Name: Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Validierung eines transgenen Mausmodells zur induzierbaren Störung von LINC-Komplexen in zellspezifischen Geweben. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in die Kernpositionierung.

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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Morphologie und Imaging-Kern, der Molekulargenetik Kern (Abteilung für Augenheilkunde und Visual Sciences) und der Mausgenetik Kern an der Washington University in St. Louis School of Medicine. Die Autoren werden von der kleinen Zuschuss-Programm von der McDonnell Zentrum für Zelluläre und Molekulare Neurobiologie, der Hoffnung Zentrum für Neurologische Störungen unterstützt das National Eye Institute (# R01EY022632 zu DH), ein National Eye Institute zentralen Kern Grant (# P30EY002687) und eine zweckgebundene Zuwendung der Forschung, um Blindheit zu der Augenklinik und Visual Sciences verhindern.

Ethics Statement: Verfahren, die Tierversuchspersonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Washington University in St. Louis genehmigt. 1. Mauszucht und Genotypisierung <ol><li> Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäusen, die mit Tg (PCP2-Cre) Mäuse Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 zu erzeugen. Anmerkung: Während der Rest dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung der Tg (PCP2-Cre) Mauslinie zu EGFP-KASH2 Ausdruck Purkinje Zellen innerhalb des Kleinhirns zu beschränken, kann ein ähnliches Verfahren mit einer anderen Tg (Cre) Maus verfolgt werden ( Abbildung 2a). </li><li> Führen Genotypisierung um Welpen beherbergen beide EGFP und Cre-Transgene, wie zuvor beschrieben 19 zu identifizieren. </li></ol> 2. Vorbereitung der Materialien für die Präparation und Gewebeentnahme <ol><li> Bereiten Sie 100 ml 30% Saccharose in PBS (30 g Saccharose / 100 ml 1x PBS) und bei -20 ° C. Der Tag der Gewebe hie Ernte, Tauwetter und Last ~ 30-35 ml Saccharose-Lösung in einen 35-ml-Spritze für transkardialer Infusionen. </li><li> Vorbereitung 40 ml von 4% PFA in PBS (10 ml 16% igem Paraformaldehyd und 30 ml PBS). Last ~ 30-35 ml 4% PFA in eine 35 ml-Spritze zur transkardialer Perfusionen. </li><li> Füllen Sie einen 10 cm-Gewebekulturplatte mit 10 ml PBS für Gewebedissektion. </li><li> Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin-Cocktail, bestehend aus 16 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin. </li><li> Eine Lösung aus 70% Ethanol für die Präparation. </li></ol> 3. Dissection und Gewebeentnahme <ol><li> Unter Verwendung einer 1 ml Spritze injizieren 500 ul des Ketamin / Xylazin Cocktail pro 25 Gramm Körpergewicht, und warten Sie ca. 15 min. Alternativ verwenden Sie einen anderen institutionell genehmigten Sedierung Methode, die für das biologische System von Interesse geeignet ist. </li><li> Nach Sedierung, sanft Prise die Hinterpfote, den Mangel an Schmerzreaktion zu bestätigen, stecken alle Pfoten auf einem Styropor-Fach mit der Rückenseite desMaus nach unten. </li><li> Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und einen Einschnitt von den Unterbauch an die Spitze des Brustkorbs, um Zugang zum Herzen zu gewinnen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens und legen Sie die Spritze mit der 30% igen Zuckerlösung in den linken Ventrikel des Herzens. </li><li> Perfusion der Lösung bei einer Rate von ~ 2-5 ml pro min. Wenn leer, entfernen Sie die Spritze und wiederholen Sie mit der 4% PFA-Lösung. </li><li> Unpin die Maus vom Styroporbehälter und zu enthaupten, um das Gehirn zu gelangen. </li><li> Entfernen Sie die Haut um den Kopf des Tieres mit einer Pinzette und Schere. Poke ein Loch in den hinteren Teil des Schädels mit einer Nadel und entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit Schere und Pinzette. </li><li> Sobald das Gehirn ist eindeutig erreichbar, verwenden Pinzette, um das Kleinhirn zu entfernen und legen Sie sie in PBS. Halbieren das Kleinhirn in der Sagittalebene mit einem Skalpell und übertragen, die 30% Saccharose-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Um prepsind Paraffinschnitten, beheben das Kleinhirn über Nacht bei 4 ° C in 4% PFA vor Gewebeeinbettung und Schnitte. </li></ol> 4. Gewebeverarbeitung und Schnitte <ol><li> Bereiten einer Aufschlämmung aus Trockeneis und 2-Methylbutan. Dass die Temperatur des Bades während 5 min sich ausgleichen lassen. </li><li> Füllen Sie eine cryomold mit OCT-Verbindung und legen Sie eine Hälfte des zweigeteilten Kleinhirn in die Form. </li><li> Mit Hilfe eines Binokular und einer Pinzette Position das Kleinhirn, so dass der zweigeteilten Oberfläche (in der Nähe der Mittellinie des Kleinhirns) nach oben zeigt. </li><li> Übertragen Sie die cryomold auf die Trocken Eisbrei für 5 Minuten, bis der OCT-Verbindung hat eine solide weißen Matrix um die Gewebeprobe gebildet. Anmerkung: Die gefrorene Probe kann nun bei -20 ° C, wenn erforderlich, gespeichert. </li><li> Etikett vorbehandelt Polylysin Folien zum Sammeln von Gewebeschnitten und bereiten den Kryostaten gemß den Anweisungen des Herstellers, um 15 um Abschnitte des cere sammelnbellum. Um die Abschnitte zu sammeln, vorsichtig an den Oktober Abschnitt mit dem Poly-Lysin-beschichtete Seite der Folie. Um die Ausrichtung des Abschnitts zu erhalten, müssen Sie die Folie während dieses Schritts nicht drehen. </li><li> Shop Gewebeschnitte bei -20 ° C, bis mit der Färbung und Imaging fortfahren. </li></ol> 5. Die Färbung und Imaging von Kleinhirn Sections <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Gewebefärbung: ~ 50 ml PBS ~ 5-10 ml von 4% PFA in PBS ~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS </li><li> Thaw Kleinhirnschnitten. Wichtig ist, zu minimieren, ihre Exposition gegenüber einer beliebigen Quelle von kontinuierlichen und intensiven Licht, um Verblassen der EGFP verhindern. </li><li> Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift, ein Rechteck um den Gewebeschnitten. </li><li> Post-fix die Abschnitte mit 4% PFA für 5 min. Verwenden Sie ausreichend Flüssigkeit, um den gesamten Bereich von der hydrophobe Barriere (in der Regel ~ 500 ul) abgegrenzt decken. Mit Hilfe eines Vakuum oder Pipette wiederbewegen das Fixiermittel besonders achten, dass die Gewebeschnitte stören. </li><li> Mit einer Pipette vorsichtig anzuwenden PBS auf der Folie, ohne die Gewebeschnitte zu stören. Nach 5 min verwenden das Vakuum oder Pipette vorsichtig die Flüssigkeit. Wiederholen Sie die PBS spülen insgesamt dreimal. </li><li> Verwendung einer Pipette vorsichtig Die geeignete Verdünnung von primären Antikörpern (3 ul Calbindin und / oder Nesprin2 Antikörper pro 900 Mikroliter Lösung) in 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS gelten. Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anmerkung: EGFP-KASH2 wird durch direkte Fluoreszenz-Mikroskopie auf Gefrierschnitten sichtbar und es ist nicht notwendig, um eine Anti-EGFP-Antikörper zu verwenden. Wenn Paraffinschnitte wurden hergestellt, Imaging von EGFP-KASH2 erfordert jedoch Immunodetektion mit einem Anti-EGFP-Antikörper. </li><li> Entfernen Sie die Antikörperlösung und spülen Sie mit PBS dreimal. </li><li> Vorbereitung 1: 1000 Verdünnungen von Alexa-Fluor sekundären Antikörper in 0,5% Triton X-100,10% Eselserum in PBS und lagern in der Dunkelheit. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die endgültige PBS spülen und wenden Sie die Sekundärantikörperverdünnung für eine Stunde im Dunkeln. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung, spülen und waschen Sie den Abschnitt dreimal. Falls erforderlich, tragen Sie eine Kernfärbung, wie DAPI (~ 300 nM), während der ersten PBS-Anwendung. </li><li> Vollständig zu entfernen, die PBS-Lösung, um von der Gewebe und Ort ~ 5-7 &amp; mgr; l Montagetechnik auf dem Gewebeschnitt. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Gewebeschnitts und beiseite stellen für ~ 15-30 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit eingestellt. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtern ausgestattet, um EGFP und alle anderen für die Sekundärantikörper in den Schritten 5.8 / 5.9 verwendet geeigneten Wellenlängen zu visualisieren. In Kleinhirnscheiben, mit einem 20x-Objektiv an EGFP-KASH2 Kern Felgen anzuzeigen. </li></ol>

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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
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<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der wichtigste Schritt, um erfolgreich zu studieren die Rolle des LINC-Komplexe in vivo unter Verwendung der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Modell ist, um eine geeignete Cre Mauslinie (n) zu identifizieren. In der Tat, wenn Cre ist in anderen Zelltypen in ähnlicher Wegen beteiligt aktiv, es kann die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Daher ist es wichtig, in der Nähe von Zellen zu untersuchen, wie hier in der molekularen und Körnerzellschicht des Cerebellums (2B) dargestellt. Ebenso ist es, ...

Die Kernhülle (NE) trennt das Kernplasma aus dem Zytoplasma. Es besteht aus einem inneren und äußeren Kernmembran (INM und ONM, respectively), die an Kernporen verbinden zusammen. Das Lumen von beiden Membranen abgegrenzt wird als perinukleären Raum (PNS). Die ONM ist eine Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der INM haftet an der Lamina, um ein Maschenwerk des Typs V-Atom Intermediärfilamente von A- und B-Typ dargestellt Lamine 1,2. Linker der Nucleoskeleton und Zytoskelett (LINC) -Komplexe sind makromolekularer Komplexe, die die gesamte Kernhülle überspannen kann, um das Innere des Kerns physikalisch verbinden Zytoskelettfilamenten und molekularen Motoren (1A). Sie bestehen aus Wechselwirkungen zwischen evolutionär konservierte Motive, die zwei Familien von integralen Transmembranproteine ​​des NE charakterisieren: Sun (SAD1 / Unc84) Proteine ​​und Nesprine (Nuclear Envelope Spek). Bei Säugetieren Sun1 und Sun2 are Transmembranproteine ​​des INM, deren N-terminale nukleoplasmatischen Region interagiert direkt mit A- und B-Typ Lamine 3-5. Auf der anderen Seite des INM, im PNS, Hafen Sun Proteine ​​einen evolutionären konserviert Strecke von ~ 150 C-terminalen Aminosäuren genannt SUN-Domäne. SUN Domänen interagieren direkt mit dem evolutionären konserviert KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne Homologie) -Domäne, die molekulare Signatur der Nesprine. KASH Domänen bestehen aus einer Strecke von ca. 30 C-terminalen Aminosäuren, die in die PNS, gefolgt von einer Transmembran-Domäne 6 ragt. Mindestens vier verschiedene Nesprin Gene (Nesprin1-4) kodieren KASH haltige Proteine, die an der NE 7 lokalisieren. Die zytoplasmatischen Regionen Nesprine, deren Größen variieren von ~ 50 kDa (Nesprin4) zu einer erstaunlichen 1.000 kDa (Nesprin1 giant) enthalten mehrere Spektrin wiederholt sowie spezifische Motive, damit ihre Wechselwirkung mit Zytoskelett-Komponenten, wie beispielsweise Actin, plectin und molekularen Motoren 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Studium in Wirbeltieren und wirbellosen Tieren haben gezeigt, dass Lamin / Sun / Nesprin / molekulare Motoren stellen eine evolutionär konservierte &quot;Achse&quot; Steuerung Kern Migration und Verankerung. Einige Knock-out (KO) Maus-Modellen der LINC komplexe Bauteile wurden beschrieben und waren maßgeblich an der Schaffung eines Rahmens, um die Rolle von Sun und Nesprin Proteine ​​an der NE während der Entwicklung von Säugetieren 9,14,15 zu verstehen. Allerdings sind diese Modelle weisen mehrere signifikante Nachteile auf, insbesondere: 1) Schwierigkeiten bei der Interpretation Phänotypen aufgrund der nicht autonomen Effekte, 2) Schwierigkeiten bei der Unterscheidung der phänotypischen Beitrag von Zell KASH haltigen vs. KASH losen Nesprin Isoformen 16, 3) die funktionelle Redundanz von Sonne und Nesprin Proteine ​​an der NE in zahlreichen Zelltypen erfordert komplexe Zuchtprogramme, alle SUN-KASH Wechselwirkungen bei Mäusen 17 und 4) die perinatale Sterblichkeit von Mäusen mangelhaft für die KASH-Domäne sowohl inaktivierenNesprins1 und 2 schließt die Analyse der Erwachsenen Phänotypen 18. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Mausmodell entwickelt, um alle SUN-KASH Wechselwirkungen in vivo stören, in einer Zelle autonom und entwicklungsregulierter Weise umgehen somit viele der oben beschriebenen Nachteile. Diese Cre / lox-basierten Mäusemodell beruht auf zwei wichtige Konzepte: 1) die KASH Domäne von irgendeinem bekannten Nesprin Protein ausreicht, um EGFP auf die NE in Zellkultursystemen Ziel und 2) Sonnendomänen interagieren promiscuously mit KASH Bereichen, wodurch eine Überexpression von beliebige KASH Domäne werden alle endogenen SUN Domänen zu sättigen und zu inaktivieren LINC-Komplexe in einer dominant-negative Art und Weise 17 (1B). Dieses Protokoll beschreibt Gewebe Ernte- und Verarbeitungsschritte verwendet werden, um die Störung aller SUN-KASH Wechselwirkungen im Kleinhirn-Purkinje-Zellen bestätigen.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Adhäsion Objektträger</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antikörper</td><td></td><td></td><td>Zuvor beschrieben in Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Montage Medien</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validierung eines maus-modell zu linc komplexe disrupt in einem zellspezifisch

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Die nukleare Migration und Verankerung in sich entwickelnden und adulten Geweben hängt stark von großen makromolekularen Proteinanordnungen ab, die als LInkers des Nukleoskeletts und des Zytoskeletts (LINC-Komplexe) bezeichnet werden. Diese Proteingerüste überspannen die Kernhülle und verbinden das Innere des Zellkerns mit Komponenten des umgebenden zytoplasmatischen Zytoskeletts. LINC-Komplexe bestehen aus zwei evolutionär konservierten Proteinfamilien, Sun-Proteinen und Nesprinen, die C-terminale molekulare Signaturmotive beherbergen, die als SUN- bzw. KASH-Domänen bezeichnet werden. Sonnenproteine sind Transmembranproteine der inneren Kernmembran, deren N-terminale nukleoplasmatische Domäne mit der Kernlamina interagiert, während ihre C-terminalen SUN-Domänen in den perinukleären Raum hineinragen und mit der Kash-Domäne von Nesprins interagieren. Kanonische Nesprin-Isoformen haben einen N-Terminus unterschiedlicher Größe, der in das Zytoplasma projiziert und mit Komponenten des Zytoskeletts interagiert. Dieses Protokoll beschreibt die Validierung einer dominant-negativen transgenen Mausstrategie, die endogene SUN/KASH-Interaktionen auf zelltypspezifische Weise stört. Unser Ansatz basiert auf dem Cre/Lox-System, das viele Nachteile wie perinatale Letalität und zellnicht-autonome Phänotypen umgeht, die mit Keimbahnmodellen der LINC-Komplexinaktivierung assoziiert sind. Aus diesem Grund bietet dieses Modell ein nützliches Werkzeug, um die Rolle von LINC-Komplexen während der Entwicklung und Homöostase in einer Vielzahl von Geweben zu verstehen.

Dieses Protokoll zeigt die Nützlichkeit der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell EGFP-KASH2 Ausdruck cerebellar Purkinje-Zellen unter Verwendung Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu beschränken. Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Sekundärteilchen, die LacZ / V5 offenen Leserahmen an P6 durch die Rekombinase Cre, wodurch die Expression von EGFP-KASH2 spezifisch an Purkinje-Zellen (2A) gezielt führenden geschnitten. Wie erwartet, ist EGFP-KASH2 zur Kernhülle richtet, wie durch die um den Kern (2B)</stro...

Kernige Hüllproteine spielen eine zentrale Rolle in vielen grundlegenden biologischen Prozessen und wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Cre/Lox-basiertes Mausmodell, das die räumlich-zeitliche Kontrolle der Störung von LINC-Komplexen ermöglicht.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Nützlichkeit eines transgenen Mausmodells zu veranschaulichen, das die induzierbare und gezielte Expression eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten EGFP-Cache-two-Peptids in vivo sowie die daraus resultierende Störung endogener Linker-Komplexe ermöglicht. In diesem Experiment wird die Expression des fluoreszenzmarkierten Cache two geziilt auf die Purkinje-Zellen des Kleinhirns ausgerichtet. Dieser genetische Ansatz kann zentrale Fragen zur Rolle der Linker-Komplexe bei der Kernpositionierung in verschiedenen Geweben beantworten.Die induzierbare und gezielte Expression von E-G-F-P-K zwei bietet mehrere Vorteile. Erstens erfordert sie ein einziges Zuchtverfahren von Cay-Mäusen mit jeder vorhandenen Cruise-Stamm. Zweitens umgeht dieser Ansatz die perinatale Letalität, die bei Mausmodellen mit Keimbahnmutationen von Komponenten des Link-Komplexes beobachtet wird.Schließlich ermöglicht diese Methode die Untersuchung der Physiologie von Link-Komplexen in spezifischen Zellen oder Geweben in vivo. Chloe Potter, ein Mitglied des Labors, wird Ihnen die verschiedenen Schritte zeigen, die erforderlich sind, um E-G-F-P-K zwei in zerebellären Burkin-G-Zellen sichtbar zu machen.Beginnen Sie damit, Z-Mäuse mit PCP zwei CRE-Mäusen zu züchten, um PCP zwei CAG C zwei-Mäuse zu erhalten, wie in früheren Veröffentlichungen beschrieben. Führen Sie nach der Geburt der resultierenden Welpen eine Genotypisierung durch. Um jene Tiere zu identifizieren, die sowohl das EGFP- als auch das Cree-Transgen tragen, wie zuvor beschrieben, bereiten Sie 50 Milliliter einer 30 %igen Saccharoselösung in PBS vor und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius, bis zum Tag der Gewebeentnahme im geeigneten Alter. Führen Sie eine transkardiale Perfusion der Mäuse unter Anästhesie durch, um das Hirngewebe gemäß dem schriftlichen Protokoll für die Dissektion vorzubereiten. Legen Sie das dissezierte Gehirn in eine 10 cm große Zellkulturplatte mit 10 Milliliter PBS und trennen Sie das Kleinhirn vom Großhirn.Als Nächstes das Kleinhirn mit einem Skalpell in sagittaler Ebene dissezieren und die Schnitte in eine 30%ige Saccharoslösung überführen, die dann über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert wird. Eine Suspension aus Trockeneis und zwei Methylbutan herstellen. Die Temperatur des Bades fünf Minuten lang ausgleichen lassen.Füllen Sie als Nächstes eine Kryoschablone mit OCT-Verbindung und legen Sie eine Hälfte des dissezierten Kleinhirns unter Verwendung eines Stereomikroskops und einer Pinzette in die Schablone. Positionieren Sie das Kleinhirn so, dass die dissezierte Oberfläche, die nahe der Mittellinie des Kleinhirns liegt, in der Schablone nach oben weist. Anschließend überführen Sie die Kryoschablone für fünf Minuten in die Trockeneisschlämme, bis die OCT-Verbindung eine feste, weiße Matrix um die Gewebeprobe gebildet hat.Bewahren Sie die eingebettete Probe bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie benötigt wird. Beschriften Sie vorbehandelte Polylysin-Objektträger zur Sammlung von Gewebeschnitten und befestigen Sie den Block aus Kleinhirngewebe mit frischem OCT auf dem Gewebeträger. Sobald der Block fest angebracht ist, montieren Sie den Gewebeträger und schneiden Sie 40 Mikrometer dicke Scheiben ab, um überschüssiges OCT zu entfernen, bis das Gewebe erreicht ist.Stellen Sie die Dicke auf 15 Mikrometer ein und sammeln Sie die Schnitte, indem Sie den OCT-Schnitt vorsichtig mit der mit Polylysin beschichteten Seite des Objektträgers in Kontakt bringen. Bewahren Sie die Gewebeschnitte bei minus 20 Grad Celsius auf, bis die Färbung und Bildgebung durchgeführt werden. Wenn Sie fortfahren möchten, tauen Sie die zerebellären Schnitte im Dunkeln auf, um ein Verblassen der fluoreszierenden Proteine zu verhindern.Umranden Sie mit einem hydrophoben Barrierestift ein Rechteck um den Rand der Gewebeschnitte. Geben Sie etwa 500 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd zu den Schnitten, um das Gewebe fünf Minuten lang nachzuixieren. Anschließend aspirieren Sie das Fixativ vorsichtig unter Verwendung eines Vakuums, wobei Sie besonders darauf achten sollten, die Gewebeschnitte nicht mit einer Pipette zu stören.Tragen Sie PBS vorsichtig auf den Objektträger auf, ohne die Gewebeschnitte zu stören. Nach fünf Minuten entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einer Vakuumpipette und wiederholen die PBS-Spülung insgesamt dreimal. Geben Sie anschließend etwa 500 Mikroliter Blockierungslösung auf die Objektträger und inkubieren Sie diese 10 Minuten lang.Entfernen und ersetzen Sie die Blockierungslösung durch dieselbe Lösung, die Verdünnungen von eins zu 300 der Cal-Bindungs- oder Nesin-Zwei-Antikörper enthält. Entfernen Sie dann die Antikörperlösung und spülen Sie die Objektträger dreimal mit PBS. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.Bereiten Sie anschließend eine Verdünnung von 1 zu 1000 von Anti-US Alexa floor 5 94 für die mit Cow-Bindung markierten Objektträger und von Anti-Alexa Fluor 5 94 für die mit Nesprin zwei markierten Objektträger in der Blockierungslösung vor und lagern Sie die Lösungen bis zur Verwendung lichtgeschützt. Entfernen Sie vorsichtig die letzte PBS-Spülung und überdecken Sie die Schnitte mit den verdünnten sekundären Antikörpern für eine Stunde im Dunkeln. Nach der Inkubation entfernen Sie die Lösung mit den sekundären Antikörpern.Danach für fünf Minuten einen Kernfärbefarbstoff wie DPI in einer Konzentration von 300 Nanomolar in PBS auftragen. Anschließend die Schnitte zweimal erneut in PBS spülen. So viel PBS-Lösung wie möglich entfernen und den Gewebeschnitt mit einem Tropfen Eindeckmedium bedecken.Legen Sie einen Glasdeckel auf den Gewebeschnitt, wobei Luftblasen vermieden werden sollen, und lassen Sie ihn 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln ruhen. Anschließend visualisieren Sie die Antikörperfärbung und fluoreszierenden Proteine mittels eines Fluoreszenzmikroskops. Für Cerebellarschnitte verwenden Sie entweder ein 20x- oder ein 40x-Objektiv.Um die beiden E-G-F-P-C-Kernmembranen wie hier gezeigt zu betrachten, können die E-G-F-P-C-Zwei direkt in Kleinhirnschnitten im Fitzy-Kanal sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus bestätigt die Kolokalisation von EGFP mit Cow-Bindung, die spezifisch Perkin-Zellen markiert, dass die Expression von E-G-F-P-C zwei auf Perkin-Zellen innerhalb der Perkin-Zellen beschränkt ist. EGFP-Cache-Zwei wird an die nukleare Hülle geleitet, wie durch EGFP-positive, rimartigen Muster rund um den Zellkern angezeigt.In diesem Beispiel wurde die Expression von EGFP cache zwei in mehr als 70 % der Cow-bindenden, positiven Perkin-Zellen nachgewiesen. EGFP cache zwei verdrängt endogenen Nesprin aus der nuklearen Hülle durch Sättigung der verfügbaren Sun-Domänen. Entsprechend wird endogenes NESIN zwei aus der nuklearen Hülle von Perkin-Zellen verdrängt, die EGFP cache zwei exprimieren.Während Perkin-Zellen, die E-G-F-P-C zwei nicht exprimieren, wie erwartet endogenes Nesin zwei an der nuklearen Membran als Kontrollinterat aufrechterhalten, zeigen Zellen, die keine CRE-Rekombinase exprimieren, Nesin zwei an der nuklearen Membran der gesamten Bikini-Zellpopulation Eins. Somit sind CT-Blöcke von Geweben verfügbar. E-G-F-P-K zwei kann in etwa vier Stunden sichtbar gemacht werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass das Ausmaß der PFF-Fixierung und/oder die Bedingungen der Einbettung die Antigenität Ihres Epitops erheblich beeinträchtigen können. Daher ist es äußerst wichtig, die optimalen Fixierungsbedingungen zu ermitteln, die Ihr spezifisches Epitop erhalten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das CK-zwei-transgene Mausmodell verwenden können, um die Expression von VGFP-Cashew gezielt in bestimmten Geweben zu steuern.

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

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Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

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Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

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Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

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Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Erfahren Sie die Validierung eines transgenen Mausmodells zur induzierbaren Störung von LINC-Komplexen in zellspezifischen Geweben. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in die Kernpositionierung.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

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