Name: Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Plasmodium falciparum in roten Blutkörperchen mittels ATR-FTIR-Spektroskopie und multivariater Datenanalyse. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Point-of-Care-Diagnostik für Malaria.

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Zu den Autoren wurde gefördert vom Australian Research Council (Zukunft Fellowship FT120100926, BRW), National Health and Medical Research Council of Australia (Programm Grant und Senior Research Fellowship zu JGB; Frühe Karriere Stipendien JSR; Infrastruktur für die Forschung Institute Support Scheme Grant Burnet Institut), und die Victorian State Regierung betrieblichen Infrastruktur unterstützen Grant Burnet Institut. Wir bestätigen Herrn Finlay Shanks für instrumentale Unterstützung.

Bitte konsultieren Sie geeignete Material Sicherheit Data Sheets (MSDS) und suchen Sie entsprechenden Biosafety Level 2 (BSL-2) Ausbildung zu. Alle Kultivierung Schritte erfolgen in einem BSL-2 Schrank mit aseptischen Technik, d. h. es gibt ein Risiko einer Exposition gegenüber schädlichen UV-Strahlung von Dekontamination Treppe, Nadel-Stick Verletzungen und möglichen biologischen Exposition und Infektion, wenn die Parasiten-Kultur tritt keine Verletzungen. Darüber hinaus ist bestand Blut von Blutbanken nur für bestimmte Krankheiten und das Potenzial für die Verbreitung von Blut übertragbaren Krankheiten untersucht ein potenzielles Risiko. Suchen Sie sofort medizinischen Hilfe in dem Auftreten von Verletzungen.
1. Vorbereitung und Messung von 3 7 Plasmodium Falciparum Parasit Verdünnungsreihe
Hinweis: Plasmodium SP. Kultur ist sehr empfindlich. Frisch/noch nicht abgelaufenen Reagenzien zu verwenden und die Parasiten durch Ändern der Medien regelmäßig zu füttern. Futtermittel-Kulturen unter 5 % Parasitemia jeden zweiten Tag. Kulturen zwischen 6-10 % Parasitemia einmal oder zweimal täglich zu füttern; und Kulturen zwischen 11 und 20 % bis zu 4 mal täglich zu füttern. Parasiten, die anfangen zu hungern verlieren ihre Form und beginnen, sich zusammenzuziehen. In einem solchen Fall füttern Sie und verdünnen Sie sofort von den Medien ändern und Hinzufügen von Lager Erythrozyten sammeln das Spenderblut in Blutentnahmeröhrchen mit Heparin als Antigerinnungsmittel und Maßnahme innerhalb der ersten 6 h.
<ol><li>Kultur insgesamt 30 mL von 3-7 Belastung Plasmodium Falciparum Parasiten nach dem Standardprotokoll, bis die Parasitemia 10 % Ringe erreicht.</li>
	<li>
Synchronisation von Parasiten
	<ol>
<li>11 h nach Shizogeny in den Lebenszyklus des Parasiten, aufzuwirbeln, die Kultur und den Transfer in ein 50 mL konische Röhrchen mit einer automatisierten Pipette.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Kultur bei 300 – 400 x g und standard Laborbedingungen (25° C und 100 kPa) für 5 min.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand durch Ausarbeitung mit einer Pipette oder mit einer Pasteurpipette angebracht zu einem Vakuum ohne zu stören das Pellet. Entsorgen Sie Abfall Medien in einem 10 % Bleichmittel-Lösung.</li>
		<li>Langsam das Pellet mit einem automatisierten Pipette 12 – 15 mL 4 % Sorbit-Lösung hinzu und mischen Sie die Kultur durch Kappung und invertieren das Rohr, bis die Kultur homogen ist.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C für 15 min.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Kultur bei 300 – 400 x g und standard Laborbedingungen für 5 min.</li>
		<li>Den Überstand zu entfernen, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Das Pellet 10 – 15 mL 0,9 % Kochsalzlösung hinzu und mischen Sie die Lösung durch Kappung und invertieren das Rohr, bis die Kultur homogen ist.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.6–1.2.8 zweimal mehr, alle Reste von Sorbit zu waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Baureihe Parasitemia Verdünnung
	<ol>
<li>Waschen Sie Lager Erythrozyten wie in den Schritten 1.2.6–1.2.9.</li>
		<li>Die Kultur bei standard Laborbedingungen, Lager Erythrozyten bei 300 – 400 X g für 5 min Zentrifugieren und überstand wie in Schritt 1.2.3 zu verwerfen.</li>
		<li>Label Mikrozentrifugenröhrchen als 0 %, 0,010 %, 0,025 %, 0.075 %, 0,100 %, 0.250 %, 0.750 % und 1.000 % und 0 µL, 1 µL, 2,5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL und 100 µL der Kultur, die jeweils mit einer 0,2-20 µL Pipette dazugeben.</li>
		<li>Hinzu kommen 100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92,5 µL, 80 µL, 75 µL, 0 und 25 µL Lager RBCs die Röhren beschriftet 0 %, 0,010 %, 0,025 %, 0.075 %, 0,100 %, 0.250 %, 0.750 % und 1.000 % bzw..</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die frischen Spenderblut gesammelt in Antikoagulans Rohre bei 1.200 x g und standard Laborbedingungen für 10 min.</li>
		<li>Entfernen Sie das Plasma durch Ausarbeitung mit einer Pipette und verwerfen, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.</li>
		<li>900 µL isolierte Erythrozyten in jeder Microcentrifuge Schlauch und gründlich mischen durch 10 X invertieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spektralen Erwerb
	<ol>
<li>Mit dem zugehörigen spektralen Erwerb Programm, klicken Sie auf "Instrument Set-up" und die Daten Sammlung Parameter Folgendes: 128 Scans für Hintergrund; 32-Scans für Probe; und die Auflösung auf 8/cm über die maximale Sample-Bereich des Instruments.</li>
		<li>Stellen Sie die Temperatur des ATR-FTIR-Spektrometers pro Empfehlung des Herstellers oder über Nacht.</li>
		<li>Reinigen Sie den Kristall sanft in kreisenden Bewegungen mit Flusen frei wischt mit Reinstwasser gedämpft schrubben. Dann trocknen Sie gründlich, mit einem anderen Flusen frei wischen.</li>
		<li>Nehmen Sie eine Hintergrundmessung der Luft, indem Sie auf "Hintergrundmessung". Alle 20 min, reinigen Sie den Kristall wie in Schritt 1.4.3 und wiederholen Sie diese Messung.</li>
		<li>Öffnen Sie die live-Ansicht durch Klicken auf "Vorschau". Beobachten Sie eine flache, horizontale Grundlinie, die angibt, dass das Glas sauber ist.</li>
		<li>Pipette 10 µL deionisiertes Wasser direkt auf die Mitte des Kristalls und klicken Sie auf "Maßnahme Sample". Wiederholen Sie die Messung dieses Wasser nach jeder fünften Probe.</li>
		<li>Trocknen Sie den Kristall ein Fussel freien abwischen mit sanften kreisenden Bewegungen.</li>
		<li>Pipette 10 µL der Probe, und klicken Sie auf "Maßnahme Sample".</li>
		<li>Reinigen Sie den Kristall zwischen Proben wie in Schritt 1.4.3.</li>
		<li>Wiederholen Sie, bis 3 Wiederholungen erworben werden, und achten Sie auf die Reihenfolge der Proben und die Wiederholungen zu randomisieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Multivariate Datenanalyse (MVDA)
Hinweis: Datenbehandlung muss über das gesamte Dataset durchgeführt werden, um Lärm und die Zugabe von Gipfeln nicht biologischen Ursprungs zu vermeiden. Im Gegensatz dazu über die biologisch relevanten Regionen analysieren: 2980-2800/cm und 1750-850/cm.
<ol><li>
Verarbeitung der Daten Hinweis: Zwei Software, z. B. Matlab (im folgenden als Software 1 bezeichnet) und The Flaschenaufrichter X (im folgenden als Software 2 bezeichnet) dienen als Beispiele für MVDA. 1-Software hat die Fähigkeit der Ausführung MVDA ohne Zusatz von eine grafische Benutzeroberfläche (GUI). Es wird jedoch empfohlen, eine GUI (Table of Materials) zu kaufen. Die folgenden Anweisungen, wenn bezogen auf Software 1 annehmen, dass in Verbindung mit den im Handel erhältlichen GUI-Toolbox, und Behandlung Beispielskript Daten angehängt wurde.<ol>
<li>Öffnen Sie die entsprechenden multivariate Datenanalyse-Software zu, klicken Sie auf "Daten importieren" und wählen Sie den Typ der Datei für die Analyse.<ol>
<li>In der Software 1 Eingang "Analyse" in das Befehlsfenster, die GUI zu öffnen. Rechten Maustaste die X-Box, um "Daten importieren" zu finden.</li>
			<li>Software 2 Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei" "Importieren" zu finden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Importieren Sie Probe, Wasser und Basislinie Spektren als Datensätze in den Arbeitsbereich durch alle Spektren in jedem Satz separat auswählen und auf "Öffnen" klicken und geben Sie jedem Satz einen kurzen Namen, z. B. "Wat" für Dataset Wasser Spektren.</li>
		<li>Wählen Sie neue Tabelle/Matrix durch Klicken auf "neue Matrix/Vektor" und erzeugen Sie einen n × 1-Vektor, wobei n die Anzahl der Samples ist. Geben Sie die Parasitemia jeder Probe und geben Sie dem Vektor der Name "Parasitemia".<ol>
<li>1 Software klicken Sie auf "Neue Variable" im Befehlsfenster.</li>
			<li>Software 2 Klicken Sie auf das Symbol "Neue Matrix".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plot-Daten durch Anklicken der "Plot-Daten". Inspizieren Sie die Spektren für Wasserdampf Effekte durch Klicken auf "Zoom" und Zoomen auf 1800-1400/cm; am deutlichsten beobachtete als kurze, scharfe, schmale Peaks entlang der Hänge der Amid ich und Amid II Bands.</li>
		<li>Öffnen Sie in Fällen von extremen Wasserdampf Registerkarte "Bearbeiten/pre-process Data" zu, und wählen Sie "Glättung". Reduzieren Sie die Geräusche bzw. der starken Wasserdampf Beiträge durch Glätten der Probe und Wasser Spektren mit bis zu 25 Punkten der Glättung oder verwenden Sie eine Wasserdampf-Korrektur-Methode.</li>
		<li>Richtig nicht-horizontalen Basislinie mithilfe des Grundlinie Korrektur Algorithmus gegebenenfalls unter der gleichen Registerkarte bearbeiten/pre-Prozess Daten in Schritt 2.1.4.</li>
		<li>Durchschnittliche Wasser Spektren und kopieren Sie die Zeilen in einer n × m Matrix entspricht der Beispiel-Dataset und reduzieren sie auf 70 % Intensität mit 0,7 multipliziert.<ol>
<li>In der Software 1 dazu im Befehlsfenster Eingabe das folgende Skript "AverageWater=mean(WaterDataset)". Dann kopieren und Einfügen der Zeilen entsprechend dem Beispieldatensatz. Um die Intensität zu reduzieren, geben Sie "AverageWater70 = AverageWater * 0,70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Durschnittliche Spektren von jedem Probenspektrum abziehen.<ol>
<li>In der Software 1, tun dies im Befehlsfenster durch Eingabe des folgenden Skripts "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Öffnen Sie die Registerkarte bearbeiten/pre-Prozess Daten um eine zweite abgeleitete Funktion anwenden und dann die Daten durch Auswahl der einzelnen normalen Variate (SNV) Funktion zu normalisieren und Center-Daten bedeuten.<ol>
<li>In der Software 1 tun dies in einem Rutsch. Wählen Sie zuerst "Derivat" und Eingabe 25 Punkte der Glättung, Polynomgrad 3 und abgeleitete Ordnung auf das Sample-set mit 25 Punkten der Glättung und eine Savitzky-Golay-Funktion. Wählen Sie dann "SNV" und "Meine Mitte". Klicken Sie auf "OK/übernehmen".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Öffnen Sie die Registerkarte "Bearbeiten/pre-Prozess-Daten" und wählen Sie im "Spalte Variablen", 2.980 – 2.800/cm und 1.750 – 850/cm indem sichergestellt wird, dass nur ihre Kästchen angekreuzt sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Datenanalyse
	<ol>
<li>Principal Component Analysis (PCA)<ol>
<li>Klicken Sie auf "Analyse | Decomposition"und wählen Sie PKA.<ol>
<li>1 Software klicken Sie auf "Modell zu bauen".</li>
				<li>In 2-Software die Eingabemethoden Sie PCA. Die optimale Anzahl der wichtigsten Komponenten (PCs) - in dieser Arbeit, 7 - Eingang und einem Maximum von 100 Iterationen und ausgewählte Kreuzvalidierung für die Validierungsmethode. Klicken Sie auf "Ausführen".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Beobachten Sie die 95 % Vertrauensgrenze, die gestrichelte Ring, auf dem Punkte-Grundstück zwischen PC1 und PC2.</li>
			<li>Markieren Sie die Probe-Spektren mit Noten, die außerhalb der Grenze als potenzielle Ausreißer mit dem "wählen Sie Spectra-Tool" auftreten.</li>
			<li>Wenn die markierte Spektren haben schließen Hotellings T2 Werte und hohe Q Residuen sie von der weiteren Analyse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Partial Least Squares Regression (PLS-R)<ol>
<li>Klicken Sie auf "Analyse | Regression"und wählen Sie"PLS-R".<ol>
<li>In Software 1, Y-Block rechts klicken und wählen Sie den Vektor "Parasitemia | Bauen Sie Modell".</li>
				<li>In 2-Software die Eingabemethoden Sie PLS-R. Wählen Sie den Vektor "Parasitemia" als "Y-Referenz" und die Beispiel-Dataset als "X Data Set" und wählen Sie Kreuzvalidierung als die Validierungsmethode. Klicken Sie auf "Ausführen".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Analysieren Sie das Regressionsmodell. R2 Werte über 0,80 und Root-Mean-Square-Fehler der Kreuzvalidierung (RMSECV) Werte, die kleiner als 0,1 % Parasitemia sind akzeptabel.</li>
			<li>Analysieren Sie den Vektor der Regression und identifizieren Sie die biologische Bands.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2016/report/en/">World Malaria Report 2016</a>. , (2016).</li>
<li>Rogers, W. Chapter 105. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRogers%2C+W+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. , American Society for Microbioogy, USA. 1355(1999).</li>
<li>White, N. J. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+NJ+%22Manson%27s+Tropical+Infectious+Diseases%22">Manson's Tropical Infectious Diseases</a>. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).</li>
<li>Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+threat%3A+asymptomatic+parasitemia+and+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).</li>
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<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
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<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

PLS-R-Modell ist eine betreute multivariate Methode, die findet eine lineare Beziehung, Y = bX + E, zwischen den prädiktiven Variablen X (hier: der Extinktion bei einzelnen Wellenzahl) und eine kontinuierliche Variable Y (hier: der Parasitemia-Ebene). Kurz gesagt, das Modell verbindet die Variablen X, um einen neuen Satz von latenten Variablen (LVs) erstellen, die die Varianz auf X korreliert mit Y zu erfassen, und einen Regression Vektor (b) berechnet, die ein neues Spektrum Ergebnisse bei der Schätzung der y-Wert multi...

Malaria zählt zu den verheerendsten Krankheiten unserer Zeit; mehr als die Hälfte die Bevölkerung lebt in endemischen Gebieten gefährdet und es unverhältnismäßig belastet die Armen1,2,3,4. Ein großer Teil des Problems ist die asymptomatische Träger und frühen Stadium-Patienten, die als Reservoir für Moskito Vektoren5, Handeln verursacht Spikes von Infektion während der Regenzeit und in den Gemeinden bestehen bleiben soll, so dass. Malaria wird durch fünf Plasmodium -Parasiten, verursacht die tödlichste von denen p. Falciparum ist die schwerste Form der Krankheit2verursacht.
Derzeit sind Techniken für die Diagnose von Malaria weniger als perfekt. Optische Mikroskopie, der derzeitige Goldstandard erkennt nur 62-88 Parasiten/µL je nach der verwendeten Methode6. Darüber hinaus aufgrund der Intensität und hohen Geschick erforderlich, in vielen Regionen Mikroskopie Fehldiagnosen > 50 % der Fälle, vor allem solche mit niedrigem Parasitaemia Ebenen2, in dem der Mangel an Ressourcen im Bereich und führt direkt zugeordnet werden können der Missbrauch von Anti-Malaria-Medikamenten. Die anderen 2 wichtigsten diagnostischen Methoden sind Schnelltests (RDTs), die Antikörper für die Erkennung und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assays, die Diskriminierung und Parasiten von DNA quantifizieren zu nutzen. RDTs können derzeit nur zur Erkennung von p. Falciparum und p. Vivax von mindestens 100 Parasiten/µL Blut was in selteneren Formen der Krankheit nicht behandelt wird. 7 , 8 dagegen PCR-Assays diskriminieren und quantifizieren, verschiedene Arten von Plasmodium bei einer Empfindlichkeit von 0,0004-5 Parasiten/µL Blut. Aber es erfordert teure Reagenzien, Ausrüstung und technisches Geschick und so eignet sich nicht für den Feldeinsatz.
Eine höchst sensible, zuverlässige und erschwingliche Technik unbedingt verbessern Diagnose Mal Behandlungsergebnisse zu verbessern, und die Beseitigung der Krankheit ermöglichen. Abgeschwächte totale Reflexion Fourier Transform (ATR-FTIR) Spektroskopie bietet eine mögliche Lösung für dieses Problem. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass war es möglich zu erkennen und zu quantifizieren, p. Falciparum in Methanol fixiert Blut Filme erreichen die Nachweisgrenzen der < 1 Parasit/µL Blut (< 0,0002 % Parasitemia)9, das PCR-Verfahren vergleichbar ist. Neuere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist zu erkennen und zu quantifizieren Parasiten in wässrigen Proben und eliminieren die Fixierung Schritt. Allerdings müssen Faktoren wie Wasserdampf, spektrale Rauschen und Datenverarbeitung für optimale Ergebnisse10berücksichtigt werden.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, neue Benutzer zeigen, wie Sie erwerben FTIR-ATR Spektren und bereiten ein Regressionsmodell für die Erkennung von p. Falciparum von wässrigen Erythrozyten (RBC) Proben10.

<table><tbody><tr><td>Spenderblut</td> <td>-</td><td></td> <td>Muss von einem ausgebildeten Arzt entnommen werden</td></tr><tr><td>Stammblut</td><td>des australischen Roten Kreuzes -</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>The Burnet</td> <td>Institute-Laboratory</td> <td>Stamm Wildtyp-Äquivalent</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium mit L-Hepes ohne Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>Aliquot in 50 mL Falcon-Röhrchen abfüllen und im Gefrierschrank aufbewahren</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Muss vor der Verwendung in Kultur filtriert werden</td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen (Vakutainer)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Kulturschalen Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipettenspitzen</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipettenspitzen</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierte Pipettensteuerung</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R Zentrifuge</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade 310 Direct Heat CO2 Inkubatoren</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E-100 Binokularmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td> Achten <td>Sie beim Kauf darauf, dass das 100x Objektiv ein Öl ist Immersionslinse</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR Spektrometer mit ATR Quick Snap Aufsatz</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td><td>Fordern Sie beim Kauf unbedingt den "Eco-ATR"-Aufsatz an</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td><td>Multivariate Datenanalysesoftware</td></tr><tr><td>The Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td><td>Multivariate Datenanalysesoftware</td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>GUI für Matlab</td></tr></tbody></table>

erkennung und quantifizierung von plasmodium falciparum in wässrigen roten blutkörperchen durch gedämpft totale reflexion infrarotspektroskopie und multivariate datenanalyse

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Wir zeigen eine Methode zur Quantifizierung und Nachweis von Parasiten in wässrigen roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mithilfe einer einfachen Benchtop abgeschwächt totale Reflexion Fourier transformieren (ATR-FTIR) Infrarotspektrometer in Verbindung mit Multivariate Datenanalyse ( MVDA). 3 7 p. Falciparum wurden kultiviert, 10 % Parasitemia Ring Bühne Parasiten und verwendet frische Spender isoliert Erythrozyten erstellen eine Verdünnung Serie zwischen 0 – 1 Spike %. 10 µL jeder Probe wurden aufgestellt, auf die Mitte des Fensters ATR Diamant, das Spektrum zu erwerben. Die Beispieldaten wurde behandelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und den Beitrag des Wassers zu entfernen, und dann die zweite Ableitung wurde angewandt, um die spektrale Eigenschaften zu lösen. Die Daten wurden dann mit zwei Arten von MVDA analysiert: erste Principal Komponente Analysis (PCA), Ausreißer und dann Partial Least Squares Regression (PLS-R) für die Quantifizierung Modellerstellung zu bestimmen.

Partial Least Squares (PLS-R) plot und seiner damit verbundenen Regression Vektor, Abbildung 1a und 1 b bzw. zeigen, dass das Signal vom Parasiten unterscheidet die Erythrozyten, die sie verwendet werden können, bilden eine lineare Regression Modell für verwendet werden die Vorhersage des Parasiten in zukünftigen Datensätzen.
Eine robuste, lineare PLS-R-Modell wurde mit einem Bestim...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum infizierten wässrigen roten Blutkörperchen mit einem abgeschwächten Totalreflexion Infrarot-Spektrometer und multivariate Datenanalyse.

Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Regressionsmodell für die Vorhersage von Malariaparasiten mit ATR-FTIR-Spektroskopie mit multivariater Datenanalyse zu erstellen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Point-of-Care-Diagnostik zu beschleunigen, was dazu beitragen kann, die Patientenergebnisse in der Zukunft zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Modell zwar einige Zeit in Anspruch nehmen kann, aber sehr tragbar, benutzerfreundlich, hochsensibel und kostengünstig ist.Obwohl diese Methode die Quantifizierung von Malariaparasiten ermöglicht, kann sie auch verwendet werden, um phänotypische Reaktionen auf Umweltveränderungen wie Veränderungen in der Parasitenzusammensetzung aufgrund von antimikrobiellen Wirkstoffen zu beobachten. Die Idee entstand aus der Arbeit, die wir am australischen Synchrotron an Malaria-infizierten Zellen machten. Dies war auf der Einzelzellebene.Von dort aus haben wir uns entschieden, die ATR-FTIR-Spektroskopie zu verwenden, um den diagnostischen Test tatsächlich zu entwickeln. Vor Beginn des Synchronisationsverfahrens, Kultur 30 Milliliter der 3D7-Stamm Plasmodium falciparum Parasiten, wie im Textprotokoll beschrieben. Mit einer automatisierten Pipette die Kultur wieder aufsetzen und in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen.Zentrifugieren Sie die Kultur bei 300 bis 400 mal g unter Standard-Laborbedingungen für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn mit einer automatisierten Pipette aufziehen, ohne das Pellet zu stören. Entsorgen Sie die Abfallmedien in einer 10%bleichlösung.Fügen Sie dem Pellet langsam 12 bis 15 Milliliter einer 4%Sorbitol-Lösung hinzu und mischen Sie die Kultur, indem Sie die Röhre verschließen und invertieren, bis die Kultur homogen ist. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Kultur für fünf Minuten.Verwenden Sie eine automatische Pipette, um den Überstand zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 10 bis 15 Milliliter 0,9% Saline in das Pellet und mischen Sie die Lösung durch Verkappen und Invertieren der Röhre, bis die Kultur homogen ist. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Solollösung zwei weitere Male waschen, um alle Sorbitreste zu entfernen.Um dieses Verfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie die Stock rote Blutkörperchen, oder RBCs. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie mit 0,9% Saline insgesamt dreimal. Zentrifugieren Sie die Vorrats-RBCs und die Kultur bei 300 bis 400 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand aus jedem Rohr.Etikettieren Sie acht Mikrozentrifugenröhrchen wie angegeben. Verwenden Sie dann eine 0,2 bis 20 Mikroliter Pipette, um jedem Rohr die entsprechende Kulturmenge hinzuzufügen. Als nächstes fügen Sie die entsprechende Menge an Vorrat RBCs zu jedem Rohr hinzu, um die gewünschte Parasitenverdünnung zu erhalten.Zentrifugieren Sie das frische Spenderblut, das in gerinnungshemmenden Röhrchen bei 1, 200 mal g und Standardlaborbedingungen für 10 Minuten gesammelt wird. Entfernen Sie das Plasma, indem Sie es mit einer Pipette aufziehen und in eine 10%ige Bleichlösung entsorgen. Fügen Sie 900 Mikroliter isolierter Spender-RBCs in jedes Mikrozentrifugenrohr ein und mischen Sie es gründlich, indem Sie das 10-fache invertieren.Zur Erfassung des Spektrums wird ein einfaches Benchtop Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared oder ATR-FTIR-Spektrometer verwendet. Bereiten und reinigen Sie den Kristall mit fusselfreien Tüchern, die mit ultrareinem Wasser gedämpft sind, um den Kristall in einer kreisförmigen Bewegung sanft zu schrubben. Verwenden Sie dann ein anderes fusselfreies Wischen, um den Kristall gründlich zu trocknen.Nehmen Sie eine Hintergrundmessung der Luft vor, indem Sie auf Hintergrundmessung klicken. Reinigen Sie den Kristall alle 20 Minuten und wiederholen Sie diese Messung. Öffnen Sie die Live-Ansicht, indem Sie auf Vorschau klicken.Beobachten Sie eine flache, horizontale Grundlinie, die angibt, dass der Kristall sauber ist. Pipette 10 Mikroliter entionisiertes Wasser direkt auf die Mitte des Kristalls und klicken Sie auf Messprobe. Trocknen Sie den Kristall mit einem fusselfreien Tuch und einer sanften kreisförmigen Bewegung.Pipette 10 Mikroliter der Probe auf die Mitte des Kristalls und klicken Sie auf Messen Probe. Reinigen Sie den Kristall zwischen den Proben. In dieser Demo wird die multivariate Datenanalyse mit MATLAB durchgeführt.Um mit der Datenverarbeitung zu beginnen, geben Sie die Analyse in das Befehlsfenster ein, um die grafische Benutzeroberfläche zu öffnen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Feld X, um Daten importieren zu suchen. Wählen Sie den Dateityp für die Analyse aus.Importieren Sie Stichproben-, Wasser- und Basisspektren als Datasets in den Arbeitsplatz, indem Sie alle Spektren in jedem Satz einzeln auswählen, auf Öffnen klicken und jedem Satz einen kurzen Namen geben. Klicken Sie im Befehlsfenster auf Neue Variable, und geben Sie dem Vektor den Namen Parasitemia. Geben Sie die Parasitemie jeder Probe ein.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das X-Feld, um Plotdaten zu finden. Klicken Sie auf das Symbol Daten zeichnen, um die Daten darzustellen. Prüfen Sie die Spektren auf Wasserdampfeffekte, indem Sie auf Zoom klicken und auf 1, 800 bis 1, 400 Prozent zentimeter vergrößern, am deutlichsten als kurze, scharfe, schmale Gipfel entlang der Hänge der Amide I und Amide II Bänder beobachtet.Öffnen Sie bei extremem Wasserdampf die Registerkarte Daten bearbeiten, und wählen Sie Glättung aus. Reduzieren Sie den Lärm und/oder starke Wasserdampf-Beiträge, indem Sie die Probe und die Wasserspektren glätten. Öffnen Sie nach der weiteren Datenbehandlung, wie im Textprotokoll beschrieben, die Registerkarte Daten bearbeiten, und wählen Sie in Spaltenvariablen 2980 bis 2800 Perzent und 1750 bis 850 Prozent der Werte aus, indem Sie sicherstellen, dass nur ihre Kästchen angekreuzt sind.Die Daten sind nun zur Analyse bereit. Um die Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchzuführen, klicken Sie auf Analysezersetzung, und wählen Sie PCA aus. Klicken Sie auf Modell erstellen.Beachten Sie die 95%-Vertrauensgrenze, den gestrichelten Ring, auf dem Partiturdiagramm zwischen PC 1 und PC 2. Verwenden Sie das Werkzeug Spectra auswählen, um die Stichprobenspektren mit Werten zu markieren, die außerhalb des Grenzwerts auftreten, als potenzielle Ausreißer. Um eine partielle Regression mit den kleinsten Quadraten (PLSR) durchzuführen, klicken Sie auf Regression analysieren, und wählen Sie PLSR aus.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Y-Block, und wählen Sie das Vektormodell Parasitemia build aus. Analysieren Sie das Regressionsmodell und den Regressionsvektor, und identifizieren Sie die biologischen Bänder. Ein partielles Regressionsdiagramm mit den kleinsten Quadraten von RBCs, das zwischen null und ein Prozent Parasitemien gespitzt wurde, erzeugte einen R-Quadratwert von 0,87 und einen wurzelmittleren quadrierten Kreuzvalidierungsfehler von 0,13%Parasitemie.Dies zeigt die Fähigkeit des Modells, die Parasitemie in jeder Probe mit der bekannten Parasitemie auf der x-Achse und der vorhergesagten Parasitemie auf der y-Achse vorherzusagen. Der zugehörige Regressionskoeffizient beschreibt den Beitrag jedes Bandes zur Vorhersagefähigkeit des Modells. Je intensiver das Band, desto mehr trägt es zum Modell bei und damit, wie der Parasit die chemische Zusammensetzung des Blutes verändert.Die Ergebnisse zeigen, dass das Signal von Parasiten so deutlich von den RBCs ist, dass sie verwendet werden können, um ein lineares Regressionsmodell für die Vorhersage von Parasiten in zukünftigen Datensätzen zu bilden. Nach der Beherrschung kann diese Technik weniger als drei Minuten pro Probe dauern, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die ATR-Kristalle von allen Rückständen zu reinigen.Nach diesem Verfahren können andere Malariaarten wie P vivax und P Malaria emittiert werden, um solche Fragen zu beantworten, wie: Ist die ATR-FTIR-Spektroskopie empfindlich genug, um zwischen Arten zu unterscheiden? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biospektroskopie, um den Nachweis und die Quantifizierung anderer blutübertragener Krankheitserreger zu erforschen und sogar im Blut wie Glukose und Harnstoff zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der ATR-FTIR-Spektroskopie und nVDA-Analyse haben, um ein Regressionsmodell zu erstellen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut- und Malariaproben von Patienten gefährlich sein kann, und bei einem Versuch dieses Eingriffs sollte immer ein angemessenes Training und Eindämmung auf Biosicherheitsniveau durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Phagozytose-Assay mit markierten und opsonisierten Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten durch Monozyten. Die Durchflusszytometrie identifiziert die Fluoreszenz in Monozyten und bestätigt damit die erfolgreiche Identifizierung opsonisierter Erythrozyten durch Phagozytose.

Ein Assay zur Quantifizierung der Antikörper-vermittelten Phagozytose von parasiteninfizierten Erythrozyten

Die paramagnetischen Eigenschaften des Hämozoins werden verwendet, um späten Stadien der...

Trennung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel

Mess Antikörper Funktion ist der Schlüssel zum Verständnis Immunität gegen Plasmodium falciparum Malaria. Diese Methode beschreibt die Reinigung von lebensfähigen Merozoiten und Messung der Opsonisierung-abhängigen Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Die Malaria-Parasiten dringt und Wiederholungen in den roten Blutkörperchen. Die genaue Beurteilung der Merozoiten Invasion und Parasitämie ist daher entscheidend für die Beurteilung der Verlauf der Malaria-Infektion. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie basiertes Protokoll für die Messung dieser Parameter in einem Maus-Modell der Malaria.

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

Humane microRNAs translozieren von Wirts-Erythrozyten zu Plasmodium falciparum-Parasiten. Im Folgenden werden die Techniken beschrieben, mit denen synthetische microRNAs in Erythrozyten des Wirts transfiziert und alle RNAs aus P. falciparum isoliert werden.  Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Polysomen in P. falciparum beschrieben, um die ribosomale Belegung und das translationale Potenzial von Parasitentranskripten zu bestimmen.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

Dieses Protokoll beschreibt einen Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum Nachweis von Speicheldrüsen-Sporozoiten in Mücken. Unter Verwendung leicht verfügbarer monoklonaler Antikörper ermöglicht die Methode einen kostengünstigen Hochdurchsatznachweis von Mücken, die Plasmodium falciparum oder Plasmodium vivax tragen. Die Methode eignet sich für die Erforschung der Malariaübertragung, einschließlich Vektoruntersuchungen.

Nachweis von Plasmodium Sporozoiten in Anopheles-Mücken mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Erfahren Sie die Quantifizierung von Plasmodium falciparum in roten Blutkörperchen mittels ATR-FTIR-Spektroskopie und multivariater Datenanalyse. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Point-of-Care-Diagnostik für Malaria.

Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse (Video) | JoVE Journal

Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse

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