Name: Optimierte 3D zerebelläre Differenzierung Protokoll mit Optional 2D Modifikation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Erfahren Sie ein optimiertes 3D-Differenzierungsprotokoll für humane pluripotente Stammzellen zur Generierung zerebellärer Zelllinien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen kindlicher Hirnerkrankungen.

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Wir sind dankbar, Gerbren Jacobs und Jurjen Broeke für ihre kompetente technische Hilfe zu Prisca Leferink zur Verfügung gestellt, die Generierung und Charakterisierung von zwei Steuerleitungen iPSC und Lisa Gasparotto zur Demonstration unserer Verfahren.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Komplexität und Kosten sind ausschlaggebend für Stammzellforscher bei der Wahl oder Differenzierung Protokolle zu entwickeln. Dies gilt vor allem, wie es eine offene Frage ist des wieviel externe Steuerung erforderlich ist, um die gewünschte Zelle Arten erzeugen oder – um es anders darstellen — wie zuständigen hPSCs sind bei der Herstellung von eigenen Entwicklungsumgebung, wenn sich selbst überlassen, mit ausreichend Nährstoffe. Einführung von äußeren Faktoren in Vitro kann sehr gut gewünschte Zelle Produkte produzieren, aber sie könnte auch stören mit der inneren Entwicklungen Kapazitäten würden Zellen in Vivoausgestellt haben. Solche Überlegungen sind wichtig, insbesondere dann, wenn das Ziel des Patienten abgeleitet iPSCs für Krankheit Modellierung nützt. Umfangreiche Verwendung von Mustern und/oder Wachstumsfaktoren könnte Krankheit Phänotypen verbergen. Die in diesem Bericht detaillierte Protokolle folgen dem Trend der früheren Studien zur Verringerung von Komplexität, Kosten und/oder Verwendung von extrinsischen Musterung Faktoren8,9.
Basierend auf Ergebnissen von Muguruma Et Al., und unsere eigene Studie berichtet, scheint es, dass es möglich ist, die Differenzierung gegenüber zerebelläre Schicksale ohne konzertierte Anstrengungen, in Vivo Bedingungen zu reproduzieren zu erreichen, wie frühere Studien gemacht haben 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. das faszinierende ist, dass die beiden Studien verschiedene Sätze von Wachstumsfaktoren verwendet, was darauf hindeutet, dass weder Satz notwendig waren, obwohl beide FGF2 verwendet. Wir wurden zusätzliche Tests, wo FGFs waren selektiv aus dem Protokoll ausgeschlossen, und zeigten, dass Zellen erzeugen die gleichen Produkte ohne extrinsische FGFs10. Unterschiede zwischen unseren Studien wurden durch die Tatsache, dass wir verschiedene hPSC Linien und Kulturmethoden verwendet, neuronale Differenzierung mit RA induzierte und Komponenten zur Unterstützung von Granulat Zelle überleben und Reifung (BDNF GDNF, SAG und KCL) enthalten qualifiziert11 –14. Darüber hinaus wurde eine weniger komplexe Startup-Methode im Vergleich zu Muguruma Et Al., beschäftigt. Ihr Protokoll begann durch die Generierung von einheitlichen EBs in 96WPs, die sie physikalisch und chemisch voneinander isoliert. Das Protokoll hier hatten alle PSCs relativ engstem in 6WPs bei EB Bildung, die ihnen erlaubt, frei zu interagieren. Wie dies differentiell die physikalische und chemische Umgebung der EBs und späteren Organellen (einschließlich intrinsische Produktion der Signalisierung Verbindungen) betroffen sind ist unbekannt, und erforscht werden konnte. Auch, während wir Expression von zeigen Genen zugeordnet – und so suggestiv von — zerebelläre Herkunft, befindet sich innerhalb der Strukturen morphologisch ähnlich denen von Muguruma Et Al., berichtet, können wir nicht ausschließen Generation von neuronalen-ähnliche Strukturen, die sind nicht-zerebelläre Identität. Zukünftige Studien berichtet mit einem großen Panel von Antikörpern wie jene von Muguruma Et al. (d.h., ATOH1, CALB, etc.) solche Zuordnungen und Vergleich zwischen den Produkten der beiden Protokolle, aussagekräftiger machen würde.
Innerhalb des 3D-Protokolls es ist wichtig, mit zu beginnen und erhalten eine ausreichende Anzahl von Zellen in Kultur in ausreichender Zahl der Endprodukte für die Analyse zu gewährleisten. Bedeutende Absterben früh in das Protokoll gegeben, empfehlen wir, beginnend mit mehr als 500 EBs/Brunnen während der ersten 3 Tage in Kultur (Abbildung 1). Dies sollte nicht schwierig sein, bestimmte Kolonie Größen für hPSCs im Feeder-freie Kultur zu erreichen, aber möglicherweise nicht so einfach, für diejenigen die immer noch mit Feeder-abhängige Methoden. Angesichts der großen Zahl von Zellen, ist es wichtig, für Farbwechsel in Medium (d. h. pH-Wert-Änderungen) und Anhäufung von abgestorbenen Zellen zu beobachten. Beide müssen korrigiert werden, um die Kultur Zusammenbruch zu verhindern. Darüber hinaus kann Verklumpen von Zellen und Aggregate in massiven Strukturen. Obwohl es noch Aggregate führen kann, die analysiert werden können, wird Produktmenge stark reduziert werden, so brechen sie in kleinere Aggregate mit sanften Verreibung nützlich sein kann. Allerdings vermeiden störende normale Aggregate, die selbst für große Größen (Abbildung 4) wachsen können. Wenn Aggregate zu spärlich werden, empfiehlt es sich, Brunnen zu kombinieren, so dass Aggregate nicht vollständig isoliert sind. Produkt-Variabilität (in Anzahl, Größe und Morphologie) ist ein bekanntes Problem in 3D Zellkultur, einschließlich der für diese Protokolle beginnend mit isolierten, einheitliche EB Bildung Schritten darauf hindeutet, dass eine weniger komplexe Startprozedur (wie das hier beschriebene Protokoll ) wäre praktischer8,15. Während diese Heterogenität ist etwas, was Forscher im Auge zu behalten, besonders während der Analyse müssen, generiert der gemeldeten Protokoll Produkte entsprechen denen in anderen 3D Protokolle8,9,15. Je nach Größe und Morphologie, fallen sie im Bereich der neuronalen Rosette zerebralen organoide, wie in den letzten Beitrag von Kelava und Lancaster15, mit den meisten passend die Klassifizierung der Sphäroid beschrieben. Besonders bemerkenswert sind das Vorhandensein von 3D-Strukturen suggestive der neuronalen Rosetten mit Lumen (Unterzonen) ventrikuläre und rhombischen-Lippe wie Funktionen (Abb. 5 und Abbildung 6) als durch andere Gruppen8 , 15 , 16 , 17. da jedes Experiment mindestens produziert Aggregat mit vermeintlichen VZ/SVZs und Kleinhirn-assoziierten Marker (ZIC1, KIRREL2), das sind nützliche Kriterien für den Erfolg einer 3D Differenzierung RL-wie unser Protokoll mit Funktionen, die zusätzliche Unterstützung. Verlängerung der Länge der Kultur seit 35 Tagen wurde nicht getestet, aber könnte verfolgt werden, um das maximale Ausmaß des Wachstums, Komplexität und Reife, die durch diese Technik erlaubt bestimmen.
Das 2D-Protokoll verwendet die gleichen nicht-anhaftende EB Bildung und neurale Induktion-Prozess als 3D-Protokoll und also die obigen Bemerkungen gelten auch. Einmal überzogen, eine andere Gruppe von Überlegungen zu berücksichtigen. Die EBs sollte schnell Zellen zu vermehren nach außen auf die Platte halten. Wenn es Probleme mit der Einhaltung, Zugabe von RI (wenn nicht bereits verwendet wird), reduziert Volumen des Mediums oder experimentelle Veränderungen in PLO/LAM Konzentration angewandt werden. Es ist wichtig, dass Zellen wachsen zu dicht oder spärlich (vorzugsweise zwischen 20-80 % Konfluenz angebaut) in den Brunnen; tägliche Kontrolle und rechtzeitige Passagierung gilt, über-Konfluenz oder schwimmende Zellen zu vermeiden. Im Gegensatz zu den 3D-Protokoll sollte es nicht signifikante Absterben während Kultur, obwohl möglicherweise schlechte Wachstumsfelder oder eine Verlangsamung der Verbreitung Preise. Passagierung betrifft die Reifung Zustand der Zellen (z. B. Zellprozesse und entwickelten Netzwerke zwischen den Zellen zu entfernen) und sollte im Verstand gehalten werden, wenn Punkte nähern, wo Zellen gesammelt oder in irgendeiner Weise analysiert werden. Beispielsweise ist für Kalzium imaging es sehr wichtig, um Durchgang Zellen zwischen 2 bis 6 Tage vor der Analyse. Zu nah an Passagierung bedeuten Analyse Zellen hatte noch keine Zeit, eine Verbindung herzustellen und/oder Reifen und zu weit führen in den Zellen Überbelegung, Bildgebung erschwert. Obwohl Variabilität zwischen Experimente vorhanden sind, sind die Ergebnisse stimmen mit denen im ersten 2D zerebelläre Protokolle1,2gemeldet. ICC Färbung und gen Expressionsanalyse bestätigen das Vorhandensein von Zellen positiv für Granulat Zellmarkierung ZIC1, während auch die Ermittlung Marker, die mit anderen neuronalen und zerebelläre Identitäten (Abbildung 7 und Abbildung 8). Kalzium-Bildgebung, die elektrischen Stimulation der Zellen inkubiert mit fluor5 Farbstoff beinhaltet, angegeben funktionellen neuronalen Aktivität (Abbildung 9, ergänzende Abbildung1und ergänzende Abbildung2), obwohl es nicht bestätigt, ist wenn diese Granulat-Zellen waren. Es ist fraglich, dass von Zellen zu Reifen durch Verlängerung der Länge der Kultur vergangenen 35 Tage mehr Zeit geben, die funktionelle neuronale Aktivität erhöhen sollte. Dieses Potenzial könnte in der Zukunft untersucht werden.
Zusätzlich zu den Linien der Forschung oben vorgeschlagen wäre es von Interesse, um Unterschiede in Produktidentitäten (Quantität und Qualität) bestimmen zwischen 2D und 3D-Protokolle. Die Bedeutung der extrinsischen FGFs wurde nicht in das 2D Protokoll getestet, und es wäre nützlich zu wissen, ob der 3D-Struktur nach Beschichtung fehlt, und so die damit verbundenen Signalwege würde 2D Kulturen mehr oder weniger abhängig machen diejenigen früh Musterung Verbindungen. Weitere abgespeckte Protokolle (z. B.kein RA, BDNF, SAG) sind gleichermaßen plausibel Linien zur weiteren Untersuchung. Schließlich könnte zukünftige Studien profitieren Sie von neuen Recherche-Tools besser zu charakterisieren (und Generation Effizienz zu beurteilen) Mensch-spezifische Kleinhirn neuronale Subtypen.
Mit dem bestimmten Vorbehalte berichteten beide Protokolle für zerebelläre Differenzierungen mit Produkten für verschiedene Zwecke geeignet verwendet werden können. Sie können als praktische Ansatzpunkte für Forscher Pilotstudien, Durchführung von Tests Lebensfähigkeit von Zelllinien für solche Differenzierungen oder als ein einfaches Modell für andere Arten von gezielte neuronale Differenzierung dienen.

In-vitro- Protokolle zur Differenzierung von hPSCs in Richtung Kleinhirn Linien zunächst betrieben auf dem Prinzip der Nachahmung in Vivo zerebelläre Entwicklung1,2,3,4. So verlangten sie eine Reihe von Faktoren, die zu bestimmten Zeiten Pro-zerebelläre Musterung und Reifung fahren eingeführt. Das wichtigste davon WNT, wurden Knochen morphogenetische Proteine (BMPs) und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) mit bekannten Rollen in der Mitte Hinterhirn Entwicklung und Bildung der Isthmische Veranstalter5,6,7. Natürlich, jeder weitere Schritt und Faktor bedeutet einen Anstieg der arbeitsintensiven Manipulationen und größeren Aufwand für den Forscher, und so entwickeln einfacher Protokolle in der Lage, die gleichen Ergebnisse zu erzielen ist von Interesse. Dieser praktischen Frage knüpft sehr schön die hypothetische Frage, ob Zellen solche engen, externe Kontrolle über ihre Entwicklung in Vitro benötigen.
Zerebelläre Differenzierung adressiert ein Protokoll veröffentlicht im Jahr 2015 die Notwendigkeit der Verwendung einer umfangreichen Reihe von Wachstumsfaktoren mit nur FGF2, FGF19 und Stromazellen Cell-derived Factor 1 (SDF1) für Zwecke8-Strukturierung. Diese Studie unterschieden sich auch aus vorherigen zerebelläre Protokolle mit einem frei schwebenden 3D Culture-System. Neben der Produktion von Zellen positiv für zerebelläre Markierungen, zeigte die Gehirn "Organellen" durch ihre Technik erzeugt relevanten Morphologie, nicht verfügbar in traditionelle 2D Monolayer-Kulturen wie rhombischen Lippe-ähnliche Strukturen aufweisen. Obwohl weniger komplex und kostspielig im Hinblick auf Wachstumsfaktoren, weitere Funktionen wie z. B. Bildung von einheitlichen Embryoid Körper (EBs) und Kultur in 96-Well-Platten (96WPs), machte es verfahrensrechtlich komplexe während der ersten Schritte. Ein weiteres 3D Protokoll veröffentlichte im gleichen Jahr, erfolgreiche Differenzierung zu neuronalen Linien mit gemeinsamen und kostengünstige Zelle Kultur Techniken9berichtet. Obwohl diese Gruppe kortikalen anstatt zerebelläre Differenzierung untersucht wurde, konnte Anwendung ihres Konzepts für zerebelläre Differenzierung nicht vernachlässigt werden.
Wir berichteten vor kurzem ein 3D zerebelläre Differenzierung-Protokoll mit einer reduzierten Anzahl von Musterung Faktoren (nämlich FGF2, 4 und 8), sowie ein vereinfachtes Setup indem man Zellen in 6-Well-Platten (6WPs) durchgehend bis mittleren Anforderungen10zu minimieren. Zur Herstellung von Granulat-Zellen zu unterstützen, wurde geglättet Agonist (SAG) während die endgültige Reifung Schritt verwendet. SAG ist eine weniger teure chemische Alternative zu sonic Hedgehog (SHH), die in früheren zerebelläre Protokolle, wegen seiner Rolle bei der Förderung des Wachstums von Granulat Zelle Vorläufer (GCPs) in Vivo1,2, benutzt worden 11,12,13. Differenzierung-Produkte wurden mit denen von anderen 3D Protokolle, einschließlich des Kleinhirn-assoziierten Marker in morphologisch relevanten Strukturen8,9. Solche Ergebnisse stärken die frühere Nachricht, Mimikry in die Tiefe, des in Vivo Umgebung möglicherweise nicht für komplexe 3D in-vitro- Differenzierung Protokolle erforderlich.
Neben dem 3D Protokoll der vorliegende Bericht beschreibt ein 2D Protokoll entwickelt, mit der gleichen Schnelleinrichtung, Grundstoffen, und reduzierte Anzahl von Wachstumsfaktoren. Es ist in der Lage, Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen (HES) oder induzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs), positiv für Markierungen im Zusammenhang mit frühen neuronalen, zerebelläre, und Granulat Zelle Identitäten. Zusätzlich zeigt Kalzium Bildgebung das Vorhandensein von funktionalen menschlichen Neuronen. Die Möglichkeit zu wählen zwischen Protokollen, fügt ein Maß an Flexibilität für Forscher, für Interessenten an entweder: (1) Erzeugung von bestimmten Zelle eingibt, (2) Modellierung menschlichen Gehirnentwicklung und die damit verbundenen Strukturen, (3) Analyse in monomolekularen Film optimiert Einstellungen (z.B., Patch-Clamp-Aufnahmen), oder (4) Zell-Zell-Interaktionen in neuronalen Mischkulturen. Ihre einfache und kostengünstige Art macht sie zugänglich für Forscher, die sind neu auf dem Gebiet der hPSC oder base hPSC Verfahren aus, um weitere Differenzierung Optionen zu erkunden.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>mit Glutamin angereichert DMEM/F12</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>neuronales Basismedium</td></tr><tr><td>N2-Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poly (2-Hydroxyethylmethacrylat)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>aka Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 Medium und Supplement</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC Medium und Supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td></td><td>Sigma S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (ROCK-Inhibitor)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>hPSC-geeignete haftende Beschichtung (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0,2 μm Filter</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf Tube</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>Wrap für Kulturplatten</td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>Dissoziationsmittel auf Trypsinbasis</td></tr><tr><td>Definierter Trypsin-Inhibitor (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R& D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Neurotropher Faktor aus dem Gehirn</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Neurotropher Faktor aus Gliazellen</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroph Faktor 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened Agonist (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Axiovert 40C Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield Imaging Mikroskop</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield Imaging - Bilderfassung</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>Zentrifuge für Zellkultur</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Kulturplatten</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESCs</td><td>WiCELL</td><td></td><td>Linie H01</td></tr></tbody></table>

optimierte 3d zerebelläre differenzierung protokoll mit optional 2d modifikation

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Reduzierung von Komplexität und Kosten der Differenzierung Protokolle ist wichtig für die Forscher. Dieses Interesse passt mit Sorgen über mögliche unerwünschte Wirkungen, dass extrinsische Musterung Faktoren in menschlichen pluripotenten Stammzelle (hPSC) Modelle der Entwicklung des Gehirns oder Pathophysiologie, wie Maskierung Krankheit Phänotyp führen könnten. Hier präsentieren wir Ihnen zwei zerebelläre Differenzierung Protokolle für hPSCs, ausgelegt mit einfacher Startmethode, weniger Musterung Faktoren und weniger Materialbedarf als frühere Protokolle. Vor kurzem haben wir Kultur Verfahren, die frei schwebenden 3-dimensionale (3D) Produkte mit anderen Gehirn "organoide" Protokolle, einschließlich Morphologien relevant zur Entwicklung des Gehirns wie Sub/ventrikuläre Zone - Modellierung und rhombischen generieren Lippe-ähnlichen Strukturen. Die zweite verwendet ein anhaftende, 2D Monolayer-Verfahren, um vollständige Differenzierung, die funktionelle zerebelläre Neuronen erzeugen, wie Produkte für zerebelläre-assoziierten Marker positiv sind, und Neuron-wie Kalzium Zustrom weisen angezeigt wird. Zusammen bieten diese Protokolle Wissenschaftler eine Auswahl von Optionen, geeignet für verschiedene Forschungszwecke sowie ein Grundmodell für Tests andere Arten von optimierte neuronale Differenzierungen.

Visuelle Übersicht über verringertes Wachstum Faktor 2D und 3D zerebelläre Differenzierung Protokolle Abbildung 1 zeigt den Gesamtzeitplan für die 2D und 3D zerebelläre Differenzierung Protokolle, Identifizierung von äußeren Faktoren und Zeit der Beschichtung. Die typische Fortschritt für hPSCs in 3D zerebelläre Differenzierung ist in Abbildung 2dargestellt: mit hESC Linie H01 ab als Kolonien Feeder-freie Kultur am Tag 0 (Abbildung oben links); in der EB Bildung von Tag 2 (oben Mitte); wachsen zu größeren Aggregaten der Zelle mit scheinbaren Lumen nach neuronalen Induktion mit RA und FGF8 am Tag 14 (oben rechts); Bildung von Aggregaten von unterschiedlicher Größe und Form am 28. Tag (links); Entwicklung komplexer mit unterschiedlichen Strukturen von einem einzigen Aggregat angegeben am Tag 28 (Mitte unten); und mit morphologische Veränderungen in den gleichen Strukturen am Tag 35 (unten rechts). Die typische Fortschritt für hPSCs in 2D zerebelläre Differenzierung ist in Abbildung 3dargestellt: eine Linie mit hESC H01 als Kolonien im Feeder-freie Kultur am Tag 0 (oben links der Abbildung, mit Angabe der Fläche von differenzierten Zellen unter hESC Kolonien Kreis) ; in der EB Bildung von Tag 2 (oben Mitte); wachsen zu größeren Aggregaten der Zelle mit scheinbaren Lumen nach neuronalen Induktion mit RA und FGF8 am 13.Tag (oben rechts); wuchernden als adhärente Zellen nach Beschichtung am 14. Tag (links); und dann als eine Monolage von Zellen mit mehr komplexe/ältere Morphologie am Tag 35 unter Low (Mitte unten) und hoher Vergrößerung (unten rechts).
3D Produkte ausstellen, Marker und Strukturen der frühen Neuroepithelium Abbildung 2 (Bild unten links) und Abbildung 4 zeigt die Heterogenität der 3D aggregierte Morphologie im ganzen Kultivierung, aufgrund der unterschiedlichen Wachstum und/oder Reifung, sowie das stochastische zusammenführen oder Auseinanderbrechen der Aggregate. Trotz Heterogenität produziert jede Differenzierung Aggregate ausstellen frühe neuronale und neuronale Marker, einschließlich zerebelläre Granulat Marker ZIC1, wie durch Immunocytochemistry (ICC) Färbung in Abbildung 5dargestellt. Noch wichtiger ist, Abbildung 5 und Abbildung 6 deuten darauf hin, dass eine einfache 3D Culture mit reduzierten Wachstumsfaktoren, geeignet zur Erzeugung von Aggregaten mit komplexen Strukturen, die im Zusammenhang mit der Entwicklung des Gehirns wie die frühen Neuroepithelium und rhombischen Lippe ist.
2D Produkte ausstellen, zerebelläre Marker und funktioneller neuronaler Aktivität Während 2D Kulturen komplexe 3D-Strukturen nicht reproduzieren können, sind sie geeignet zur Erzeugung Zellen ausstellenden frühe neuronale und neuronale Marker, einschließlich zerebelläre Granulat Zellmarkierung ZIC1, wie durch ICC Färbung in Abbildung 7gezeigt. Gen Expressionsanalyse über RT-PCR, unterstützt wie in Abbildung 8zu sehen ICC Färbung Ergebnisse, obwohl die Anwesenheit von frühen Granulat Zellmarkierung ATOH1 Variable zwischen Experimenten und Linien ist. Calcium Imaging wird leichter in 2D Kultur behandelt. Wie in Abbildung 9, ergänzende Video 1und ergänzenden Video 2gesehen, zeigen elektrisch stimulierte Zellen Kalzium Zuflüsse, die typisch für neuronaler Impulsmuster vorschlagen Generation von funktionelle Neuronen sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Abbildung 1: Chronologie der Differenzierung Protokoll (ab Tag 0 der Differenzierung). Durchgezogene Linie Kästchen zeigen an, wenn bestimmte Faktoren das Kulturmedium hinzugefügt sind und gepunktete Linie Kästchen zeigen an Teller-Beschichtung für optionale 2D Modifikation. Für FGF2 der Pfeil nach unten bezieht sich auf niedrigeren Konzentrationen (4 ng/mL), und der Pfeil nach oben auf höhere Konzentrationen (20 ng/mL). Diese Zahl wurde von Holmes und Heine10geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Abbildung 2: Vertreter Brightfield Bilder 3D Protokolls. hESC Kolonien an d0, EBs bei d2, aggregiert nach Induktion bei d14, Aggregate unterschiedlicher Größe und Morphologie (nummeriert 1-5) bei d28, ein einziges Aggregat mit einzigartigen, identifizierbare Merkmale (gekennzeichnet durch Buchstaben einen–c) bei d28, und sichtbare Veränderungen in die gleichen Funktionen bei d35. Maßstabsleiste = 100 µm. Diese Zahl wurde von Holmes und Heine10geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Abbildung 3: Vertreter Brightfield Bilder von 2D Protokoll. hESC Kolonien Aggregate ein d0, EBs bei d2, nach Induktion bei d13, nach Beschichtung Aggregate bei d14, nach der Reifung bei d35, gesehen bei 5 x Vergrößerung und 20 X Vergrößerung. Der weiße Kreis in der oberen linken Seite zeigt den Bereich der differenzierten Zellen unter hESC Kolonien. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Abbildung 4: Hellfeld Bilder unterschiedlicher Größe und Komplexität in 3D Culture. Aggregate (A) Tag 8 (hESC) und (B) d35 (HiPSCs). Das letztere Bild besteht aus drei separate Bilder um das gesamte Aggregat zeigen. Beide Aggregate können durch die Zusammenlegung von kleineren Aggregaten oder Verlust (Abbruch) Strukturen betroffen. Maßstabsleiste = 200 µm. Diese Zahl ist von Holmes und Heine10neu aufgelegt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Abbildung 5: ICC Bilder 3D Produkte zeigen relevante Marker und Strukturen. Auf Kultur d35, 3D Produkte ausstellen: PAX6 (grün) und TBR2 (rot) von Lumen der neuronalen Rosette-wie Anordnung (erste Reihe); DCX (grün) und NeuN (rot) Verbreitung von Außenkante ventrikuläre Zone (VZ)-wie Struktur (zweite Zeile); KIRREL2, eine Markierung zugeordneten zerebelläre Neuroepithelium (dritte Reihe, links); und ZIC1 eine Markierung im Zusammenhang mit zerebelläre Granulat-Zellen (dritte Zeile, rechts). Das Experiment wurde durchgeführt, mehrere Male mit verschiedenen hPSC vierzeilig: hESC Linie H01 (n = 5), und iPSC Linien hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), und hvs51 (n = 1). Pfeile zeigen auf rhombischen Lippe (RL)-wie Struktur. Maßstabsleiste = 100 µm. Diese Zahl ist von Holmes und Heine10neu aufgelegt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Abbildung 6: groß angelegte ventrikuläre Zone-artige Struktur in 3D Produkt. Bei Kultur d35 ist ein Aggregat hESC abgeleitet positiv für PAX6 (grün) und TBR2 (rot) häufig im Zusammenhang mit frühen Neuronen gefunden in ventrikuläre Zonen (VZs) und subventricular Zonen (SVZs) in Vivo. (Oben) Ein Sternchen (*) markiert die apikale Seite einer VZ-ähnliche Region laufen entlang der Kante des Aggregats, mit Klammern zeigt Tiefe/Aufteilung der VZ / SVZs. (Mitte) zusammengeführten Signale zeigen zerstreuten Abschnitte von PAX6 + / TBR2-Zellen immer größer in Richtung der oberen rechten Ende der VZ. (Unten) Höhere Vergrößerung Bild des Abschnitts durch ein Rechteck in der mittleren Spalte angezeigt. Maßstabsleiste = 100 µm. Diese Zahl wurde von Holmes und Heine10geändert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Abbildung 7: ICC 2D Produktbilder zeigen relevante Marker. Bei Kultur d35, 2D Produkte Ausstellung von Zellkulturen (obere Reihe) und HiPSCs (untere Zeile), positiv für Zellen: Granulat Zellmarkierung ZIC1 und wandernden zerebelläre Neuron Marker TAG1 (linke Spalte); und neuronale Marker Neurofilamente (NF) und TAG1 (rechte Spalte). Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Abbildung 8: RT-PCR von 2D Produkten. mRNA Expressionsanalyse hESC Linie H01 (obere Reihe) und HiPSC Linie hvs60 (untere Zeile) am Ende der 2D Protokoll zeigt Produkte mit Gelelektrophorese für: Granulat Zellmarkierung ZIC1, Granulat Zellmarkierung ATOH1, wandernde zerebelläre Neuron Marker TAG1, Purkinje Zellmarkierung Calbindin (CALB), spannungsabhängige Calcium-Kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), Gamma - Aminobuttersäure (GABA)-B-Rezeptor 1 (G-Br1) und Hauswirtschaft gen EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Abbildung 9: Kalzium Imaging/Analyse der 2D Produkte. Bei Kultur d35 verzeichneten hPSC Differenzierung Produkte für 2 min unter dem Mikroskop nach Inkubation mit fluor5 Farbstoff. 30 s, Zellen wurden elektrisch angeregt, für 10 s bei 10 Hz. (A) Standbilder anzeigen hESC bei 0 s (links) und nach dem Beginn der elektrischen Stimulation um 30 s (rechts). Pfeile zeigen Region of Interest (ROI) für die Analyse von Kalzium Zustrom. (B) grafische Auswertung zeigt Veränderung der relativen Fluoreszenz im Vergleich zur Zeit für ROI (Änderung der Fluoreszenz = (F-F0) / f0, wo F0 = (∑F1-n) / n), mit Neuron-wie Spikes vor, während und nach dem Auftritt die Stimulation. Schwarzer Balken gibt die Länge der elektrischen Stimulation. Skala bar (weiß) = 50 µm. vollständige Aufnahme hESC (wie hier zu sehen) und eine HiPSC Linie (nicht dargestellt) sind erhältlich in den ergänzenden Video 1 und ergänzende Video 2, beziehungsweise. Aufnahmen werden im AVI-Format, mit 4 X Geschwindigkeit. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Video 1: Kalzium imaging-Video von 2D Produkt aus hESC-Linie H01. Bei Kultur d35 färben Differenzierung Produkte hESC Linie H01 verzeichneten für 2 min unter dem Mikroskop nach Inkubation mit fluor5. 30 s, Zellen wurden elektrisch angeregt, für 10 s bei 10 Hz. Aufnahmen wurden auf 2 Bilder/s und verarbeitet in AVI-Video bei ~ 7 Bilder/s, produzieren eine Video dauert ~ 30 s, ~ 4 X Geschwindigkeit. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Video 2: Kalzium imaging-Video von 2D Produkt aus HiPSC Linie hvs51. Bei Kultur d35 verzeichneten Differenzierung Produkte aus HiPSC Linie hvs51 für 2 min unter dem Mikroskop nach Inkubation mit fluor5 Farbstoff. 30 s, Zellen wurden elektrisch angeregt, für 10 s bei 10 Hz. Aufnahmen wurden auf 2 Bilder/s und verarbeitet in AVI-Video bei ~ 7 Bilder/s, produzieren eine Video dauert ~ 30 s, ~ 4 X Geschwindigkeit. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Wir beschreiben eine vereinfachte 3D Differenzierung Protokoll für hPSCs, mit definierten Medium und Wachstumsfaktoren, geeignet zur Erzeugung Zelle Aggregate mit frühen neuroepithelialer Strukturen und positiv für zerebelläre-assoziierten Marker, sowie eine optionale reduziert 2D Modifikation zur Differenzierung von Zellen als eine Monolage, funktionelle Neuronen zu generieren.

Optimierte 3D zerebelläre Differenzierung Protokoll mit Optional 2D Modifikation

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Das übergeordnete Ziel dieser Differenzierungskulturen ist es, Kleinhirnzelllinien in 2D- oder 3D-Umgebungen zu erzeugen. Diese Methoden können helfen, grundlegende Fragen zu neuen Entwicklungen oder Krankheitsmechanismen, die kindlichen Hirnerkrankungen zugrunde liegen, anhand von Stammzellen von Patienten zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache Inbetriebnahme und Wartung mit wenigen Faktoren ermöglicht und als Basis für das Testen komplexerer neuronaler Protokolle verwendet werden kann. Das Verfahren wird von Lisa, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Um die Differenzierung mit der modifizierten Methode G-Methode der Passage von hPSCs zu etablieren, wird das erforderliche Volumen des neuronalen Erhaltungsmediums in ein steriles Röhrchen überführt und mit 4 Nanogramm pro Milliliter FGF2 und zehn mikromolaren Gesteinsinhibitoren ergänzt. Halten Sie dann das mittlere Rohr bei Raumtemperatur oder im Wasserbad bei 37 °C

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Kleinhirndissektion und Schnittpräparation: Eine Methode zur Erzeugung von Gewebeschnitten aus Kleinhirn der Maus

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Optimierte 3D zerebelläre Differenzierung Protokoll mit Optional 2D Modifikation

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