Name: Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit hochauflösender Respirometrie die mitochondriale Funktion intakter Beta-Zellen unter insulin-stimulierenden Bedingungen messen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung natürlicher Verbindungen.

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Die Autoren möchten den Tessem und Hancock Labors für Assistenten und wissenschaftliche Diskussion danken. Die Autoren danken für die Bereitstellung der Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer Bruchteil Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech). Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Diabetes Action Research and Education Foundation, JST.

(1) Zellkultur
<ol><li>Kultur INS-1 abgeleitet 832/13 Betazellen RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.</li>
	<li>Entfernen Sie 832/13 Zellen aus einem T75 Kolben mit 2 mL von 0,25 % Trypsin, Inkubation bei 37 ° C für 10 min. neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 8 mL komplette RPMI 1640 Medien.</li>
	<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 1.2 in 900 µL PBS verdünnen.</li>
	<li>Platte 832/13 Zellen bei einer Dichte von 2 x 106 Zellen/mL in einem 6 Gericht gut.</li>
	<li>Zellkulturen für 48 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 vor Beginn der Atmung Experimente.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Zellen hochauflösender Respirometrie
<ol><li>
Behandlung von 832/13 Zellen mit Kakao abgeleiteten Epicatechin Monomer.
	<ol>
<li>Kulturzellen Sie 832/13 für 24 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Ändern Sie Medien 24 h nach Beschichtung und behandeln Sie 832/13 Zellen mit Fahrzeugkontrolle (3 Brunnen) oder 100 nM Kakao Monomer (3 Brunnen), gefolgt von Kultur für weitere 24 h (48 h insgesamt) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2zu.</li>
		<li>Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose Sekretion Testpuffer (SAB) für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.<ol>
<li>Stellen 10 X SAB mit 33,32 g NaCl, KCl, 0,82 g KH2PO4, 0,7 g MgSO4 1,73 g und H2O zu einem Endvolumen von 500 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.</li>
			<li>1 x niedrige Glukose SAB mit 10 mL 10 x SAB, 100 µL von 45 % Glucose, 2 mL 1 M HEPES, 1 mL von 0,25 M CaCl2, 0,57 mL 35 % BSA Lösung, 0,21 g Nahco33 machen und H2O zu einem Endvolumen von 100 mL hinzufügen. Sterilfilter die endgültige Lösung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Behandlung von 832/13 Zellen mit Curcumin.
	<ol>
<li>Kulturzellen Sie 832/13 für 48 h nach der Beschichtung in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
		<li>Waschen Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 5 min. Aspirat Puffer zu, und inkubieren Sie 832/13 Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB für 3 h, 1 x niedrige Glukose SAB stündlich ändern.</li>
		<li>Aspirieren Sie nach 2,5 h 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB Puffer und inkubieren Sie Zellen in 1 x Low Glukose SAB mit Fahrzeugkontrolle oder 40 µM Curcumin für 30 min. Nach Inkubation Aspirieren des Puffers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellen mit Trypsin für hochauflösender Respirometrie Ernte
	<ol>
<li>Entfernen Sie nach 3 h Inkubation in 1 x niedrige Glukose SAB die Zellen aus der Platte mit 250 µL 0.25 % Trypsin pro Bohrloch.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Zellen in Trypsin aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder Verbindung von Interesse mit 4 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen behandelt.</li>
		<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und 100 µL das Zellvolumen aus Schritt 2.3.2 in 900 µL PBS verdünnen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen in 1 x niedrige Glukose SAB 3 mL bei der entsprechenden Konzentration für jede Kammer zu machen. Die Daten zeigen, dass eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL am effektivsten ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellen mit mechanischen Dissoziation für hochauflösender Respirometrie Ernte
	<ol>
<li>Nach 3 h Inkubation in 1 X niedrige Glukose SAB, fügen Sie 1 mL 1 X niedrige Glukose SAB zu jedem gut und sanft Zellen aus der Platte mit mechanischen Dissoziation durch Schlag mit einem 1000 µL Pipettenspitze pipettieren.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Zellen aus 3 Brunnen mit Fahrzeugkontrolle oder zusammengesetzte Interesse an insgesamt 3 mL SAB in einem 15 mL konische Röhrchen für die Atmung behandelt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) hochauflösender Respirometrie
<ol><li>Erstellung von hochauflösenden Respirometer.
	<ol>
<li>Die hochauflösende Respirometer und eine Verbindung zum Desktop durch die Einführung der Respirometer-Analyse-Programm.</li>
		<li>70 % Ethanol aus beiden Kammern anzusaugen. Diese Kammern in 70 % igem Ethanol mindestens 45 Minuten lang einweichen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammern zweimal mit 70 % Ethanol, nach jedem Schritt absaugen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammern dreimal mit DdH2O, nach jedem Schritt absaugen.</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer Kolben in DdH2O. Dies reinigt die restlichen Ethanol aus der Kolben und die Titan-Port.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrierung der polarographischen Lambda-Sonden.
	<ol>
<li>Jede Oxygraph Kammer, unter ständigem Rühren den Puffer ständig mit magnetischen rühren Bars in der Kammer bei 750 u/min und 37 ° C mit einer Daten-Aufzeichnungsintervall bei 2,0 2,4 mL 1 x Low Glukose SAB Puffer hinzufügen s durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte mit der Bezeichnung "Systeme". Drücken Sie Kolben ganz hinein, und dann auf den Schraubenschlüssel Belüftung Einstellung zurücknehmen. Lassen Sie die Maschine equilibrate für ein Minimum von 1 Stunde bis stabile Sauerstoff Fluss erreicht ist.</li>
		<li>Stellen Sie die Maschine bei 37 ° C für die Dauer des Experiments. Stellen Sie Polarisation Spannung bis 800 mV, mit einem Gewinn von 2 durch Drücken der F7-Taste und öffnen die Registerkarte "Sauerstoff, O2". Equilibrate die Sauerstoffkonzentration des Puffers SAB für mindestens 30 min, während die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist (weniger als 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Wählen Sie nach Sauerstoff-Konzentration-Stabilisierung eine Region, wo die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabile Hintergrundmessung des Wandels Sauerstoffkonzentration zu etablieren.<ol>
<li>Wählen Sie eine Region durch Drücken der Shift-Taste, Links-Klick auf die Maus und ziehen mit der Maus über den ausgewählten Bereich. Klicken Sie auf den Buchstaben der ausgewählten Region und Änderung "R1" für jede Spur, mit jedem der beiden Kammern entsprechend zugeordnet.</li>
			<li>Klicken Sie doppelt auf das "O2 Kalibrierung" Feld in der unteren linken und rechten Sie Ecken des Bildschirms, klicken Sie auf die "wählen Sie" für die "Luft-Kalibrierung" als R1 und wählen Sie dann "kalibrieren" und in die Zwischenablage kopieren"für beide Kammern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Beurteilung der Atmung von 832/13 Beta-Zellen in den Schritten 2.1.5 oder 2.2.5 vorbereitet.
	<ol>
<li>Laden Sie 2,4 mL der Probe in jeder Kammer (eine Kammer mit Fahrzeug behandelt Kontrollzellen, eine Kammer mit zusammengesetzten behandelten Zellen) 1 X niedrige Glukose SAB Behalten Sie 0,5 mL der Zellprobe für Protein Quantifizierung von BCA (Bicinchoninic Säure) Assay, wenn den mechanische Dissoziation Ansatz (Einfrieren bei-20 ° C für die Messung später) zu verwenden.<ol>
<li>Kolben ganz einschieben und das Restvolumen Aspirieren. Rühren Sie die Zellen kontinuierlich während des Experiments bei 750 u/min und 37 ° C für alle weiteren Schritte. Machen Sie eine Markierung, indem Sie auf F4 und Kennzeichnung als "Zellen", wenn Proben geladen werden.</li>
			<li>Proben für 30 min zu messen. Wählen Sie nach Signal-Stabilisierung eine Region des Wandels im Sauerstoff-Konzentration, die niedrige Glukose-Bedingungen (2,5 mM Glukose) entspricht, wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nachdem Signal Stabilisierung erreicht ist, fügen Sie 12,5 µL einer 45 % sterile Glucoselösung (16,7 mM Endkonzentration) in jeder Kammer durch das Titan Verladehafen mit einer Spritze. Machen Sie eine Markierung gemessen "Glukose" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diese Region des Wandels in Sauerstoff-Konzentration, wie 3.2.3 beschrieben. Dies ist die 16,7 mM Glukose Lesung und stimulierende Bedingungen7entspricht.</li>
		<li>Nach dem Signal Stabilisierung erreicht ist fügen Sie 1 µL 5mM Oligomycin eine (2,5 µM Endkonzentration) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung hinzu. Machen Sie eine Markierung gemessen "OligoA" als in 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. Oligomycin A hemmt die ATP-Synthase und ist somit die einzige Sauerstoff Flussmittel auftretenden über Leck von Elektronen und nicht Oxidative Phosphorylierung7.</li>
		<li>Nach Signal Stabilisierung erreichen hinzufügen 1 mM FCCP in Schritten von 1 µL bis eine maximale Atemfrequenz hergestellt wird. Dies entspricht maximal abgekoppelt Atmung. Zwischen 3-4 µL ist FCCP ausreichend (1,5-2,0 µM Endkonzentration) maximale abgekoppelt Atmung INS-1 832/13 Zellen induzieren. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "FCCP" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. FCCP ist ein abkoppeln Agent. So lassen sich abgekoppelt Atmung7messen.</li>
		<li>Nach Signal Stabilisierung erreichen fügen Sie 1 µL 5 mM Antimycin A (2,5 µM Endkonzentration hinzu) in jeder Kammer durch die Ladeöffnung. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung "AntiA" wie unter 3.3.1 beschrieben, wenn Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie Signal zu stabilisieren und Zellatmung aufzuzeichnen, bis ein stabile Sauerstoff-Fluss erreicht wird. Wählen Sie diesen Bereich der Kurve wie in 3.2.3 beschrieben. Hinweis: Antimycin A bindet Cytochrom C-Reduktase, Ubichinon Oxidation hemmt und blockiert alle Atmung. Dies ermöglicht es uns, Atmung7vollständig zu stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Messzellen 832/13 Beta für Protein-Konzentration und Atmung-Normalisierung.
	<ol>
<li>Mit Hilfe der 0,5 mL der Probe beim Laden, Maßnahme Protein Probe mit der BCA Methode13beibehalten.</li>
		<li>Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung, ohne Verdünnung, nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen aus trypsiniert Zellen.<ol>
<li>Geben Sie die Anzahl der Zellen pro mL Einsatz im Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in Zellen/mL, geben Sie die zelluläre Konzentration ein und ändern Sie Medium, SAB</li>
		<li>Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.</li>
		<li>Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.</li>
		<li>Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 Beta-Zelle Atmung Berechnungen von mechanisch getrennt Zellen.<ol>
<li>Geben Sie die Protein-Berechnungen von der BCA-Test durch Drücken der F3-Taste der Respirometer-Analyse-Programm. Ändern Sie die Einheiten in mg, geben Sie die BCA-Konzentration und verändern Medium, SAB</li>
		<li>Wählen Sie Hintergrund Lesungen, die Daten zu normieren, indem auswählen und eingeben in der O2 Kalibrierung Form wie in 3.2.3 beschrieben.</li>
		<li>Treffen Sie die Auswahl der Lesungen von 2,5 mM Glukose, 16,7 mM Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A wie unter 3.3.1 beschrieben.</li>
		<li>Innerhalb der Respirometer-Analyse-Programm exportieren Sie die Messwerte für jede Kammer nach Eingabe Proteinkonzentration und wählen die entsprechenden Mittelwerte für jede Behandlung während der Atmung-Messung. Dies geschieht, indem Sie auf F2 und dann drücken die "Copy to Clipboard-Funktion". Die Daten für den Einsatz in andere Programme exportiert. Verwenden Sie die "O2 Hang neg." Werte für Berechnungen.</li>
		<li>Kompilieren Sie Daten für 3 bis 5 unabhängigen Läufe des Fahrzeugs Kontrollen behandelt und natürlichen behandelten Zellen Verbindungen, um den Effekt auf intakte Zellatmung von INS-1 832/13 Beta-Zellen zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Ziel dieses Protokolls ist mit hochauflösender Respirometrie Atemfrequenz in intakten pankreatischen Betazellen messen. Diese Methode ermöglicht die Messung der Reaktion der Beta-Zellen auf erhöhte Blutzuckerwerte. Das Protokoll ermöglicht auch die Vorbehandlung mit verschiedenen Verbindungen, wie in diesem Protokoll mit den natürlich vorkommenden Monomere Epicatechin oder Curcumin4,5gezeigt. Behandlung mit verschiedenen ander...

Der primäre Zweck des Pankreas Beta-Zellen ist System Normoglycemia durch Glukose-stimulierten Insulinsekretion zu pflegen. Die Beta-Zellen spüren physiologische Veränderungen im zirkulierenden Glukose vor allem auf die geringe Affinität, hohe Kapazität Glukosetransporters GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Kreislauf Blutzuckerspiegel steigen, erleichtert diese Hochleistungs-Low-Affinität Transporter eine proportionale Zunahme der intrazellulären Glukose innerhalb der Beta-Zellen. Glukose wird durch Glykolyse, TCA-Zyklus (Tricarboxylic Säure Zyklus) und der mitochondrialen Atmung, was zu erhöhten zellulären ATP (Adenosin Triphosphat) metabolisiert. Die erhöhten ATP-Konzentration blockiert die ATP empfindliche K+ Kanäle, Membran-Depolarisation führt. Membran-Depolarisation bewirkt, dass die Öffnung der Spannung gated Ca2 + -Kanäle und anschließende Freisetzung Vesikel gebunden Insulin Granulat2. Beta-Zellen Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Typ-2-Diabetes (T2D) und führt zu verringerte und schlecht kontrollierten Insulinsekretion und letztlich Beta-Zellen Tod3. Mechanismen, die Erhaltung oder Verbesserung der Beta-Zellfunktion konnte als Behandlung für T2D verwendet werden.
Studien belegen die positiven Auswirkungen des natürlich vorkommenden pflanzlichen Verbindungen auf die Bauchspeicheldrüse Beta-Zellen4. Diese Verbindungen haben ihre Wirkung durch steigende Beta-Zell-Proliferation, überleben oder Glukose-stimulierten Insulinsekretion. Als Beispiel haben jüngste Studien gezeigt, dass Monomere Epicatechin Glukose-stimulierten Insulinsekretion erhöht durch Erhöhung der mitochondrialen Atmung und Erhöhung der zellulären ATP5Ebenen. Daher zu verstehen, wie diese Verbindungen funktionelle Beta-Zellen steigern können Masse ist wichtig, diese Verbindungen als potenzielle Therapeutika nutzen können.
Zellatmung kann durch eine Reihe von Werkzeugen gemessen werden. Verwendung von hochauflösenden Respirometer kann für die Titration der chemische Modulatoren, eine permeabilized oder intakte Zelle Bevölkerung6. Dieses Tool ermöglicht die Zugabe von verschiedenen Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen, wodurch eine Vielzahl von Informationen.
Da die innige Verbindung zwischen Glukose-Stoffwechsel und Beta-Zell-Funktion, sind Messungen der Zellatmung entscheidend. Messungen der Zellatmung können erfolgen mit permeabilized oder intakte Beta-Zellen, mit jeweils einen eigenen Satz von vor- und Nachteile7,8. Während Permeabilisierung der Betazellen werden verschiedene Aspekte der Elektronentransport-Kette messen kann, geschieht dies ohne Rücksicht auf den Mechanismus zur Induktion der Atmung in die Beta-Zellen, die Glukoseaufnahme und den Stoffwechsel. Daher ist die Verwendung von unpermeabilized Beta Zellatmung eine sehr nützliche Technik, um die Beta-Zellen als Reaktion auf verschiedene Blutzuckerspiegel, mit Sauerstoff-Verbrauch als das Auslesen zu bestimmen.
Diese Technik dient Sauerstoffverbrauch in intakten INS-1 Messen 832/13 Beta-Zellen abgeleitet. Diese Technik ermöglicht es uns, die Antwort von Beta-Zellen für unstimulatory Glukose Bedingungen (2,5 mM Glukose) bestimmen sowie stimulierende Glukose Bedingungen (16,7 mM Glukose). Während die unpermeabilized Zellen nicht erlauben, einzeln testen Komplex I, II oder III des Elektrons Transportkette, die Technik erlaubt Messungen der Umgang mit komplexen IV Hemmung (Oligomycin A) abgekoppelt Atmung (FCCP-Carbonyl Zyanid- 4-(Trifluormethoxy-) Phenylhydrazone), und vollständig gehemmt Atmung (Antimycin A). Diese Studie zeigt die Wirksamkeit zur Messung der Atmung in den intakten unpermeabilized pankreatischen Betazellen, sowie die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung.

<table><tbody><tr><td>O2k Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrument für hochauflösende Respirometrie</td></tr><tr><td>DatLab 6 Programm</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Computerprogramm zur Analyse der Respirometrie mit hoher Relolution</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 Zelllinie</td><td>Duke University Medical Center</td><td>NONE</td><td>Beta-Zelllinie, Geschenk von Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Vorbehandlung von Betazellen</td></tr><tr><td>Kakao-Epicatechin-Monomer</td><td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td><td>NONE</td><td>Vorbehandlung von Betazellen, Geschenk von Dr. Andrew Neilson</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 Beta-Zellmedien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 Beta-Zellmedienkomponente</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 Betazellmedienkomponente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 Betazellmedienkomponente / 1x SAB-Puffer</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 Betazellmedienkomponente</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 Betazellmedienkomponente</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 Beta-Zell-Medienkomponente</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Komponente aus 10x SAB-Puffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Komponente aus 10x SAB-Puffer</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Komponente aus 10x SAB-Puffer</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Bestandteil von 10x SAB-Puffer</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoselösung</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Bestandteil von 1x SAB-Puffer, chemisch für den Atmungsassay</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Bestandteil von 1x SAB-Puffer</td></tr><tr><td>35%ige BSA-Lösung</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Bestandteil von 1x SAB-Puffer</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Bestandteil von 1x SAB Puffer</td></tr><tr><td>200 proof Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Chemikalien für den Atmungsassay</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Chemikalien für den Atmungsassay</td></tr><tr><td>Anitmycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Chemikalien für den Atmungsassay</td></tr><tr><td>BCA Protein</td><td>Kit Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>Zur Bestimmung der Proteinkonzentration</td></tr></tbody></table>

hochauflösender respirometrie, mitochondriale funktion intakt beta-zellen in anwesenheit von naturstoffen zu messen

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien, Zellen und Geweben. Beta-Zellen spielen eine wichtige Rolle im Körper durch die Kontrolle des Blutzuckerspiegels durch Insulin-Sekretion als Reaktion auf erhöhten Glukosekonzentration. Insulin-Sekretion wird durch Glukosestoffwechsel und die mitochondriale Atmung gesteuert. Daher unbedingt messen intakt Beta Zellatmung Beta-Zellfunktion zur Behandlung von Diabetes verbessern zu können. Mit intakt 832/13 INS-1 abgeleitet Betazellen messen wir den Effekt der Erhöhung der Glukosekonzentration auf die Zellatmung. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Beta Zellatmung in das Vorhandensein oder Fehlen von verschiedenen Verbindungen, so dass man die Wirkung der bestimmen messen Verbindungen auf intakte Zellatmung gegeben. Hier zeigen wir die Wirkung von zwei natürlich vorkommenden Verbindungen, Monomere Epicatechin und Curcumin, auf Beta Zellatmung unter Anwesenheit von niedrig (2,5 mM) "oder" hohe Glukose (16,7 mM) Bedingungen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Wirkung der verschiedenen Verbindungen auf intakte Beta Zellatmung in Anwesenheit von unterschiedlichen Glukosekonzentration zu bestimmen.

INS-1 832/13 Beta-Zellen, die vorbereitet und geerntet wie im Protokoll beschrieben zeigen Modulation in Sauerstoff-Verbrauch anhand der verschiedenen chemischen Interventionen (Abb. 1A). Eine Zunahme der Atmung wird beobachtet werden, wenn die Glukosekonzentration auf 16,7 mM Glukose (Abbildung 1 b) erhöht wird. Atmung sinken, wenn die intakten Zellen mit Oligomycin A. behandelt werden Diese Atmung bekannt als Leck, definiert als die basale, nonphosphorylating ...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirkung der Glukose-vermittelte Änderungen an mitochondrialen Atmung im Beisein von Naturstoffe auf intakt 832/13 Beta-Zellen mit Hilfe hochauflösender Respirometrie messen.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist es, die Atmungsfunktion von Betazellen der Bauchspeicheldrüse unter insulinstimulierenden Bedingungen direkt zu beurteilen. Dies kann auch verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Verbindungen auf die Atmungsfunktion der Betazellen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Physiologie der Betazellen der Bauchspeicheldrüse zu beantworten, z. B. ob eine bestimmte Verbindung die Funktion der Betazellen der Bauchspeicheldrüse über Veränderungen in der Atmung beeinflusst.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur direkten Beurteilung der Atmungsfunktion in Betazellen der Bauchspeicheldrüse unter basalen und insulinstimulierenden Bedingungen verwendet werden kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Zellvorbereitung und der maschinellen Nutzung aufgrund der erforderlichen Präzision bei der Zellvorbereitung und der Messung der Atmung schwer zu erlernen sind. Zu Beginn kultivieren Sie INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen in supplementiertem RPMI 1640.Nehmen Sie die Zellen aus einem T75-Kolben, indem Sie zwei Milliliter 0,25%iges Trypsin hinzufügen und 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Neutralisieren Sie dann das Trypsin, indem Sie acht Milliliter des vollständigen RPMI 1640-Mediums hinzufügen. Verdünnen Sie 100 Mikroliter des Zellvolumens in 900 Mikrolitern PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Dann werden die Zellen mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter in eine 10-Zentimeter-Schale gegeben. Kultivieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, bevor Sie mit den Atmungsexperimenten beginnen. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach dem Plattieren und Kultivieren der 832/13-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.Behandeln Sie dann die Zellen mit Vehikelkontrolle oder aus Kakao gewonnenem Epicatechin-Monomer für eine Endkonzentration von 100 Nanomolaren. Nach der zusätzlichen Behandlung mit einer Kultur für weitere 24 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Waschen Sie dann die Zellen fünf Minuten lang in 1x Assay-Puffer mit niedriger Glukosesekretion oder SAB.Aspirieren Sie den Puffer und inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang in 1x niedrigem Glukose-SAB, wobei der Puffer stündlich gewechselt wird. Nach der Inkubation werden die Zellen mit einem Milliliter 0,25 % Trypsin aus der Schale genommen. Kombinieren Sie die Zellen in Trypsin aus der mit Vehikelkontrolle behandelten Schale mit vier Millilitern SAB in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.Kombinieren Sie auf ähnliche Weise das mit der interessierenden Verbindung behandelte Gericht mit einem Puffer. Verdünnen Sie 100 Mikroliter des Zellvolumens in 900 Mikrolitern PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie 100 Mikroliter des Zellvolumens in 900 Mikrolitern PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Die Daten zeigen, dass eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter am effektivsten ist. Nach der Vorbereitung des hochauflösenden Respirometers, wie im Textprotokoll beschrieben, geben Sie 2,4 Milliliter 1x SAB-Puffer mit niedrigem Glukosegehalt in jede Oxygraph-Kammer. Rühren Sie den Puffer kontinuierlich mit magnetischen Rührstäben in der Kammer bei 750 U/min und 37 Grad Celsius mit einem Datenaufzeichnungsintervall von 2,0 Sekunden auf.Wählen Sie dazu die Schaltfläche F7 aus, und öffnen Sie die Registerkarte mit der Bezeichnung Systeme. Schieben Sie die Stößel ganz hinein und ziehen Sie sie dann auf die Belüftungseinstellung des Schraubenschlüssels zurück. Lassen Sie die Maschine mindestens eine Stunde lang äquilibrieren, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist.Stellen Sie dann die Maschine für die Dauer des Experiments auf 37 Grad Celsius ein. Drücken Sie die Taste F7 und öffnen Sie die Registerkarte mit der Bezeichnung Oxygen O2, um die Polarisationsspannung auf 800 Millivolt mit einer Verstärkung von zwei einzustellen. Die Sauerstoffkonzentration des SAB-Puffers wird mindestens 30 Minuten lang ausgeglichen, bis die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist.Wählen Sie dann einen Bereich aus, in dem die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist, um eine Hintergrundmessung der Änderung der Sauerstoffkonzentration durchzuführen, indem Sie die Umschalttaste drücken, mit der linken Maustaste klicken und die Maus über den ausgewählten Bereich ziehen. Klicken Sie auf den Buchstaben, der mit dem ausgewählten Bereich verknüpft ist, und ändern Sie ihn in R1 für jede Spur, die jeder der beiden Kammern entspricht. Doppelklicken Sie auf das O2-Kalibrierungsfeld in der unteren linken und rechten Ecke des Bildschirms.Klicken Sie auf die Schaltfläche Select Mark für die Luftkalibrierung als R1, und wählen Sie dann für beide Kammern Kalibrieren und in die Zwischenablage kopieren aus. Als nächstes laden Sie 2,4 Milliliter Probe in jede Kammer, wobei eine Kammer mit dem Kontrollvehikel behandelte Zellen und eine Kammer mit zusammengesetzten behandelten Zellen in 1x niedrigem Glukose-SAB beladen wird. Schieben Sie den Kolben ganz hinein und saugen Sie das Restvolumen an.Rühren Sie die Zellen während des gesamten Experiments kontinuierlich bei 750 U/min und 37 Grad Celsius für alle folgenden Schritte um. Machen Sie eine Markierung, indem Sie auf F4 klicken und die Markierung beim Laden von Proben als Zellen beschriften. Messen Sie die Proben 30 Minuten lang.Nach der Signalstabilisierung ist ein Bereich der Änderung der Sauerstoffkonzentration auszuwählen, der den niedrigen Glukosebedingungen entspricht. Geben Sie dann mit einer Spritze 12,5 Mikroliter einer 45%igen sterilen Glukoselösung durch die Titan-Ladeöffnung in jede Kammer. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung Glukose, wenn die Behandlung hinzugefügt wird.Lassen Sie das Signal stabilisieren und zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist. Wählen Sie an dieser Stelle den Bereich der Änderung der Sauerstoffkonzentration aus, um den Glukosewert von 16,7 Millimolar darzustellen, der den stimulierenden Bedingungen entspricht. Nachdem die Signalstabilisierung erreicht ist, geben Sie einen Mikroliter fünf Millimolare Oligomycin A durch die Ladeöffnung in jede Kammer.Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung OligoA, wenn die Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie das Signal stabilisieren und zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist. Sobald ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist, wählen Sie diesen Bereich der Kurve aus.Oligomycin A hemmt die ATP-Synthase und daher findet der Sauerstofffluss nur durch Elektronenleck und nicht durch oxidative Phosphorylierung statt. Fügen Sie als Nächstes ein Millimolar FCCP in Schritten von einem Mikroliter hinzu, bis eine maximale Atmungsrate festgelegt ist. Dies stellt eine maximale ungekoppelte Atmung dar.Zwischen drei und vier Mikroliter FCCP reichen aus, um eine maximale ungekoppelte Atmung von INS-1-abgeleiteten 832/13-Betazellen zu induzieren. Machen Sie eine Markierung mit der Aufschrift FCCP, wenn die Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie das Signal stabilisieren und zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist.Wählen Sie dann diesen Bereich der Kurve aus. FCCP ist ein Entkopplungsmittel, das die Messung der ungekoppelten Atmung ermöglicht. Nachdem die Signalstabilisierung erreicht ist, geben Sie einen Mikroliter fünf millimolare Antimycin A durch die Ladeöffnung in jede Kammer.Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung AntiA, wenn eine Behandlung hinzugefügt wird, und wiederholen Sie das Verfahren zur Kurvenauswahl. Geben Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter ein, die im Assay verwendet werden, indem Sie die Taste F3 des Respirometer-Analyseprogramms drücken. Ändern Sie die Einheiten in Zellen pro Milliliter, geben Sie die Zellkonzentration ein und ändern Sie das Medium in SAB.Wählen Sie die Hintergrundmesswerte aus, um die Daten zu normalisieren, indem Sie das Sauerstoffkalibrierungsformular auswählen und eingeben. Treffen Sie eine Auswahl von Messwerten von 2,5 Millimolarer Glukose, 16,7 Millimolarer Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A.Geben Sie im Respirometer-Analyseprogramm die Proteinkonzentration ein und wählen Sie die entsprechenden Durchschnittswerte für jede Behandlung während der Atmungsmessung aus. Klicken Sie dann auf F2 und dann auf die Funktion In Zwischenablage kopieren.Dadurch werden die Daten exportiert, um sie in anderen Analyseprogrammen zu verwenden. Verwenden Sie die negativen Werte für die O2-Steigung für Berechnungen. Kompilieren Sie die Daten für drei bis fünf unabhängige Durchläufe von mit Vehikeln behandelten Kontrollen und mit Naturstoffen behandelten Zellen, um die Wirkung von INS-1-abgeleiteten 832/13-Betazellen auf die intakte Zellatmung zu bestimmen.Intakte INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen zeigen eine glukoseinduzierte Erhöhung der Sauerstoffverwertung. Es ist wichtig, dass die richtige Anzahl von Zellen verwendet wird. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass eine Million Zellen pro Milliliter die optimale Menge ist.INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen, die mit Curcumin behandelt wurden, zeigen keine Veränderung der Gesamtatmung. Umgekehrt wiesen INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen, die mit monomeren Kakao-Epicatechinen behandelt wurden, eine erhöhte Atmung bei 2,5 Millimolar Glucose und 16,7 Millimolar Glucose auf. Eine erhöhte Atmung wird auch während des Leckzustands, d. h. des basalen, nicht phosphorylierenden Atemzustands, sowie der Atmung des Elektronentransportsystems oder des ETS-Zustands, d. h. der maximalen Atmung, beobachtet.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Atmungsfunktion von Betazellen der Bauchspeicheldrüse unter insulinstimulierenden Bedingungen direkt beurteilen können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen mit niedrigem Glukose-SAB-Puffer vorzubehandeln und genaue Zellzahlen für den Assay zu erhalten.Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, die richtige Menge an Zellen für effektive Messungen zu erhalten. Bei zu vielen Zellen ist das Signal schwer auszuwerten, und bei zu wenigen ist das Signal nicht hoch genug, um es konsistent zu messen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose von Diabetes und allen Erkrankungen, die durch Veränderungen der Betazellfunktion der Bauchspeicheldrüse beeinflusst werden, da die mitochondriale Atmung eine entscheidende Komponente für die Funktionsweise der Insulinsekretion ist.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die glukosestimulierte Insulinsekretion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Wirkung diese Verbindungen auf die Insulinsekretion haben. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Funktion von Betazellen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Muskel-, Leber-, Fett- und andere mitochondriale Atmungsanalysen angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Hier wird eine Quadrizeps-Muskelprobe von einem anästhesierten Schwein entnommen und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Anschließend werden die Atemfrequenzen der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV mittels hochauflösender Respirometrie bestimmt.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Die Beurteilung der oxidativen Phosphorylierung mit hochauflösenden Respirometern ist zu einem integralen Bestandteil der Funktionsanalyse von Mitochondrien und zellulärem Energiestoffwechsel geworden. Hier stellen wir Protokolle für die Analyse des zellulären Energiestoffwechsels mit kammer- und mikroplattenbasierten hochauflösenden Respirometern vor und diskutieren die wichtigsten Vorteile jedes Geräts.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Bioenergetik in Zellen und Geweben mittels kammer- und plattenbasierter Respirometer

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Der Stoffwechselstatus menschlicher retinaler Pigmentepithelzellen (H-RPE) spiegelt deren Gesundheit und Funktion wider. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung des Echtzeit-Stoffwechselflusses von H-RPE mittels hochauflösender Respirometrie vorgestellt.

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Die Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik unter physiologisch relevanten Substratkonzentrationen in Immunzellen sind begrenzt. Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das hochauflösende Fluorespirometrie verwendet, um Veränderungen in der Reaktion des mitochondrialen Membranpotentials auf den Energiebedarf in menschlichen T-Zellen, Monozyten und peripheren mononukleären Zellen zu bewerten.

Hochauflösende Fluorespirometrie zur Beurteilung dynamischer Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials in menschlichen Immunzellen

Hier zeigen wir, dass die 0,5-ml-Kammer für die hochauflösende Respirometrie Ergebnisse zeigt, die mit denen der 2,0-ml-Kammer übereinstimmen, wenn eine geeignete instrumentelleO2-Hintergrundkorrektur angewendet wird. Es werden weniger Proben benötigt, was für Studien mit begrenzter Verfügbarkeit oder geringen Atmungskapazitäten von Vorteil ist.

Hochauflösende Respirometrie in einer kleinvolumigen Kammer

Erfahren Sie, wie Sie mit hochauflösender Respirometrie die mitochondriale Funktion intakter Beta-Zellen unter insulin-stimulierenden Bedingungen messen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung natürlicher Verbindungen.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

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