Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Nützlichkeit eines transgenen Mausmodells zu veranschaulichen, das die induzierbare und gezielte Expression eines fluoreszenzmarkierten EGFP-Caches, zweier Peptide in vivo und die daraus resultierende Störung endogener Bindungskomplexe ermöglicht. In diesem Experiment wird die Expression von fluoreszenzmarkierten Cache zwei auf zerebelläre Perkin-Zellen ausgerichtet. Dieser genetische Ansatz kann Schlüsselfragen über die Rolle von Verbindungskomplexen bei der Positionierung des Kerns in den meisten verschiedenen Geweben beantworten.

Die induzierbare und gezielte Expression von E-G-F-P-K two hat mehrere Vorteile. Erstens ist ein einziges Zuchtschema von Kaimäusen mit einem vorhandenen Kreuzfahrtstamm erforderlich. Zweitens umgeht dieser Ansatz die perinatale Alität, die in Mausmodellen für Keimbahnmutationen von Link-Komplex-Komponenten beobachtet wurde.

Schließlich ermöglicht diese Methode, die Physiologie von Verbindungskomplexen innerhalb bestimmter Zellen oder Gewebe zu untersuchen. Im lebenden Organismus. Chloe Potter, ein Mitglied des Labors, zeigt Ihnen die verschiedenen Schritte, die erforderlich sind, um E-G-F-P-K zwei in zerebellären Burkin-G-Zellen sichtbar zu machen.

Um zu beginnen, züchten Sie Clac-Z-Mäuse mit PCP zwei CRE-Mäuse, um PCP zwei CAG C und zwei Mäuse zu produzieren, wie in früheren Veröffentlichungen beschrieben. Wenn die daraus resultierenden Welpen geboren werden, führen Sie eine Genotypisierung durch. Um diejenigen zu identifizieren, die sowohl EGFP- als auch Cree-Transgene beherbergen, wie zuvor beschrieben, 50 Milliliter einer 30%igen Saccharoselösung in PBS vorbereiten und bis zum Tag der Gewebeentnahme im entsprechenden Alter bei minus 20 Grad Celsius lagern, eine Trans-Kardioperfusion der Mäuse unter Narkose durchführen, um das Hirngewebe für die Dissektion vorzubereiten, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, Legen Sie das präparierte Gehirn in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturplatte mit 10 Millilitern PBS und trennen Sie das Kleinhirn vom Kleinhirn.

Anschließend wird das Kleinhirn mit einem Skalpell in der Sagittalebene zerlegt und die Schnitte in 30%ige Saccharoselösung überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert. Bereiten Sie eine Aufschlämmung aus Trockeneis und zwei Methylbutan vor. Lassen Sie die Temperatur des Bades fünf Minuten lang ausgleichen.

Füllen Sie anschließend eine Kryoform mit OCT-Masse und legen Sie eine Hälfte des präparierten Kleinhirns mit einem Präpariermikroskop und einer Pinzette in die Form. Positioniere das Kleinhirn so, dass die bi-präparierte Oberfläche, die sich in der Nähe der Mittellinie des Kleinhirns befindet, in der Form nach oben zeigt. Übertragen Sie dann die Kryoform für fünf Minuten in die Aufschlämmung des trockenen Auges, bis die OCT-Verbindung eine feste weiße Matrix um die Gewebeprobe gebildet hat.

Lagern Sie die eingebettete Probe bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Beschriften Sie vorbehandelte Polylysin-Objektträger für die Entnahme von Gewebeschnitten und montieren Sie den Block aus Kleinhirngewebe mit frischem OCT auf den Gewebehalter. Sobald der Block fest befestigt ist, montieren Sie den Gewebehalter und rasieren Sie 40-Mikrometer-Scheiben, um überschüssige OCT zu entfernen, bis das Gewebe erreicht ist.

Stellen Sie die Dicke auf 15 Mikrometer ein und sammeln Sie die Abschnitte, indem Sie den OCT-Abschnitt vorsichtig mit der Polylysin-beschichteten Seite des Objektträgers in Kontakt bringen. Lagern Sie die Gewebeschnitte bei minus 20 Grad Celsius, bis Sie mit der Färbung und Bildgebung fortfahren. Wenn Sie fortfahren möchten, tauen Sie die Kleinhirnabschnitte im Dunkeln auf, um ein Verblassen der fluoreszierenden Proteine zu verhindern.

Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift ein Rechteck um den Umfang der Gewebeabschnitte. Geben Sie etwa 500 Mikroliter 4%-Paraform-Aldehyd für fünf Minuten in die Schnitte, um das Gewebe zu fixieren. Verwenden Sie dann ein Vakuum, um das Fixiermittel abzusaugen, wobei Sie besonders darauf achten sollten, die Gewebeschnitte nicht mit einer Pipette zu stören.

Tragen Sie PBS vorsichtig auf den Objektträger auf, ohne die Gewebeschnitte zu stören. Verwenden Sie nach fünf Minuten die Vakuumpipette, um die Flüssigkeit vorsichtig zu entfernen, wiederholen Sie die PBS-Spülung insgesamt dreimal. Geben Sie dann etwa 500 Mikroliter Blocklösung zu den Objektträgern und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang.

Entfernen Sie die Blockierungslösung und ersetzen Sie sie durch dieselbe Lösung, die eine bis 300 Verdünnungen von entweder Cal-Bindungs- oder Nesin-Antikörpern enthält. Entfernen Sie dann die Antikörperlösung und spülen Sie die Objektträger mit PB S3 Mal aus. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Bereiten Sie als nächstes eine bis 1000 Verdünnung von Anti-US-Röntgenobjektträgern Alexa Boden 5 94 für die mit Kuhbindung beschrifteten Objektträger und Anti-Alexa Fluor 5 94 für die beiden beschrifteten Objektträger von Nesprin in der Blockierungslösung vor und lagern Sie die Lösungen im Dunkeln, bis sie benötigt werden. Entfernen Sie vorsichtig die abschließende PBS-Spülung und bedecken Sie die Abschnitte eine Stunde lang im Dunkeln mit den verdünnten Sekundärantikörpern. Entfernen Sie nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung.

Tragen Sie dann fünf Minuten lang eine Kernfärbung wie DPI bei 300 Nanomolar in PBS auf. Spülen Sie die Abschnitte anschließend noch zweimal in PBS aus. Entfernen Sie so viel PBS-Lösung wie möglich und bedecken Sie den Gewebeschnitt mit einem Tropfen Einbettmedium.

Legen Sie eine Glasabdeckung auf den Gewebeabschnitt, vermeiden Sie Luftblasen und stellen Sie sie 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln beiseite. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop, um die Antikörperfärbung und die fluoreszierenden Proteine zu visualisieren. Verwenden Sie für Kleinhirnschnitte entweder ein 20 x oder 40 x Objektiv.

Um die beiden nuklearen Ränder E-G-F-P-C wie hier gezeigt zu betrachten, kann E-G-F-P-C zwei direkt in Kleinhirnschnitten im Fitzy-Kanal visualisiert werden. Darüber hinaus bestätigt die Kolokalisation von EGFP mit der Kuhbindung, die spezifisch Perkin-Zellen markiert, dass die E-G-F-P-C two-Expression auf Perkin-Zellen in Perkin-Zellen beschränkt ist. EGFP-Cache zwei ist auf die Kernhülle ausgerichtet, wie EGFP-positive RIM-ähnliche Muster zeigen, die um den Kern herum beobachtet werden.

In diesem Beispiel wurde die EGFP-Cache-2-Expression in mehr als 70% der Kuh-Bindungs-positiven Perkin-Zellen nachgewiesen. EGFP-Cache zwei verdrängt endogenes Nesprin aus der Kernhülle durch die Sättigung der verfügbaren Sonnendomänen. Dementsprechend wird endogenes NESIN zwei aus der Kernhülle von Perkin-Zellen verdrängt, die EGFP-Cache zwei exprimieren.

Während Perkin-Zellen, die E-G-F-P-C zwei nicht exprimieren, endogenes Nesin zwei an der Kernhülle wie erwartet behalten, zeigen Kontrollinterate, die keine CRE-Rekombinase exprimieren, NESIN zwei an der Kernhülle der gesamten Bikinizellpopulation Eins. CT-Blöcke von Geweben stehen also zur Verfügung. E-G-F-P-K two kann in etwa vier Stunden visualisiert werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Ausmaß der PFF-Fixierung und/oder der Einbettungsbedingungen die Antigenität Ihres Epitops drastisch beeinflussen kann. Es ist daher sehr wichtig, die optimalen Fixierungsbedingungen zu bestimmen, die Ihr spezifisches Epitop erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das CK-Modell mit zwei transgenen Mäusen verwenden können, um die Expression von VGFP-Cashewnüssen in bestimmten Geweben zu steuern.