Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum infizierten wässrigen roten Blutkörperchen mit einem abgeschwächten Totalreflexion Infrarot-Spektrometer und multivariate Datenanalyse.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Regressionsmodell für die Vorhersage von Malariaparasiten mit ATR-FTIR-Spektroskopie mit multivariater Datenanalyse zu erstellen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Point-of-Care-Diagnostik zu beschleunigen, was dazu beitragen kann, die Patientenergebnisse in der Zukunft zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Modell zwar einige Zeit in Anspruch nehmen kann, aber sehr tragbar, benutzerfreundlich, hochsensibel und kostengünstig ist.

Obwohl diese Methode die Quantifizierung von Malariaparasiten ermöglicht, kann sie auch verwendet werden, um phänotypische Reaktionen auf Umweltveränderungen wie Veränderungen in der Parasitenzusammensetzung aufgrund von antimikrobiellen Wirkstoffen zu beobachten. Die Idee entstand aus der Arbeit, die wir am australischen Synchrotron an Malaria-infizierten Zellen machten. Dies war auf der Einzelzellebene.

Von dort aus haben wir uns entschieden, die ATR-FTIR-Spektroskopie zu verwenden, um den diagnostischen Test tatsächlich zu entwickeln. Vor Beginn des Synchronisationsverfahrens, Kultur 30 Milliliter der 3D7-Stamm Plasmodium falciparum Parasiten, wie im Textprotokoll beschrieben. Mit einer automatisierten Pipette die Kultur wieder aufsetzen und in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen.

Zentrifugieren Sie die Kultur bei 300 bis 400 mal g unter Standard-Laborbedingungen für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn mit einer automatisierten Pipette aufziehen, ohne das Pellet zu stören. Entsorgen Sie die Abfallmedien in einer 10%bleichlösung.

Fügen Sie dem Pellet langsam 12 bis 15 Milliliter einer 4%Sorbitol-Lösung hinzu und mischen Sie die Kultur, indem Sie die Röhre verschließen und invertieren, bis die Kultur homogen ist. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Kultur für fünf Minuten.

Verwenden Sie eine automatische Pipette, um den Überstand zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 10 bis 15 Milliliter 0,9% Saline in das Pellet und mischen Sie die Lösung durch Verkappen und Invertieren der Röhre, bis die Kultur homogen ist. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Solollösung zwei weitere Male waschen, um alle Sorbitreste zu entfernen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie die Stock rote Blutkörperchen, oder RBCs. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie mit 0,9% Saline insgesamt dreimal. Zentrifugieren Sie die Vorrats-RBCs und die Kultur bei 300 bis 400 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand aus jedem Rohr.

Etikettieren Sie acht Mikrozentrifugenröhrchen wie angegeben. Verwenden Sie dann eine 0,2 bis 20 Mikroliter Pipette, um jedem Rohr die entsprechende Kulturmenge hinzuzufügen. Als nächstes fügen Sie die entsprechende Menge an Vorrat RBCs zu jedem Rohr hinzu, um die gewünschte Parasitenverdünnung zu erhalten.

Zentrifugieren Sie das frische Spenderblut, das in gerinnungshemmenden Röhrchen bei 1, 200 mal g und Standardlaborbedingungen für 10 Minuten gesammelt wird. Entfernen Sie das Plasma, indem Sie es mit einer Pipette aufziehen und in eine 10%ige Bleichlösung entsorgen. Fügen Sie 900 Mikroliter isolierter Spender-RBCs in jedes Mikrozentrifugenrohr ein und mischen Sie es gründlich, indem Sie das 10-fache invertieren.

Zur Erfassung des Spektrums wird ein einfaches Benchtop Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared oder ATR-FTIR-Spektrometer verwendet. Bereiten und reinigen Sie den Kristall mit fusselfreien Tüchern, die mit ultrareinem Wasser gedämpft sind, um den Kristall in einer kreisförmigen Bewegung sanft zu schrubben. Verwenden Sie dann ein anderes fusselfreies Wischen, um den Kristall gründlich zu trocknen.

Nehmen Sie eine Hintergrundmessung der Luft vor, indem Sie auf Hintergrundmessung klicken. Reinigen Sie den Kristall alle 20 Minuten und wiederholen Sie diese Messung. Öffnen Sie die Live-Ansicht, indem Sie auf Vorschau klicken.

Beobachten Sie eine flache, horizontale Grundlinie, die angibt, dass der Kristall sauber ist. Pipette 10 Mikroliter entionisiertes Wasser direkt auf die Mitte des Kristalls und klicken Sie auf Messprobe. Trocknen Sie den Kristall mit einem fusselfreien Tuch und einer sanften kreisförmigen Bewegung.

Pipette 10 Mikroliter der Probe auf die Mitte des Kristalls und klicken Sie auf Messen Probe. Reinigen Sie den Kristall zwischen den Proben. In dieser Demo wird die multivariate Datenanalyse mit MATLAB durchgeführt.

Um mit der Datenverarbeitung zu beginnen, geben Sie die Analyse in das Befehlsfenster ein, um die grafische Benutzeroberfläche zu öffnen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Feld X, um Daten importieren zu suchen. Wählen Sie den Dateityp für die Analyse aus.

Importieren Sie Stichproben-, Wasser- und Basisspektren als Datasets in den Arbeitsplatz, indem Sie alle Spektren in jedem Satz einzeln auswählen, auf Öffnen klicken und jedem Satz einen kurzen Namen geben. Klicken Sie im Befehlsfenster auf Neue Variable, und geben Sie dem Vektor den Namen Parasitemia. Geben Sie die Parasitemie jeder Probe ein.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das X-Feld, um Plotdaten zu finden. Klicken Sie auf das Symbol Daten zeichnen, um die Daten darzustellen. Prüfen Sie die Spektren auf Wasserdampfeffekte, indem Sie auf Zoom klicken und auf 1, 800 bis 1, 400 Prozent zentimeter vergrößern, am deutlichsten als kurze, scharfe, schmale Gipfel entlang der Hänge der Amide I und Amide II Bänder beobachtet.

Öffnen Sie bei extremem Wasserdampf die Registerkarte Daten bearbeiten, und wählen Sie Glättung aus. Reduzieren Sie den Lärm und/oder starke Wasserdampf-Beiträge, indem Sie die Probe und die Wasserspektren glätten. Öffnen Sie nach der weiteren Datenbehandlung, wie im Textprotokoll beschrieben, die Registerkarte Daten bearbeiten, und wählen Sie in Spaltenvariablen 2980 bis 2800 Perzent und 1750 bis 850 Prozent der Werte aus, indem Sie sicherstellen, dass nur ihre Kästchen angekreuzt sind.

Die Daten sind nun zur Analyse bereit. Um die Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchzuführen, klicken Sie auf Analysezersetzung, und wählen Sie PCA aus. Klicken Sie auf Modell erstellen.

Beachten Sie die 95%-Vertrauensgrenze, den gestrichelten Ring, auf dem Partiturdiagramm zwischen PC 1 und PC 2. Verwenden Sie das Werkzeug Spectra auswählen, um die Stichprobenspektren mit Werten zu markieren, die außerhalb des Grenzwerts auftreten, als potenzielle Ausreißer. Um eine partielle Regression mit den kleinsten Quadraten (PLSR) durchzuführen, klicken Sie auf Regression analysieren, und wählen Sie PLSR aus.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Y-Block, und wählen Sie das Vektormodell Parasitemia build aus. Analysieren Sie das Regressionsmodell und den Regressionsvektor, und identifizieren Sie die biologischen Bänder. Ein partielles Regressionsdiagramm mit den kleinsten Quadraten von RBCs, das zwischen null und ein Prozent Parasitemien gespitzt wurde, erzeugte einen R-Quadratwert von 0,87 und einen wurzelmittleren quadrierten Kreuzvalidierungsfehler von 0,13%Parasitemie.

Dies zeigt die Fähigkeit des Modells, die Parasitemie in jeder Probe mit der bekannten Parasitemie auf der x-Achse und der vorhergesagten Parasitemie auf der y-Achse vorherzusagen. Der zugehörige Regressionskoeffizient beschreibt den Beitrag jedes Bandes zur Vorhersagefähigkeit des Modells. Je intensiver das Band, desto mehr trägt es zum Modell bei und damit, wie der Parasit die chemische Zusammensetzung des Blutes verändert.

Die Ergebnisse zeigen, dass das Signal von Parasiten so deutlich von den RBCs ist, dass sie verwendet werden können, um ein lineares Regressionsmodell für die Vorhersage von Parasiten in zukünftigen Datensätzen zu bilden. Nach der Beherrschung kann diese Technik weniger als drei Minuten pro Probe dauern, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die ATR-Kristalle von allen Rückständen zu reinigen.

Nach diesem Verfahren können andere Malariaarten wie P vivax und P Malaria emittiert werden, um solche Fragen zu beantworten, wie: Ist die ATR-FTIR-Spektroskopie empfindlich genug, um zwischen Arten zu unterscheiden? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biospektroskopie, um den Nachweis und die Quantifizierung anderer blutübertragener Krankheitserreger zu erforschen und sogar im Blut wie Glukose und Harnstoff zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der ATR-FTIR-Spektroskopie und nVDA-Analyse haben, um ein Regressionsmodell zu erstellen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut- und Malariaproben von Patienten gefährlich sein kann, und bei einem Versuch dieses Eingriffs sollte immer ein angemessenes Training und Eindämmung auf Biosicherheitsniveau durchgeführt werden.