2 - 0,5 mm).</li>
		<li>Das Rohr mit dem Filter in flüssigem Stickstoff für 30 s und legen Sie sie sofort in eine Perle Mühle Homogenisator eingestellt auf 4,5 m/s für 30 s.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.1.2 ein-bis zweimal, bis der Filter zerkleinert ist. Kleine Stücke von intakten Filter verbleiben. 0,5 mL Lyse-Puffer (4 M Harnstoff, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), pH 7,4) hinzugeben.</li>
		<li>15 mL und Sampler Luftschläuche 1,5 mL 0,3 mL Lyse Puffer hinzufügen. Wirbel der Röhre für 10-15 s, während aufrecht und dann weitere 10-15 s invertiert. Übertragen Sie den Inhalt jedes Rohr auf 2 mL verstärkt Röhrchen mit 300 mg Glasperlen. Hinweis: Ein Großteil des Materials in jedem Sampler-Röhrchen gesammelt werden am oberen Rand der Röhre ansammeln.</li>
		<li>Alle Rohre in die Wulst Mühle Homogenisator bei 4,5 m/s für 30 s und Zentrifuge verarbeiten Sie 20.000 x g für 1 min bei 22 ° C. Übertragen Sie Überstände an sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren Sie der Rohre bei 20.000 x g wieder für 1 min bei 22 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 30 µL Lyse-Reagenz (siehe Tabelle der Materialien), um jedes Rohr und die Röhrchen bei 37 ° C für 15 min inkubieren.</li>
	<li>0,2 mL Bindung Puffer (Harnstoff 10 M, 6 M Guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20 % Triton x-100, pH 4,4) hinzugeben und Proteinase K (100 µg/mL) für jedes Rohr und inkubieren Sie die Rohre bei 70 ° C für 10 min. hinzufügen 100 µL Isopropanol für jedes Rohr.</li>
	<li>Der Extrakt-Lösungen in Glasfaser Filterschläuche (700 µL Kapazität) in 2 mL Röhrchen gelegt und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Verwerfen Sie die Röhrchen zu und die Filterschläuche in neue 2 mL Röhrchen.</li>
	<li>Jedes Rohr 0,5 mL Inhibitor Entfernung Puffer (5 M Guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6,6, 38 % Ethanol) hinzu und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Verwerfen Sie die Röhrchen zu und die Filterschläuche in neue 2 mL Röhrchen.</li>
	<li>Jedes Rohr 0,5 mL Waschpuffer (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80 % Ethanol) hinzu und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Verwerfen Sie die Röhrchen zu und die Filterschläuche in neue 2 mL Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für eine zusätzliche 1 min bei 22 ° C, alle restlichen Waschpuffer zu entfernen. Entsorgen Sie die Röhrchen und die Filterschläuche in neue Röhrchen.</li>
	<li>Addieren Sie 100 µL (≥70 ° C) Elution Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) für jede Röhre warm und inkubieren sie bei Raumtemperatur für ca. 1-2 min. Zentrifuge die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Übertragen Sie die leeren Filter-Rohre zu einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und erneut bewerben Sie Eluaten aus Schritt 3,8. Inkubation bei Raumtemperatur für ca. 1-2 min. Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 s bei 22 ° C. Hinweis: Eluate verwendet werden sofort für Schritt 4 oder bei-20 ° C bis zum Gebrauch gespeichert. Genomischer DNA gelagert werden bis zu einem Jahr bei-20 ° C. Es wird empfohlen, dass DNA bei-80 ° C gelagert werden, wenn langfristige Speicherung erforderlich ist.</li>
</ol>4. Verstärkung der Pilz ribosomalen DNA
<ol><li>Verwenden Sie universal Pilz Primer, um seine Regionen 1 und 2 aus den extrahierten gDNA zu verstärken. Hinweis: Für dieses Protokoll der Primer paar Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ") werden verwendet, um die größte Abdeckung der ITS Regionen4,5. Anderen Primer-Sets, wie diejenigen, die allein ITS1 oder ITS2 Regionen verstärken können verwendet werden.<ol>
<li>Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für jede Probe in dreifacher Ausfertigung 50 µL Reaktionen in sterile 0,5 mL PCR-Röhrchen oder 96-Well-PCR-Platten wie folgt einrichten: 5 µL des extrahierten Schablone DNA (aus Schritt 3), 33,3 µL des PCR-Grade Wasser, 5 µL 10 X PCR Puffer , 1,5 µL 50 mM MgCl2, 1 µL 10 mM 2' Deoxynucleoside 5'-Triphosphate 0,5 µL 20 µM Fun18Sf vorwärts Grundierung, 0,5 µL 20 µM ITS4R rückwärts-Primer und 0,2 µL Taq -DNA-Polymerase.</li>
		<li>Reaktionen in einem Thermocycler durchführen: Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 6 Zyklen der Denaturierung (96 ° C, 30 s) Glühen (50 ° C, 45 s) und Primer Extension (72 ° C, 3 min); 20 Zyklen der Denaturierung (96 ° C, 30 s), Glühen (50 ° C, 45 s), und Primer Extension (72 ° C, 1 min); und Grundierung Erweiterung bei 72 ° C für 10 min. halten die reaktionsgemischen bei 4 ° C bis zum nächsten Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinieren Sie die dreifacher PCR-Reaktionen zu reinigen mit einem Kieselsäure Membran-basierten Reinigung-Kit. Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Entfernung von PCR-Komponenten (Primer, dNTPs, Enzyme, Salze, etc.) und andere Schadstoffe aus der amplifizierten DNA-Vorbereitungen.<ol>
<li>Kombinieren Sie die drei Reaktionen für jede Probe (insgesamt 150 µL) in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie Bindung Puffer (5 M Guanidin-HCl, 30 % Isopropanol hinzu) auf einem 5 X Volumen (750 µL) und mischen Sie die Lösung durch nach oben und unten zehnmal pipettieren.</li>
		<li>Fügen Sie 450 µL der Mischung zu drehen Sie Spalten in Röhrchen gelegt und Zentrifugieren der Rohre bei 17.900 x g 30 S. verwerfen die Filtrate. Die Spalten der verbleibenden 450 µL hinzu und Zentrifugieren bei 17.900 x g für 30 s bei 22 ° C. Hinweis: Die Spin-Spalten enthalten eine Silica-Membran, die Adsorption von der DNA auf die Spalten ermöglicht.</li>
		<li>Verwerfen Sie der Filtrate und fügen Sie 750 µL-waschen-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80 % Ethanol hinzu) auf die Spin-Spalten. Zentrifugieren Sie die Spalten bei 17.900 x g für 30 s bei 22 ° C. Hinweis: Dieser Vorgang entfernt die Schadstoffe aus der oben genannten PCR-Reaktion.</li>
		<li>Das Filtrat verwerfen und Zentrifugieren der leeren Spalten bei 17.900 x g für 1 min bei 22 ° C. Hinweis: Dieser Schritt ist, entfernen alle verbleibenden Waschpuffer die downstream-Anwendungen beeinträchtigen könnten.</li>
		<li>Übertragen Sie die Spin-Spalten auf sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 45 µL Elution Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) und inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge die Spin-Spalten bei 17.900 x g für 1 min bei 22 ° C.</li>
		<li>Verwenden die eluierten DNA sofort für die Schritte 4 und 5 oder bis zur Verwendung bei-20 ° C lagern. Hinweis: Der Amplifikate gelagert werden bis zu einem Jahr bei-20 ° C. Es wird empfohlen, dass DNA bei-80 ° C gelagert werden, wenn langfristige Speicherung erforderlich ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Überprüfung der Pilz ITS-Amplifikation mit Agarose-Gelelektrophorese
<ol><li>Besetzung einer 1 % Agarose-gel mit 1 µg/mL Interkalation Bromid. Agarose in kochendem 1 x Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer zu lösen. Sobald die Lösung auf etwa 50 ° C abgekühlt ist, fügen Sie die Interkalation Bromid und Gießen Sie Gel gegossen.</li>
	<li>Nachdem das Agarosegel erstarrt ist, Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE und bereiten die Amplifikate auf das Gel geladen werden. 8 µL der amplifizierten DNA fügen Sie 2 µL Ladepuffer 5-fach hinzu. Hinweis: Diese Bände ist abhängig von der Konzentration des Puffers gewünschte laden einstellbar.</li>
	<li>Laden Sie die Proben, alle 10 µL auf das Gel zusammen mit einer DNA-Leiter Größe zu Referenzzwecken. Führen Sie das Gel bei 75 V (6 V/cm) für ca. 90 min und visualisieren Bands, gesehen in der Regel zwischen 750 und 1.000 Basenpaare, mit ultraviolettem Licht (siehe Abbildung 5).</li>
</ol>6. die Sequenzierung und Analyse von Pilz ITS Regionen
<ol><li>Sequenz der extrahierten gDNA oder verstärkten Pilzbefall ITS-Regionen und die Sequenzen mit aktuellen und geeignete Methoden zu analysieren.</li>
</ol>

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<li>Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+and+rrn+gene+copy+number+on+PCR+amplification+of+16S+rRNA+genes+from+a+mixture+of+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species.</a> Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).</li>
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</ol>

Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind diejenigen der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Position des nationalen Instituts für Arbeitssicherheit und Gesundheit, Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention.

Bestimmung der Pilzen Vielfalt im beruflichen Umfeld durch Sequenzierung-basierte Ansätze hat Pilz Gefährdungsabschätzung Identifikation und Belichtung verbessert. Mit diesem Ansatz hat für den Nachweis von vielen zusätzlichen Pilzarten, die oft nicht erkannt werden mit Kultur oder Mikroskopie-basierte Methoden der Bewertung erlaubt. Ein Verfahren für die Probenahme von bioaerosolen aus beruflichen und indoor-Umgebungen und die Extraktion von genomischer DNA aus Luftproben für seine Amplifikation und Sequenzierung wird h...

Pilze Belichtungen in innen- und beruflichen Umgebungen können Atemwege Begleiterkrankungen, einschließlich allergische Sensibilisierung und Asthma1führen. Pilz Gefahren ist wichtig für die Bewertung des Risikos und Exposition der Arbeitnehmer zu verhindern. Dieser Pilzen Gefahren möglicherweise ein Ergebnis von indoor Kontamination, Außenluft eindringen oder Störeinflüsse, die bei der Beförderung von Pilz Materialien in Bereiche führen, wo Arbeitnehmer derzeit2. Methoden zur Beurteilung Pilz Exposition haben tragfähige Kultur Probenahme sowie mikroskopische Bestimmung von Pilzsporen enthalten. Diese Ansätze haben mehrere Einschränkungen und oft übersehen viele Pilzarten, die insgesamt Pilz Last3beitragen könnte. Kultur-basierte Ansätze können nur jene tragfähigen pilzorganismen unterscheiden, die auf Nährmedien kultiviert werden kann. Identifizierung von Pilzsporen auf Artniveau über Mikroskopie kann durch Sporen teilen ähnliche Morphologien verwechselt werden. Beide Methoden sind stark abhängig von Mykologen zu analysieren und identifizieren die Pilzarten mit vielen verbleibenden unbekannten.
Um vorhandene Methodiken Berufsrisiko Identifikation und Expositionsabschätzungen zu verbessern, haben viele Forscher Molekulare basierenden Technologien geworden. Sequenzierung-basierte Ansätze für die Bewertung der mikrobiellen Diversität innerhalb der innen- und beruflichen Umgebung ergaben ein breiteres Spektrum an Pilzarten begegnet verglichen mit Methoden wie Mikroskopie und tragfähige Kultur3,4 ,5. Die hier vorgestellte Methode beschreibt die Luftproben der beruflichen Umgebungen und Extraktion von genomischer DNA für die Identifizierung der möglichen Pilzbefall Gefahren. Ermittlung schädlicher Wirkungen geschieht durch Sequenzierung der nuklearen ribosomale interne transkribierten Abstandhalter oder ITS, Regionen, die sehr variabel zwischen Pilzen und wurden häufig verwendet, um Pilzarten6,7zu unterscheiden, 8,9. Viele Arten gefunden in beruflichen Einstellungen, wie z. B. einige Arten gehören zu den Phylum Basidiomycota, sind nicht erkennbar in tragfähige Kultur und sind schwer zu mikroskopisch unterscheiden. Diese Pilze sind in hohe relative Häufigkeit in innen- und beruflichen Umgebungen durch Sequenzierung Pilz ITS Regionen3,4,10bewertet beobachtet worden. DIE Sequenzierung hat mehr wissen in die Vielfalt der Pilze begegnet in innen- und am Arbeitsplatz-Umgebungen zur Verfügung gestellt.
Das Protokoll beschriebenen hier Einzelheiten der Methoden zu sammeln, zu extrahieren und Pilze ITS Regionen von bioaerosolen für Sequenzanalyse zu verstärken. Dieser Ansatz nutzt das National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) zweistufige Zyklon-Aerosol-Sampler, Partikel in der Luft zu sammeln. Dieses Tuch wurde entwickelt, um Bioaerosole und Separate lungengängigen (≤4 µm aerodynamischen Durchmesser) zu sammeln und nicht-Lungengängige (> 4 µm aerodynamischen Durchmesser) Teilchen, die zur Identifizierung der pilzorganismen innerhalb von geschlossenen Räumen ermöglicht, die meisten sind voraussichtlich um Arbeiter11eingeatmet werden. Andere Luft-Sampler, einschließlich Zyklon Sampler gibt es auf dem Markt, die die Fähigkeit haben, im Bereich atembarer Partikel sammeln (< 4 µm) mit12,13filtert. Im Gegensatz dazu trennt der NIOSH zweistufigen Zyklon Aerosol Sampler Pilzarten anhand ihrer aerodynamischen Durchmesser in Einweg, Polypropylen-Rohre, die sofort für downstream-Anwendungen14verarbeitet werden können.
Die Prozesse der genomischen DNA Extraktion und verstärken die Pilzen ITS-Regionen sind in diesem Protokoll aufgeführt. Die Extraktion Methoden vorgestellt wurden speziell für die Extraktion von genomischer DNA aus Pilzen und Bakterien, wie viele kommerzielle Kits Säugetier-Zellen, Bakterien oder speziell Hefen15Ziel entwickelt. Die in dieser Studie verwendeten Primer werden anhand ihrer insgesamt Abdeckung der Pilz seine 1 und ITS 2 Regionen4,5ausgewählt. Sequenzierung dieser Regionen kann für den Vergleich vieler Querneigung ITS-Sequenzen, einschließlich derjenigen dieser Sequenz der ITS-1-Region, ITS-2-Region oder der ITS 1 und ITS 2 Regionen. Die Pilze Vielfalt von Luftproben gesammelt in einer indoor-Einstellung mit, die diese Methoden gezeigt werden, enthüllt eine beträchtliche Anzahl von Sequenzen in die Stämme gelegt, Schlauchpilze und Basidiomycota sowie andere Sequenzen Zugehörigkeit zu weniger dominant Pilz Stämme, wie Zygomycota. Die breite Vielfalt der Pilz Sequenzen identifiziert mit diesem Ansatz würde nicht mit traditionellen Gefahr Kennzeichnung Methoden wie Anbau oder Mikroskopie erfasst werden. Sequenzierung der Pilz ITS Regionen bietet eine verbesserte Methode um Pilz Gefährdungen ermitteln und ermöglichen ein besseres Verständnis der innen- und berufliche Pilz Belichtungen.

<table><tbody><tr><td>NIOSH BC251 Bioaerosol-Zyklon-Probenehmer</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>Der NIOSH-Probenehmer ist noch nicht im Handel erhältlich. Bitte wenden Sie sich an William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov), um Informationen zum Erhalt des NIOSH-Probenehmers</td></tr><tr><td>zu erhalten Fisherbrand Sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-373</td><td>1,5 mL Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen für die Luftprobenahme; das Gewinde mit Schraubverschluss muss mit dem Gewinde des NIOSH-Probenehmers übereinstimmen</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>15 mL Polypropylenröhrchen für die Luftprobenahme</td></tr><tr><td>Reinraum-Vinylband, leicht abnehmbar, 1/4" Breite</td><td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td><td>Dichtungsband</td></tr><tr><td>Filterkassette, Styrol klar, 37 mm</td><td>SKC Inc.</td><td>225-3LF</td><td>3-teilige Probenahmekassette (ohne Filter). Enthält: Kassettenboden, Verlängerungshaube, Kassettenkappe und Einlass-/Auslassstopfen</td></tr><tr><td>hydrophobe PTFE-Fluoropore-Membranfilter, 3.0 & micro; m, 37 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>FSLW03700</td><td>Enthält: 37 mm, 3,0 & micro; m PTFE-Filter und Stützkissen</td></tr><tr><td>Fisherbrand Filterzange</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-50</td><td>Filterzange</td></tr><tr><td>Modell 502 Präzisions-PanaPress</td><td>PanaVise</td><td>502</td><td>pneumatische Kassettenpresse besteht aus dieser Präzisionsdornpresse</td></tr><tr><td>Scotch Super 33+ Vinyl-Isolierband</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>19-mm-Band</td></tr><tr><td>Mehrzweck-Kalibrierbehälter, groß</td><td>SKC Inc.</td><td>225-112</td><td>Kalibrierglas</td></tr><tr><td>Universal PCXR4 Probenpumpe</td><td>SKC Inc.</td><td>224-PCXR4</td><td>Probenahmepumpe</td></tr><tr><td>Massendurchflussmesser 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>4140</td><td>Durchflussmesser</td></tr><tr><td>Roche High Pure PCR Template Kit</td><td>Roche Diagnostics</td> 11796828001 Kit für die genomische <td>DNA-Extraktion</td><td>. Enthält: Lysepuffer, Bindungspuffer, Proteinase K, Inhibitorentfernungspuffer, Waschpuffer, Elutionspuffer, Glasfaserfilterröhrchen und 2 ml Sammelröhrchen</td></tr><tr><td>Fisherbrand 2 mL verstärkte Polypropylen-Schraubverschlussröhrchen mit Kappen</td><td>Fisher Scientific</td><td>15340162</td><td>2 mL verstärkte Röhrchen für die Perlhomogenisierung</td></tr><tr><td>Glasperlen, säuregewaschen, 212-300 & Mikro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td>Glasperlen</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>Bead</td></tr><tr><td>Homogenizer CelLytic B Zell Lyse Reagenz, 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td><td>Lysereagenz</td></tr><tr><td>Platinum Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>Enthält: Platinum Taq Polymerase, 10X PCR Puffer (kein MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender</td></tr><tr><td>dNTP-Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 mM dNTP-Mix</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Kit zur Aufreinigung von Pilzamplikons. Enthält: Buffer PB (Bindungspuffer), Buffer PE (Waschpuffer), Buffer EB (Elutionspuffer), pH-Indikatorfarbstoff (optional) und GelPilot Ladefarbstoff</td></tr><tr><td>Owl EasyCast Mini Gelelektrophoresesystem</td><td>Thermo Fisher</td><td>B1 oder B2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus DNA-Leiter</td><td>Thermo Fisher</td><td>10488-085 DNA-Leiter</td><td></td></tr></tbody></table>

erfassung und gewinnung von betrieblichen luftproben für analyse der pilz dna

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Traditionelle Methoden zur Identifizierung von Pilz Expositionen am Arbeitsplatz-Umgebungen, wie Kultur und Mikroskopie-basierte Ansätze, haben einige Einschränkungen, die den Ausschluss vieler Arten geführt haben. Fortschritte auf dem Gebiet in den letzten zwei Jahrzehnten haben Arbeitssicherheit Forscher zu molekularen basierende Ansätze zur Identifizierung von Pilz Gefahren geführt. Diese Methoden haben zur Erkennung vieler Arten innerhalb der innen- und beruflichen Umgebung geführt, die mit traditionellen Methoden nicht erkannt wurden. Dieser Ansatz zur Bestimmung der Pilz Vielfalt innerhalb der Luft durch genomische DNA-Extraktion, Amplifikation und Sequenzierung taxonomische Identifizierung der Pilz interne Proben Protokolldetails transkribiert Abstandhalter (ITS) Regionen. DIE Sequenzierung Ergebnisse bei der Erkennung von viele Pilzarten, die entweder nicht erkannt oder schwierig, auf Artniveau mit Kultur oder Mikroskopie zu identifizieren sind. Während diese Methoden keine quantitative Maßnahmen der Pilz Belastung angeben, sie bieten einen neuen Ansatz zur Ermittlung schädlicher Wirkungen und können verwendet werden, um allgemeine Artenreichtum und Vielfalt im beruflichen Umfeld bestimmen.

Die Artenverteilung in einem Umfeld kann mit relative Häufigkeit durch Bestimmung der Anzahl der Klone von jeder OTU identifiziert in den Luftproben beurteilt werden. Abbildung 6 ist ein Krone-Diagramm aus der taxonomisch platzierten Arten in Innenräumen nach 60 min von Luftproben. Es ist festzustellen, dass die Umwelt enthält eine Vielzahl von Arten innerhalb der zwei großen Pilz Stämme, Schlauchpilze und Basidiomycota sowie Arten, die Zugehörigkeit zu den P...

Bestimmung der Pilzen Vielfalt innerhalb einer Umgebung ist eine Methode, bei der arbeitsmedizinischen Untersuchungen, gesundheitliche Gefahren zu identifizieren. Dieses Protokoll beschreibt DNA-Extraktion aus beruflichen Luftproben Amplifikation und Sequenzierung der Pilz ITS Regionen. Dieser Ansatz erkennt viele Pilzarten, die von traditionellen Bewertungsmethoden übersehen werden können.

Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Das übergeordnete Ziel dieser Luftprobenahme- und DNA-Extraktionsmethode besteht darin, genomische Pilz-DNA zu erhalten, die amplifiziert, sequenziert und taxonomisch platziert werden kann, um potenzielle Pilzgefahren im beruflichen Umfeld zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Bewertung der Exposition am Arbeitsplatz zu beantworten, z. B. welchen Pilzgefahren Arbeitnehmer ausgesetzt sind, die negative Auswirkungen auf die Gesundheit haben können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Pilzarten, die mit Kultur- oder Mikroskopie-basierten Methoden unentdeckt bleiben, mit sequenzierungsbasierten Ansätzen aufgeklärt werden können.Um die Ansaugfilterkassette zu montieren, legen Sie ein Zellulosefilter-Stützpad auf die gerasterte Oberfläche des Grundstücks und legen Sie dann mit Hilfe einer Filterzange einen Filter mit der Sammelseite nach oben auf das Filter-Stützkissen. Nach dem Zusammenbau verschließen Sie die Filterkassette, indem Sie die Verlängerungshaube einsetzen und mit einer manuellen oder pneumatischen Presse fest und gleichmäßig nach unten drücken. Setzen Sie dann die zusammengebaute Kassette auf den NIOSH-Aerosolsammler und drücken Sie sie so weit wie möglich nach unten.Verwenden Sie ein Stück 19-Millimeter-Klebeband, um die Außenseite der Filterkassette und des Probenehmers zu umwickeln, um die Filterkassette an Ort und Stelle zu halten und als Backup-Dichtung zu dienen, um ein Auslaufen zu verhindern. Schrauben Sie die Entnahmeröhrchen fest und vollständig in den Probenehmer, bis sie unten sind, und wickeln Sie das Dichtungsband um die Röhrchen, das als sekundäre Abdichtung gegen Leckagen dient. Um eine persönliche Aerosolprobenahme durchzuführen, platzieren Sie den Probenehmer in der Atemzone der Person.Befestigen Sie den Probenehmer am Revers, an der Schulter oder an der Brust und bewahren Sie die Probenahmepumpe dann auf Hüfthöhe oder in einem Rucksack auf. Schalten Sie die Pumpen ein und prüfen Sie nach einer Minute, ob die Pumpe funktioniert. Wenn die Luftprobenahme abgeschlossen ist, nehmen Sie den Luftkeimsammler von der Person.Entfernen Sie das Dichtungsband, schrauben Sie die Schläuche ab und setzen Sie dann eine Kappe auf. Setzen Sie das dritte Stück der Filterkassette über den Filter. Wischen Sie zuerst die Probenahmekassette mit 70 % Ethanol ab und verwenden Sie dann ein Kassettenöffnungswerkzeug, um die Probenahmekassette zu öffnen, während Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II arbeiten.Verwenden Sie anschließend einen Filterheber, um das Stützkissen anzuheben und nach oben zu filtern. Entfernen Sie dann den Filter mit einer Filterzange und legen Sie ihn in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie den Filter mit einem sterilen Skalpell in sechs gleich große Stücke und legen Sie sie dann in ein verstärktes Zwei-Milliliter-Röhrchen, das 300 Milligramm Glasperlen von 200 bis 500 Mikrometer enthält.Tauchen Sie das filterhaltige Rohr 30 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff und legen Sie es dann schnell für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 4,5 Metern pro Sekunde in einen Kugelmühlen-Homogenisator. Geben Sie 0,5 Milliliter Lysepuffer in die Röhrchen, die die verbleibenden kleinen Stücke des intakten Filters enthalten, geben Sie dann 0,3 Milliliter Lysepuffer in die 15- und 1,5-Milliliter-Luftkeimsammler-Sammelröhrchen und wirbeln Sie die Röhrchen in aufrechter bzw. umgekehrter Position für 10 bis 15 Sekunden. Der Lysepuffer aus jedem Entnahmeröhrchen wird in verstärkte Zwei-Milliliter-Röhrchen mit 300 Milligramm Glaskügelchen überführt.Verarbeiten Sie die Röhrchen 30 Sekunden lang im Homogenisator der Kugelmühle und zentrifugieren Sie die Proben dann eine Minute lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und der Überstand erneut bei der 20.000-fachen Schwerkraft für eine Minute bei 22 Grad Celsius zentrifugiert. Nach Zugabe von 30 Mikrolitern Lysereagenz inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Geben Sie dann 0,2 Milliliter Bindungspuffer und 100 Mikrogramm Proteinase K pro Milliliter in das Röhrchen und lassen Sie die Röhrchen dann 10 Minuten lang in einem Blockheizer bei 70 Grad Celsius inkubieren. Zum Schluss geben Sie 100 Mikroliter Isopropanol in jedes Röhrchen. Legen Sie dann Glasfaserfilterröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 700 Mikrolitern in Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und überführen Sie die Extraktlösungen darin.Nach dem Transfer zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei der 20.000-fachen Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius. Führen Sie die Glasfilterfaser nach der Zentrifugation in frische Sammelröhrchen ein und entsorgen Sie das Auffangröhrchen. Geben Sie zu jedem Röhrchen 0,5 Milliliter Puffer zur Entfernung von Inhibitoren und führen Sie die Zentrifugation bei 20.000-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius durch.Entsorgen Sie das Auffangröhrchen nach der Zentrifugation und setzen Sie die Filterröhrchen in neue Auffangröhrchen ein. Geben Sie dann 0,5 Milliliter Waschpuffer in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut 30 Sekunden lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft. Entsorgen Sie das Auffangröhrchen und ersetzen Sie es nach der Zentrifugation durch frische.Geben Sie erneut 0,5 Milliliter Waschpuffer in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft. Um alle Reste des Waschpuffers zu entfernen, zentrifugieren Sie abschließend die Sammelröhrchen eine Minute lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft und entsorgen Sie die Entnahmeröhrchen und ersetzen Sie sie durch neue. Nach Zugabe von 100 Mikrolitern Warmelutionspuffer inkubieren Sie die Röhrchen auf dem Labortisch bei Raumtemperatur für ein bis zwei Minuten und zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei der 20.000-fachen Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius.Legen Sie die Filterröhrchen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und tragen Sie die Eluate für eine weitere Rundzentrifugation erneut auf. Verwenden Sie 0,5-Milliliter-PCR-Röhrchen, um 50-Mikroliter-Reaktionen in dreifacher Ausfertigung mit fünf Mikrolitern bereits extrahierter DNA für jede Reaktion einzurichten, programmieren Sie dann den Thermocycler und starten Sie den Zyklus. Mischen Sie alle drei PCR-Reaktionen in sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie 750 Mikroliter Bindepuffer hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Geben Sie 450 Mikroliter der Gesamtmischung in Spin-Säulen, die in Sammelröhrchen eingesetzt werden, und beginnen Sie mit der Zentrifugation bei 17.900-facher Schwerkraft für 30 Sekunden, verwerfen Sie dann das Filtrat und fügen Sie die restlichen 450 Mikroliter der Mischung für eine zweite Zentrifugationsrunde hinzu. Auch hier wird das Filtrat verworfen und 750 Mikroliter Waschpuffer in die Schleudersäulen gegeben und bei 17.900-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius zentrifugiert.Zum Schluss wird das Filtrat verworfen und die leeren Säulen eine Minute lang bei 22 Grad Celsius bei 17.900-facher Schwerkraft erneut gedreht. Nachdem Sie die Spin-Säulen in sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt haben, pipettieren Sie 45 Mikroliter Elutionspuffer und inkubieren Sie die Röhrchen auf dem Labortisch bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie dann die Säulen eine Minute lang bei 17.900-facher Schwerkraft bei 22 Grad Celsius.Tauchen Sie ein 1%iges Agarose-Gel in einen einfachen TAE-Puffer in einer Elektrophoresekammer und mischen Sie dann zwei Mikroliter fünffachen Ladepuffer mit acht Mikrolitern amplifizierter DNA. Laden Sie schließlich die gesamten 10 Mikroliter der Probe zusammen mit der DNA-Leiter auf das Gel. Lassen Sie das Gel etwa 90 Minuten lang bei 75 Volt laufen.Ein repräsentatives Agarose-Gel demonstriert die Amplifikation von internen transkribierten Spacer-Regionen von pilzgenomischer DNA, die aus Arbeitsluftproben gewonnen wurde. Die Fahrspur ganz links stellt die DNA-Markierungsspur dar. Die Bänder auf der rechten Seite stellen die internen transkribierten Spacerregionen dar, die aus verschiedenen Arbeitsluftproben mit Größen von 750 bis 1.000 Basenpaaren amplifiziert wurden.Ein repräsentatives Krona-Diagramm zeigt das Vorkommen verschiedener taxonomischer Pilzarten in Innenräumen. Der NIOSH-Bioaerosol-Zyklon-Probenehmer wurde in Haushalten verwendet, um eine Stunde lang Bioaerosole zu sammeln, um die vorhandenen Pilzarten zu bestimmen. Tabellarische Daten stellen die Diversitäts- und Reichtumsindizes von Pilzarten in Innenräumen dar.Die Daten zeigen höhere Chao-1-Reichtumsindizes, Shannon-Diversitätsindizes und Bray-Curtis-Unähnlichkeitskoeffizienten in klimatisierten und verdunstungsgekühlten Umgebungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Raum- und Arbeitsluftproben sammeln und genomische DNA für die Analyse mikrobieller Populationen extrahieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die besten aseptischen Methoden zu verwenden, um eine mikrobiologische Kontamination der Proben zu verhindern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

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Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

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