Name: Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung von Makrophagen-extrazellulären Fallen mit konfokaler Mikroskopie in Lungenproben. Diese Methode ermöglicht Forschern die Untersuchung immunologischer Reaktionen und Entzündungsprozesse.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Monash University, National Health und Medical Research Council und der Monash Lungen- und Schlaf Institut finanziert. Die Autoren möchten die Mitarbeiter der klinischen Immunologie an der Monash Gesundheit, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass und Camden Lo der Monash Micro Imaging (MMI) für Hilfe mit der konfokalen Mikroskopie imaging danken, und die Autoren erkennen die MMI-Einrichtungen der Monash University. Die Autoren erkennen die Einrichtungen und die wissenschaftliche und technische Unterstützung der Monash Histologie Plattform.

dieses Protokoll folgt Experimente in zugelassen: (1) Menschen von der Ethik Komitee der Monash Medical Center und (2) Tiere, die von der Ethikkommission der Universität Melbourne.
 1. alvéolaire Lavage (BAL) Makrophagen <ol><li>Verwendung BAL Lung Makrophagen in zu erhalten: (1) menschliche Themen durch Bronchoskopie 6 und (2) Mäuse mit Intra-trachealen streben 13 . 
	Hinweis: Erwerb von den Makrophagen führt in der Regel einige Aktivierung dieser Zellen. Makrophagen stammen aus Patienten, die erfordern eine Bronchoskopie, ein mögliches medizinisches Problem zu untersuchen und möglicherweise nicht alle Themen geeignet für die Analyse der METs (Dies müssen für jedes einzelne Projekt ermittelt werden).
	<ol><li>BAL Lösung und Spin-down (500 X g für 10 min.) in Form einer Tablette nehmen, waschen zweimal mit Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) mit fetalen Kälberserum 5 % und 1 % L-Glutamin) bei Raumtemperatur und verdünnen Sie Zellen in 4 mL Kultur medi Umm.</li>
		<li>Bei Bedarf anfordern eine formalen differenzielle Graf; die meisten Zellen (in der Regel &#62; 80 %) werden Makrophagen 6. 
		Hinweis: Dies wird in der Regel erfolgen durch einen klinischen Histologie-Service über die morphologische Darstellung der verschiedenen Zellen Typen 6.</li>
		<li>Führen eine tragfähige Makrophagen Zelle zählen auf die BAL-Lösung verwenden Trypan blau Ausgrenzung und ein Hemocytometer. 
		Hinweis: BAL Lösung ergibt sich aus Mensch und Maus wie unter Schritt 1.1.</li>
		<li>Add 1-4 x 10 5 Makrophagen zu 24-Well-Platten auf Deckgläsern in 500 µL Kulturmedium pro gut und lassen Sie über Nacht bei 37 ° C; die Zellen haften an den Deckgläsern. Fügen Sie für Humanproben, Antibiotika (z.B. Penicillin und Streptomycin, 10 4 U/mL), bakterielle Kontamination zu verhindern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunfluoreszenz Beschriftung/Mikroskopie von Makrophagen BAL Hinweis: Zellen auf Deckgläsern eingehalten werden, wie oben erwähnt.
<ol><li>Das Kulturmedium zu entfernen und waschen Sie die Zellen einmal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Beheben von Zellen in 2 % Paraformaldehyd/periodate/Lysin (PLP) Fixiermittel für 10 min.</li>
	<li>Zellen kurz in PBS waschen, und dann permeabilize in 0,2 % Tween 20 in PBS für 20 min.</li>
	<li>Block-Zellen mit 10 % Huhn Sera in 5 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt mit PBS-Puffer für 30 min.</li>
	<li>Inkubation mit Primär- und Isotype Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur in 1: 100-Konzentrationen (weitere Einzelheiten finden Sie in Tabelle of Materials) bei 37 ° c 
	Hinweis: Für die BAL-Proben, ein spezifische Marker von Makrophagen ist in der Regel nicht erforderlich.</li>
	<li>Nach der Zugabe von Primärantikörpern, waschen Sie die Zellen mit PBS-Puffer, und weiter mit der entsprechenden Sekundärantikörper für 40 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-basierte Eindeckmittel zur Visualisierung mit einem confocal Mikroskop (siehe oben) am Laser Erregungen 405, 488, 561 und 647 nm und 40 X, 1,0 NA Öl Ziel.</li>
</ol> 3. Lunge Gewebeproben Hinweis: für in Vivo Studien von Lungengewebe, studieren die Proben nach der entsprechenden Exposition (z. B., wie beschrieben durch O &#39; Sullivan Et Al. 7). die Belichtung, die am besten für dieses Experiment sind infektiöse Mikroorganismen, insbesondere Bakterien. Maus-Stämmen, die für diese Methode verwendet werden könnten sind C57BL/6 oder BALB/c Mäuse, 10-12 Wochen alt, Gewicht 25-30 g und männlich.
<ol><li>Einschläfern Mäuse, über eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (400 mg/kg) und Xylazin (40 mg/kg). Öffnen der Brusthöhle und aussetzen von Lunge und Herz mit chirurgischen Pinzetten und Scheren.
	<ol><li>Einflößen warm PBS mit einer 21-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel zum Auswaschen des Blutes aus den Gefäßen für 30 s, dann die Infusion 10 mL 2 % PLP Fixativ für 30 s (in den rechten Ventrikel).</li>
		<li>Verwenden um Lavage der offenen Brustraum warm PBS (42 ° C). Intubation der Trachea mit einer 21-Gauge-Nadel und ein Stück 0,8 mm Schlauch geschnitten, und 800 µL vorgewärmten (bis 42 ° C) zu injizieren, niedrigschmelzende 3 % Agarose-Lösung zeigen.</li>
		<li>Tie abseits die Luftröhre mit geflochtenen Seide (4.0 USP). Legen Sie den Faden um die Luftröhre, knapp unterhalb der Einfügemarke an die Stelle der Kanüle, und sichern Sie sie über eine einfache Überhandknoten. Um die Agarose erstarren, eiskaltem PBS um die Lunge zu verwalten. Entfernen Sie die Lungen und das Herz als einen Block von der Brusthöhle mit Schere und stumpfe Dissektion. Jede Lunge einzeln entfernen und dann beheben sie für 16 h in 2 % PLP oder Formalin bei 4 ° c</li>
		<li>Speichern die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C bis zum Gewebe zu schneiden. Diese Methoden für den Erhalt der Lungengewebe wurden zuvor beschriebenen 13.</li>
	</ol></li> <li>Zur Vorbereitung des Lungengewebes Beispiele verwenden die folgenden Schritte.
	<ol><li>Fix Lungengewebe Gewebe (reseziert im Schritt 3.1)-10 % natürlichen gepuffert Formalin für 24 h bei Raumtemperatur. Übertragen auf 75 % Ethanol und stellen in einem Gewebe-Prozessor auf einem 12 h Zyklus, (2,5 h in 75 % EtOH, 3 h in absolute EtOH, 3,5 h im Lösungsmittel 3 b und 3 h in Paraffin).</li>
		<li>Einbetten in standard Paraffin, Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Blöcke, die gespeichert sind bei Raumtemperatur zu schaffen. 
		Hinweis: In diesem Stadium ist es in der Regel zweckmäßig, die Lunge Querschnitte für standard Folien.</li>
		<li>Die Proteinkinase Lungen-Abschnitte bei 4-5 µm Dicke mit einem Mikrotom schneiden und montieren auf aufgeladen, beschichtete Folien wie oben beschrieben durch O &#39; Sullivan Et Al. 7</li> <li>, Folien zu montieren, 3 Tropfen Eindeckmittel auf Deckgläsern 60 mm x 24 mm (Größe 1,5), invertieren die Folie auf das Deckglas und push-out überschüssige Mittel. Hermetisch dichten mit Nagellack und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li></ol> 4. Vorbereitung/Mikroskopie von Gewebeproben Lunge <ol><li>de-einwachsen, rehydrieren und die Proteinkinase Lunge Gewebeprobe mit Antigen-Retrieval-Lösung vorbehandeln.
	<ol><li>Ofen trocken gleitet die Proteinkinase für 60 min bei 60 ° C. Dann legen Sie die Folien in Xylol Lösung für 30 min und den Transfer zu 70 % Ethanol Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Spülen in Leitungswasser.</li>
		<li>Ort in hitzebeständigen Folie eingeschweißt und unterliegt HIER-Antigen-Retrieval im Schnellkochtopf für 10 min in 10 m/Mol/L Tris, 1 Mmol/EDTA pH 9.0. Cool für 20 min. Waschen zweimal im Leitungswasser für 5 min auf einer Wippe, dann einmal mit PBS auf Rocker.</li>
		<li>Block mit 10 % Huhn Serum in 5 % BSA/PBS für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li> <li>Des Gewebes zu beflecken.
	<ol><li>, METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 1 % BSA/PBS 16 h bei 4 ° C in 1/100 Verdünnung (genauere Angaben zu Mengen Antikörper sind in Tabelle Materialien aufgeführt). Waschen zweimal mit PBS für 5 min auf einer Wippe.</li>
		<li>Erreichen-Fluoreszenz-Detektion durch Inkubation mit entsprechenden sekundären Antikörper in 1 % BSA/PBS für 40 min bei Raumtemperatur. Antikörper sind: (1) Huhn Anti-Maus 488 (grün), Huhn (2) Anti-Ziege 594 (rot) und (3) Esel Anti-Maus (weit rot) 647.</li>
		<li>Waschen die Abschnitte in PBS und Halterung mit DAPI-haltigen Eindeckmedium für das Chromatin beflecken.</li>
	</ol></li> <li>Fluoreszierenden Bilder mit einem konfokalen Laser-scanning-Kopf befestigt an einem inversen Mikroskop zu erhalten.
	<ol><li>Excite die Vorbereitung mit 405, 488, 561 und 647 nm Laser. Einziges Flugzeug 512 x 512 Pixel großen Bildern zu erfassen, durch Anklicken der Linie-sequentielle, Nivellierung Knopf (2 Zeile durchschnittlich) mit 20 X 0,1 NA Luft- und 40 X 1.0 NA Öl Ziele.</li>
		<li>Erhalten mindestens zehn Gesichtsfelder pro Abschnitt für Analysen und Daten für jedes Ergebnis (d.h. 10 Hochleistungs-FOV (HFOV) für das Steuerelement, 10 für die angeregten Probe, etc., für jede Maus). 
		Hinweis: Um eine repräsentative Stichprobe von das gesamte Feld zu erhalten, eine Matrixsystem kann verwendet werden in dem Bereich unterteilt ist in verschiedenen Abschnitten und für jede andere Probe die gleiche Matrix verwendet wird, um die Sichtfelder auswählen (z.B. Feld kann in 9 Abschnitte unterteilt werden, und das Zentrum und die 4 Ecken, zwei HFOV sind entnommen).</li>
	</ol></li></ol> 5. Dreidimensionale (3D) Imaging der METs Hinweis: da METs 3-d-Strukturen sind, indem man mehrere Z-Stapel Bilder, die wieder hergestellt werden, können geben wertvolle Informationen.
<ol><li>Abschnitt der Lunge Exemplare aus Paraffin-Blöcke bei 200 µm mit einem Vibratome bei einer Amplitude auf 1,8 mm und die Geschwindigkeit von 0,1-0,5 mm/s</li>
	<li>Blockieren Lungengewebe mit 20 % des jeweiligen Serum (10 % fetalen Kälberserum und 10 % Huhn Serum) und dann permeabilize in PBS ergänzt und 3,75 % Triton X 100 für 7 h bei Raumtemperatur unter sanften Agitation.</li>
	<li>Fleck in den Abschnitten 16 h bei 4 ° C mit der entsprechenden Primärantikörper (MMP-9, H3Cit und F4/80) in 200 µL Bände in Mikrozentrifugenröhrchen (Antikörper-Konzentrationen sind in Tabelle Materialien aufgeführt).</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte in PBS, 3 Mal für 10 min vor der Inkubation mit sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	<li>Der Lunge Abschnitte für DAPI (1:5 000) in Lösung für 20 min, färben, bevor das Mikroskop schlüpft die Cover hinzufügen in PBS Folien.</li>
	<li>Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem inversen konfokalen Mikroskop (40 x 1.3 NA) ausgestattet mit 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm und 635 nm Laser.</li>
	<li>3-d-Z-Stapel von 0,54 µm Dicke mit optimalen Z-Schnitt für das 40 x 1.3 NA Öl Ziel aufnehmen. 
	Hinweis: Die verwendete Software variieren je nach dem individuellen Mikroskop. Ein Beispiel für die Verwendung der Software für ein Mikroskop erfolgt in ergänzende Datei 1.</li>
</ol> 6. Bildanalyse Hinweis: die Analyse der Proben erfordert den Einsatz von speziellen bildgebenden Analyse-Software und Beispiele sind in Tabelle Materialien aufgeführt. Während die Analyse der Ergebnisse abhängig von der spezifischen Programm verwendet wird, die unten aufgeführten Punkte sind wichtig.
<ol><li>Analyse von BAL-Proben <ol><li>definieren die Anzahl der Makrophagen durch den blauen Kanal für DAPI auswählen und zuweisen eine Mindestgröße für die Zellen (z.B., &#62; 18 µm im Durchmesser). Mit der entsprechenden Software, die Gesamtzahl der Makrophagen pro Feld messen.</li>
		<li>Die Anzahl der Zellen, die die Merkmale einer MET durch die Anwesenheit von extrazellulären Chromatin röntgenologisch DAPI mit Co Ausdruck von anderen Markern (z. B. MMP12, PAD2 und H3Cit). 
		Hinweis: Die Anzahl der Markierungen, die analysiert werden können hängt von der Anzahl der Laser zur Verfügung, sondern im Idealfall neben DAPI, sollten mindestens zwei andere Marker einbezogen werden. Andere, weniger spezifische Parameter für MET Ausdruck (z. B. Anzahl der Zellen mit extrazellulären Chromatin und einem erweiterten Kern) verwendet werden.</li>
		<li>MET Ausdruck in BAL vergleichen Proben (zwischen Kontrolle, Rauch und Rauch/DNase behandelt Gruppen), ein Minimum von 100 BAL Makrophagen pro Probe.</li>
		<li>Zur Messung Sekundärantikörper und Isotype Ebenen der Fluoreszenz zu kontrollieren, ein Minimum von 100 Zellen in jeder Probe für ihre Fluoreszenz zu messen. Messen Sie das durchschnittliche Niveau der Hintergrundfluoreszenz für jede Markierung (z.B. H3Cit) mit standard-Software.</li>
		<li>MET Ausdruck definieren zählen die Zellen mit den typischen Phänotyp (z. B. extrazelluläre Chromatin mit Co Ausdruck von H3Cit und MMP9) und für jede MET, messen die Höhe der Fluoreszenz von Markern (z. B. H3Cit und MMP9). Zellen produzieren METs, wenn ihre Färbung nicht über Hintergrund und Isotype Kontrolle lag ausschließen.</li>
		<li>Für BAL Humanproben, analysieren Sie ein Minimum von 100 Zellen für jede Probe für den Anteil von Makrophagen, die METs zu machen. Für murinen Proben analysieren wie die Zellen kleiner sind und METs schwerer sind zu definieren, eine größere Anzahl von Zellen für jede Probe (z. B. 200 Makrophagen).</li>
	</ol></li> <li>Analyse von Gewebeproben Lunge <ol><li>verwenden um festzustellen, das Vorhandensein von METs im Lungengewebe spezifischen Makrophagen Marker wie F4/80.</li>
		<li>Definieren die Anwesenheit von METs in Lungengewebe mit Co Lokalisierung von F4/80 in Zellen, die extrazelluläre Chromatin mit anderen Parametern zu äußern, wie in Abschnitt 6.1 aufgeführt.</li>
		<li>Bestimmen den Umfang der Hintergrundfluoreszenz in Proben mit sekundären Antikörper und die Isotype-Steuerelemente. Analyse, die nicht über dem Hintergrund METs ausschließen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
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<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
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<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
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<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben in Bezug auf diese Arbeit zu machen.

In diesem Beitrag beschriebene Methode basiert auf, die für die Definition der Präsenz der Netze14verwendet. Makrophagen sind bei weitem die dominierende Zelltyp in BAL-Proben und diese Methode der Sammlung eignet sich besonders für das Studium der METs. Wenn die roten Blutkörperchen in der BAL vorhanden sind, sollten diese Zellen lysiert werden, mithilfe von Ammoniumchlorid. Das BAL-Verfahren wird in der Regel die Makrophagen aktivieren und daher voraussichtlich werden METs in un-stimulierten Pro...

Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs), wurden zuerst von Brinkmann Et Al. beschrieben 1 sie sind überwiegend als Reaktion auf die Infektion (vor allem Bakterien) hergestellt und haben eine wichtige Rolle im Host Verteidigung1,2. Sie sind auch beschrieben worden, um als Reaktion auf nicht-infektiösen Krankheiten, einschließlich Vaskulitis und systemischer Lupus erythematodes (SLE); und die Mitogen Phorbol 12-Myrisate 13-Acetat (PMA)2,3. Es ist vor kurzem erkannt worden, dass andere Zelltypen auch extrazelluläre fallen, einschließlich der Makrophagen produzieren können. Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) sind noch nicht definierte Entität in der Literatur4,5. Vor kurzem haben wir Methoden, um das Vorhandensein von METs in Vitro und in Vivo6,7. In diesem Artikel wird die Messung der METs mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beschrieben.
Hauptmerkmale der NETosis die Unterscheidung von anderen zellulären Wege (z. B. Apoptose8) sind die Extrusion von Chromatin in Verbindung mit: (1) Citrullination der Histone (H3Cit)9, (2) Co Ausdruck von Granulat Proteasen10 , und (3) Einbeziehung der Peptidyl Arginin Deiminase (PAD) 411,12. Makrophagen auch ausdrücken, H3Cit, Granulat Proteasen und PAD, und diese Funktionen können verwendet werden, um das Vorhandensein von METs zu definieren.
METs haben eine besonders wichtige Rolle in der Lunge, da die Makrophagen die dominante Zelle in die Alveolen und die Atemwege der Lunge vorhanden und die erste Rolle hat in der Leitung der zellulären Immunantwort auf Infektionen/Entzündungen. Darüber hinaus zwar ein Großteil der Lunge leeren Raum (z. B.innerhalb der Alveolen), sind die METs potenziell in der Lage, in den Raum zur Verfügung, im Gegensatz zu soliden Organe zu erweitern.
Die am weitesten verbreitete Methode, um das Vorhandensein von Netzen zu definieren ist von konfokalen Mikroskopie. Es gibt nicht noch eine klar definierte Methode zum Messen der METs. Die Technik für die Messung der Netze wurde angepasst um das Vorhandensein von METs in diesem Protokoll zu messen. Die wichtigsten Anforderungen für diese Methode sind Zugriff auf konfokalen Mikroskopie und entsprechende imaging-Software für die Analyse.

<table><tbody><tr><td>Humanproben: Primärantikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human H3Cit (Citrullin R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 μg/ml</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 Konzentration nicht quantifizierbar</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 Aszites, keine Konzentration gegeben</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Mensch PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 μg/ml</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 μg/ml</td></tr><tr><td>Schaf Anti-Mensch NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 μg/ml</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Mausproben: Primäre Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus H3Cit (Citrullin R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus F4/80</td><td>Inhouse (Hybridom)</td><td>Inhouse</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Schaf Anti-Human Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 μg/ml</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch & schüchtern; &schüchtern; &schüchtern; &schüchtern; PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 μg/ml</td></tr><tr><td>Superfrost plus Objektträger</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Molekulare Sonden</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td> Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huhn Anti-Kaninchen AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Huhn Anti-Kaninchen AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Huhn Anti-Kaninchen AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Hühner-Anti-Maus AF488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Schafe AF 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Hühner-Anti-Maus AF 647</td><td>Life Technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Schafe AF 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Isotyp-Kontrolle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen IgG</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen IgG</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen IgG</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Schaf IgG</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td><>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software Programs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zur durchschnittlichen Intensität von Fluorphoren kann eine Standard-Office-Anwendung wie Microsoft Excel verwendet</td> <td>werden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Mikroskope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Konfokales Rastermikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Konfokales Rastermikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td><>Gewebequellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL-Proben aus der Bronchoskopie-Suite im Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus-BAL-Proben und Lungengewebe aus der Abteilung für Pharmakologie der Universität Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Andere Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan schwarz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd/Periodat/Lysin (PLP) Fixiermittel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Natürliches</td><td>Formalin Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</strong<></td><td>strong>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Mäuse</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 schwarz 6</td><td>Monash Tierforschungsplattform (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen mikroskopie

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Eine bevorzugte Methode verwendet, um das Vorhandensein von Neutrophilen extrazelluläre Traps (NETs) zu definieren ist konfokalen Mikroskopie. Wir haben etablierte konfokalen Mikroskopie Methoden zur Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) modifiziert. Diese extrazellulären fallen werden durch das Vorhandensein von extrazellulären Chromatin mit Co Ausdruck anderer Komponenten wie Granulat Proteasen, citrullinierte Histone und Peptidyl Arginase Deiminase (PAD) definiert. Der Ausdruck der METs in der Regel nach der Exposition auf einen Reiz gemessen und im Vergleich zu un-stimulierten Proben. Proben sind auch für Hintergrund und Isotype Kontrolle enthalten. Zellen werden mit genau definierten Bildanalyse-Software analysiert. Konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um das Vorhandensein von METs definieren sowohl in Vitro und in Vivo im Lungengewebe.

METs können von BAL-Proben, im Lungengewebe und in dickeren Bereiche der Lunge mit 3-d-Bildern sichtbar gemacht werden. Ein Beispiel der METs visualisiert in einer BAL-Probe ist in Abbildung 1dargestellt. Die Morphologie der METs variiert je nach ihrem Stadium der Reifung. Die ersten nachweisbare Funktion auf Mikroskopie ist die Bewegung des Kerns an den Rand der Zelle. Dies folgt extrazelluläre Chromatin mit anderen Co ausgedrückten Mediatoren, wie H3Cit und...

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, zu zeigen, wie extrazelluläre Fallen von Makrophagen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie sichtbar gemacht und untersucht werden können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Entzündung zu beantworten, wie z. B. Reaktionen auf Infektionen und andere Immunreize. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine Modifikation einer etablierten Methode handelt, die zur Untersuchung extrazellulärer Fallen von Neutrophilen verwendet wurde.Dieses Verfahren wird von Roleen Sharma demonstriert. Nach der Gewinnung von Lungenmakrophagen von Menschen und Mäusen durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie Trypanblau und ein Hämozytometer, um eine lebensfähige Zellzählung an der BAL-Lösung durchzuführen. Pipettieren Sie ein- bis viermal 10 bis fünf Makrophagen in 500 Mikrolitern Kulturmedium auf Deckgläser in den Vertiefungen von 24-Well-Platten und inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen haften können.Entfernen Sie das Kulturmedium und verwenden Sie PBS, um die Zellen einmal zu waschen. Fügen Sie dann 2 % Paraformaldehyd-Periodat-Lysin oder PLP-Fixiermittel hinzu und inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang. Nachdem Sie die Zellen mit PBS kurz gewaschen haben, fügen Sie 0,2%TWEEN 20 in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang.Um die Zellen zu blockieren, fügen Sie anschließend 10 % Hühnerserum in 5 % BSA hinzu, verdünnt in PBS, und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie dann die Blocklösung durch eine Konzentration von 1 bis 100 Primär- und Isotopenkontrollantikörpern und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation verwenden Sie PBS, um die Zellen zu waschen, bevor Sie die entsprechenden Sekundärantikörper hinzufügen.Anschließend inkubieren Sie die Proben 40 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen in PBS gewaschen haben, mounten Sie die Proben mit DAPI-basiertem Eindeckmedium und visualisieren Sie die Proben dann mit einem konfokalen Mikroskop. Um die FFPE-Proben mit einer Antigen-Rückgewinnungslösung vorzubehandeln, trocknen Sie die Objektträger 60 Minuten lang bei 60 Grad Celsius im Ofen.Übertragen Sie dann die Objektträger für 30 Minuten in Xylollösung, bevor Sie die Proben fünf Minuten lang bei 70%igem Ethanol bei Raumtemperatur überführen. Nachdem Sie die Objektträger mit Leitungswasser abgespült haben, legen Sie sie in hitzebeständige Plastikfolie und unterziehen Sie sie einer höheren Antigen-Rückgewinnung, indem Sie sie 10 Minuten lang in einen Schnellkochtopf mit Tris-EDTA pH 9,0 legen. Kühlen Sie die Proben 20 Minuten lang ab und geben Sie sie in Leitungswasser.Legen Sie sie dann für fünf Minuten auf eine Wippe. Wiederholen Sie die Leitungswasserwäsche und waschen Sie die Rutschen dann einmal in PBS auf der Wippe. Um die Proben zu blockieren, fügen Sie 10 % Hühnerserum in 5 % BSA PBS hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.Um dann Makrophagen-extrazelluläre Fallen oder METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie eine Verdünnung von 1 bis 100 Primärantikörpern in 1 %BSA PBS hinzu und inkubieren Sie die Objektträger 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Proben mit PBS zweimal für jeweils fünf Minuten auf einer Wippe. Geben Sie die entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörper in 1%BSA PBS und inkubieren Sie die Objektträger 40 Minuten lang bei Raumtemperatur.Verwenden Sie nach PBS-Waschungen DAPI-haltiges Eindeckmedium, um das Chromatin zu färben und die Proben einzubetten. Nehmen Sie mit einem konfokalen Laserscankopf, der an einem inversen Mikroskop befestigt ist, Fluoreszenzbilder mit 20X 0,1 NA Luft- und 40X 1,0 NA Ölobjektiven auf. Nehmen Sie Bilder mit einer Einzelebene von 512 x 512 Pixeln auf, indem Sie auf die Schaltfläche Sequenzielle Liniennivellierung klicken.Erhalten Sie mindestens 10 Sichtfelder pro Abschnitt für die Analyse und Daten für jedes Ergebnis. Um die Schnitte in Mikrozentrifugenröhrchen zu färben, fügen Sie die entsprechenden Primärantikörper in einem Volumen von 200 Mikrolitern hinzu und inkubieren Sie die Proben 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Schnitte dreimal 10 Minuten lang in PBS, bevor Sie die entsprechenden Sekundärantikörper hinzufügen und die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.Verwenden Sie DAPI, um die Lungenschnitte in Lösung zu färben und die Proben 20 Minuten lang zu inkubieren, bevor Sie die Schnitte auf den Objektträgern in PBS mit Deckgläsern versehen. Verwenden Sie ein inverses konfokales Mikroskop mit einem 40X 1,3 NA-Objektiv, das mit 405 Nanometern, 440 Nanometern, 473 Nanometern, 543 Nanometern und 635 Nanometern ausgestattet ist, um Bilder aufzunehmen und 3D-Z-Stapel mit einer Dicke von 0,54 Mikrometern mit optimaler Z-Schnittung aufzunehmen. Analysieren Sie abschließend die Bilder gemäß dem Textprotokoll.Ein Beispiel für METs in einer BAL-Stichprobe ist hier dargestellt. Das erste nachweisbare Merkmal ist die Bewegung des Zellkerns zum Rand der Zelle, wie sie in diesem früheren Stadium der MET zu sehen ist, das eine annähernd kugelförmige Form hat. Darauf folgt extrazelluläres Chromatin mit anderen co-exprimierten Mediatoren wie H3Cit und granulären Proteasen, wie sie in dieser reiferen MET zu sehen sind.Die MET der früheren Stufe befindet sich oben links und die MET der späteren Stufe befindet sich darunter in der Mitte. Die METs des Lungengewebes sind in dieser Abbildung dargestellt. Wenn die Lunge mit Flüssigkeit aufgeblasen wird, um die Lungenarchitektur zu definieren, werden die METs gegen die Alveolarwände gedrückt.Die Morphologie der METs variiert auch, je nachdem, in welcher Ebene das Gewebe geschnitten wurde. Die Standardschnitte, die für Lungengewebeproben verwendet werden, sind vier bis fünf Mikrometer dick. Dickere Gewebeschnitte ermöglichen die Aufnahme mehrerer Bilder und die METs können dann in 3D betrachtet werden.Ein Beispiel für ein 3D-Bild aus Lungengewebe von Mäusen, das in 25- bis 35-Mikrometer-Schnitten geschnitten wurde, wird hier vorgestellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Tagen Färbung plus Bildgebung durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vorsichtig mit den Wäschen umzugehen.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Zymographie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Proteaseexpression zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik den Weg für die Erforschung entzündlicher Makrophagenreaktionen ebnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man METs mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie visualisiert.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit PLP gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Augenschutz getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Eine Methode ist beschrieben, einzeln auswählen, bearbeiten und Bild zu leben Erreger mit einer optischen Falle gekoppelt an eine sich drehende Scheibe Mikroskop. Die optische Falle bietet räumliche und zeitliche Steuerung von Organismen und legt sie neben Wirtszellen. Fluoreszenzmikroskopie erfasst dynamische interzelluläre Wechselwirkungen mit minimaler Störung der Zellen.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die Immunfärbung und konfokalmikroskopische Visualisierung von Makrophagen-extrazellulären Fallen (METs) in murinem Lungengewebe. Geweberesidente Makrophagen zeichnen sich durch die Expression des Makrophagen-spezifischen F4/80-Oberflächenglykoproteinmarkers aus, während METs durch Markierung der MET-Marker Matrix-Metalloproteinase 9, citrulliniertes Histon H3 und extrazelluläres Chromatin sichtbar gemacht werden.

Charakterisierung extrazellulärer Makrophagenfallen in Lungengewebeproben der Maus

Dieses Video zeigt die Immunmarkierung von Makrophagen extrazellulären Fallen, METs, in bronchoalveolären Makrophagen aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit und deren Visualisierung mit einem konfokalen Mikroskop.

Visualisierung extrazellulärer Fallen in Makrophagen aus humanen bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten

Dieses Video demonstriert die In-vitro-Stimulation von Makrophagen-Extrazellulären Fallen (METs) in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen unter Verwendung verschiedener Entzündungsreize wie TNF-alpha, PMA und HOCL. Das Video zeigt auch die Methode der SYTOX-Farbstofffärbung von METs zur Visualisierung.

In vitro Stimulation und Visualisierung von extrazellulären Makrophagenfallen

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind dreidimensionale Strukturen, die durch stimulierte neutrophile Granulozyten erzeugt werden. In den letzten Jahren hat sich herabimsiert, dass NETs an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind. Der Nachweis von NETs im Gewebe kann diagnostische Relevanz haben, daher sind standardisierte Protokolle für die Kennzeichnung von NET-Komponenten erforderlich.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Erfahren Sie die Visualisierung von Makrophagen-extrazellulären Fallen mit konfokaler Mikroskopie in Lungenproben. Diese Methode ermöglicht Forschern die Untersuchung immunologischer Reaktionen und Entzündungsprozesse.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

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