Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

Das übergeordnete Ziel dieser Luftprobenahme- und DNA-Extraktionsmethode besteht darin, genomische Pilz-DNA zu erhalten, die amplifiziert, sequenziert und taxonomisch platziert werden kann, um potenzielle Pilzgefahren im beruflichen Umfeld zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Bewertung der Exposition am Arbeitsplatz zu beantworten, z. B. welchen Pilzgefahren Arbeitnehmer ausgesetzt sind, die negative Auswirkungen auf die Gesundheit haben können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Pilzarten, die mit Kultur- oder Mikroskopie-basierten Methoden unentdeckt bleiben, mit sequenzierungsbasierten Ansätzen aufgeklärt werden können.

Um die Ansaugfilterkassette zu montieren, legen Sie ein Zellulosefilter-Stützpad auf die gerasterte Oberfläche des Grundstücks und legen Sie dann mit Hilfe einer Filterzange einen Filter mit der Sammelseite nach oben auf das Filter-Stützkissen. Nach dem Zusammenbau verschließen Sie die Filterkassette, indem Sie die Verlängerungshaube einsetzen und mit einer manuellen oder pneumatischen Presse fest und gleichmäßig nach unten drücken. Setzen Sie dann die zusammengebaute Kassette auf den NIOSH-Aerosolsammler und drücken Sie sie so weit wie möglich nach unten.

Verwenden Sie ein Stück 19-Millimeter-Klebeband, um die Außenseite der Filterkassette und des Probenehmers zu umwickeln, um die Filterkassette an Ort und Stelle zu halten und als Backup-Dichtung zu dienen, um ein Auslaufen zu verhindern. Schrauben Sie die Entnahmeröhrchen fest und vollständig in den Probenehmer, bis sie unten sind, und wickeln Sie das Dichtungsband um die Röhrchen, das als sekundäre Abdichtung gegen Leckagen dient. Um eine persönliche Aerosolprobenahme durchzuführen, platzieren Sie den Probenehmer in der Atemzone der Person.

Befestigen Sie den Probenehmer am Revers, an der Schulter oder an der Brust und bewahren Sie die Probenahmepumpe dann auf Hüfthöhe oder in einem Rucksack auf. Schalten Sie die Pumpen ein und prüfen Sie nach einer Minute, ob die Pumpe funktioniert. Wenn die Luftprobenahme abgeschlossen ist, nehmen Sie den Luftkeimsammler von der Person.

Entfernen Sie das Dichtungsband, schrauben Sie die Schläuche ab und setzen Sie dann eine Kappe auf. Setzen Sie das dritte Stück der Filterkassette über den Filter. Wischen Sie zuerst die Probenahmekassette mit 70 % Ethanol ab und verwenden Sie dann ein Kassettenöffnungswerkzeug, um die Probenahmekassette zu öffnen, während Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II arbeiten.

Verwenden Sie anschließend einen Filterheber, um das Stützkissen anzuheben und nach oben zu filtern. Entfernen Sie dann den Filter mit einer Filterzange und legen Sie ihn in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie den Filter mit einem sterilen Skalpell in sechs gleich große Stücke und legen Sie sie dann in ein verstärktes Zwei-Milliliter-Röhrchen, das 300 Milligramm Glasperlen von 200 bis 500 Mikrometer enthält.

Tauchen Sie das filterhaltige Rohr 30 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff und legen Sie es dann schnell für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 4,5 Metern pro Sekunde in einen Kugelmühlen-Homogenisator. Geben Sie 0,5 Milliliter Lysepuffer in die Röhrchen, die die verbleibenden kleinen Stücke des intakten Filters enthalten, geben Sie dann 0,3 Milliliter Lysepuffer in die 15- und 1,5-Milliliter-Luftkeimsammler-Sammelröhrchen und wirbeln Sie die Röhrchen in aufrechter bzw. umgekehrter Position für 10 bis 15 Sekunden. Der Lysepuffer aus jedem Entnahmeröhrchen wird in verstärkte Zwei-Milliliter-Röhrchen mit 300 Milligramm Glaskügelchen überführt.

Verarbeiten Sie die Röhrchen 30 Sekunden lang im Homogenisator der Kugelmühle und zentrifugieren Sie die Proben dann eine Minute lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und der Überstand erneut bei der 20.000-fachen Schwerkraft für eine Minute bei 22 Grad Celsius zentrifugiert. Nach Zugabe von 30 Mikrolitern Lysereagenz inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann 0,2 Milliliter Bindungspuffer und 100 Mikrogramm Proteinase K pro Milliliter in das Röhrchen und lassen Sie die Röhrchen dann 10 Minuten lang in einem Blockheizer bei 70 Grad Celsius inkubieren. Zum Schluss geben Sie 100 Mikroliter Isopropanol in jedes Röhrchen. Legen Sie dann Glasfaserfilterröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 700 Mikrolitern in Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und überführen Sie die Extraktlösungen darin.

Nach dem Transfer zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei der 20.000-fachen Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius. Führen Sie die Glasfilterfaser nach der Zentrifugation in frische Sammelröhrchen ein und entsorgen Sie das Auffangröhrchen. Geben Sie zu jedem Röhrchen 0,5 Milliliter Puffer zur Entfernung von Inhibitoren und führen Sie die Zentrifugation bei 20.000-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius durch.

Entsorgen Sie das Auffangröhrchen nach der Zentrifugation und setzen Sie die Filterröhrchen in neue Auffangröhrchen ein. Geben Sie dann 0,5 Milliliter Waschpuffer in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut 30 Sekunden lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft. Entsorgen Sie das Auffangröhrchen und ersetzen Sie es nach der Zentrifugation durch frische.

Geben Sie erneut 0,5 Milliliter Waschpuffer in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft. Um alle Reste des Waschpuffers zu entfernen, zentrifugieren Sie abschließend die Sammelröhrchen eine Minute lang bei 22 Grad Celsius bei 20.000-facher Schwerkraft und entsorgen Sie die Entnahmeröhrchen und ersetzen Sie sie durch neue. Nach Zugabe von 100 Mikrolitern Warmelutionspuffer inkubieren Sie die Röhrchen auf dem Labortisch bei Raumtemperatur für ein bis zwei Minuten und zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei der 20.000-fachen Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius.

Legen Sie die Filterröhrchen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und tragen Sie die Eluate für eine weitere Rundzentrifugation erneut auf. Verwenden Sie 0,5-Milliliter-PCR-Röhrchen, um 50-Mikroliter-Reaktionen in dreifacher Ausfertigung mit fünf Mikrolitern bereits extrahierter DNA für jede Reaktion einzurichten, programmieren Sie dann den Thermocycler und starten Sie den Zyklus. Mischen Sie alle drei PCR-Reaktionen in sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie 750 Mikroliter Bindepuffer hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Geben Sie 450 Mikroliter der Gesamtmischung in Spin-Säulen, die in Sammelröhrchen eingesetzt werden, und beginnen Sie mit der Zentrifugation bei 17.900-facher Schwerkraft für 30 Sekunden, verwerfen Sie dann das Filtrat und fügen Sie die restlichen 450 Mikroliter der Mischung für eine zweite Zentrifugationsrunde hinzu. Auch hier wird das Filtrat verworfen und 750 Mikroliter Waschpuffer in die Schleudersäulen gegeben und bei 17.900-facher Schwerkraft für 30 Sekunden bei 22 Grad Celsius zentrifugiert.

Zum Schluss wird das Filtrat verworfen und die leeren Säulen eine Minute lang bei 22 Grad Celsius bei 17.900-facher Schwerkraft erneut gedreht. Nachdem Sie die Spin-Säulen in sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt haben, pipettieren Sie 45 Mikroliter Elutionspuffer und inkubieren Sie die Röhrchen auf dem Labortisch bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie dann die Säulen eine Minute lang bei 17.900-facher Schwerkraft bei 22 Grad Celsius.

Tauchen Sie ein 1%iges Agarose-Gel in einen einfachen TAE-Puffer in einer Elektrophoresekammer und mischen Sie dann zwei Mikroliter fünffachen Ladepuffer mit acht Mikrolitern amplifizierter DNA. Laden Sie schließlich die gesamten 10 Mikroliter der Probe zusammen mit der DNA-Leiter auf das Gel. Lassen Sie das Gel etwa 90 Minuten lang bei 75 Volt laufen.

Ein repräsentatives Agarose-Gel demonstriert die Amplifikation von internen transkribierten Spacer-Regionen von pilzgenomischer DNA, die aus Arbeitsluftproben gewonnen wurde. Die Fahrspur ganz links stellt die DNA-Markierungsspur dar. Die Bänder auf der rechten Seite stellen die internen transkribierten Spacerregionen dar, die aus verschiedenen Arbeitsluftproben mit Größen von 750 bis 1.000 Basenpaaren amplifiziert wurden.

Ein repräsentatives Krona-Diagramm zeigt das Vorkommen verschiedener taxonomischer Pilzarten in Innenräumen. Der NIOSH-Bioaerosol-Zyklon-Probenehmer wurde in Haushalten verwendet, um eine Stunde lang Bioaerosole zu sammeln, um die vorhandenen Pilzarten zu bestimmen. Tabellarische Daten stellen die Diversitäts- und Reichtumsindizes von Pilzarten in Innenräumen dar.

Die Daten zeigen höhere Chao-1-Reichtumsindizes, Shannon-Diversitätsindizes und Bray-Curtis-Unähnlichkeitskoeffizienten in klimatisierten und verdunstungsgekühlten Umgebungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Raum- und Arbeitsluftproben sammeln und genomische DNA für die Analyse mikrobieller Populationen extrahieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die besten aseptischen Methoden zu verwenden, um eine mikrobiologische Kontamination der Proben zu verhindern.