Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist es, die Atmungsfunktion von Betazellen der Bauchspeicheldrüse unter insulinstimulierenden Bedingungen direkt zu beurteilen. Dies kann auch verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Verbindungen auf die Atmungsfunktion der Betazellen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Physiologie der Betazellen der Bauchspeicheldrüse zu beantworten, z. B. ob eine bestimmte Verbindung die Funktion der Betazellen der Bauchspeicheldrüse über Veränderungen in der Atmung beeinflusst.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur direkten Beurteilung der Atmungsfunktion in Betazellen der Bauchspeicheldrüse unter basalen und insulinstimulierenden Bedingungen verwendet werden kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Zellvorbereitung und der maschinellen Nutzung aufgrund der erforderlichen Präzision bei der Zellvorbereitung und der Messung der Atmung schwer zu erlernen sind. Zu Beginn kultivieren Sie INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen in supplementiertem RPMI 1640.

Nehmen Sie die Zellen aus einem T75-Kolben, indem Sie zwei Milliliter 0,25%iges Trypsin hinzufügen und 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Neutralisieren Sie dann das Trypsin, indem Sie acht Milliliter des vollständigen RPMI 1640-Mediums hinzufügen. Verdünnen Sie 100 Mikroliter des Zellvolumens in 900 Mikrolitern PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Dann werden die Zellen mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter in eine 10-Zentimeter-Schale gegeben. Kultivieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, bevor Sie mit den Atmungsexperimenten beginnen. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach dem Plattieren und Kultivieren der 832/13-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Behandeln Sie dann die Zellen mit Vehikelkontrolle oder aus Kakao gewonnenem Epicatechin-Monomer für eine Endkonzentration von 100 Nanomolaren. Nach der zusätzlichen Behandlung mit einer Kultur für weitere 24 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Waschen Sie dann die Zellen fünf Minuten lang in 1x Assay-Puffer mit niedriger Glukosesekretion oder SAB.

Aspirieren Sie den Puffer und inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang in 1x niedrigem Glukose-SAB, wobei der Puffer stündlich gewechselt wird. Nach der Inkubation werden die Zellen mit einem Milliliter 0,25 % Trypsin aus der Schale genommen. Kombinieren Sie die Zellen in Trypsin aus der mit Vehikelkontrolle behandelten Schale mit vier Millilitern SAB in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Kombinieren Sie auf ähnliche Weise das mit der interessierenden Verbindung behandelte Gericht mit einem Puffer. Verdünnen Sie 100 Mikroliter des Zellvolumens in 900 Mikrolitern PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie 100 Mikroliter des Zellvolumens in 900 Mikrolitern PBS und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Die Daten zeigen, dass eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter am effektivsten ist. Nach der Vorbereitung des hochauflösenden Respirometers, wie im Textprotokoll beschrieben, geben Sie 2,4 Milliliter 1x SAB-Puffer mit niedrigem Glukosegehalt in jede Oxygraph-Kammer. Rühren Sie den Puffer kontinuierlich mit magnetischen Rührstäben in der Kammer bei 750 U/min und 37 Grad Celsius mit einem Datenaufzeichnungsintervall von 2,0 Sekunden auf.

Wählen Sie dazu die Schaltfläche F7 aus, und öffnen Sie die Registerkarte mit der Bezeichnung Systeme. Schieben Sie die Stößel ganz hinein und ziehen Sie sie dann auf die Belüftungseinstellung des Schraubenschlüssels zurück. Lassen Sie die Maschine mindestens eine Stunde lang äquilibrieren, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist.

Stellen Sie dann die Maschine für die Dauer des Experiments auf 37 Grad Celsius ein. Drücken Sie die Taste F7 und öffnen Sie die Registerkarte mit der Bezeichnung Oxygen O2, um die Polarisationsspannung auf 800 Millivolt mit einer Verstärkung von zwei einzustellen. Die Sauerstoffkonzentration des SAB-Puffers wird mindestens 30 Minuten lang ausgeglichen, bis die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist.

Wählen Sie dann einen Bereich aus, in dem die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist, um eine Hintergrundmessung der Änderung der Sauerstoffkonzentration durchzuführen, indem Sie die Umschalttaste drücken, mit der linken Maustaste klicken und die Maus über den ausgewählten Bereich ziehen. Klicken Sie auf den Buchstaben, der mit dem ausgewählten Bereich verknüpft ist, und ändern Sie ihn in R1 für jede Spur, die jeder der beiden Kammern entspricht. Doppelklicken Sie auf das O2-Kalibrierungsfeld in der unteren linken und rechten Ecke des Bildschirms.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Select Mark für die Luftkalibrierung als R1, und wählen Sie dann für beide Kammern Kalibrieren und in die Zwischenablage kopieren aus. Als nächstes laden Sie 2,4 Milliliter Probe in jede Kammer, wobei eine Kammer mit dem Kontrollvehikel behandelte Zellen und eine Kammer mit zusammengesetzten behandelten Zellen in 1x niedrigem Glukose-SAB beladen wird. Schieben Sie den Kolben ganz hinein und saugen Sie das Restvolumen an.

Rühren Sie die Zellen während des gesamten Experiments kontinuierlich bei 750 U/min und 37 Grad Celsius für alle folgenden Schritte um. Machen Sie eine Markierung, indem Sie auf F4 klicken und die Markierung beim Laden von Proben als Zellen beschriften. Messen Sie die Proben 30 Minuten lang.

Nach der Signalstabilisierung ist ein Bereich der Änderung der Sauerstoffkonzentration auszuwählen, der den niedrigen Glukosebedingungen entspricht. Geben Sie dann mit einer Spritze 12,5 Mikroliter einer 45%igen sterilen Glukoselösung durch die Titan-Ladeöffnung in jede Kammer. Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung Glukose, wenn die Behandlung hinzugefügt wird.

Lassen Sie das Signal stabilisieren und zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist. Wählen Sie an dieser Stelle den Bereich der Änderung der Sauerstoffkonzentration aus, um den Glukosewert von 16,7 Millimolar darzustellen, der den stimulierenden Bedingungen entspricht. Nachdem die Signalstabilisierung erreicht ist, geben Sie einen Mikroliter fünf Millimolare Oligomycin A durch die Ladeöffnung in jede Kammer.

Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung OligoA, wenn die Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie das Signal stabilisieren und zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist. Sobald ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist, wählen Sie diesen Bereich der Kurve aus.

Oligomycin A hemmt die ATP-Synthase und daher findet der Sauerstofffluss nur durch Elektronenleck und nicht durch oxidative Phosphorylierung statt. Fügen Sie als Nächstes ein Millimolar FCCP in Schritten von einem Mikroliter hinzu, bis eine maximale Atmungsrate festgelegt ist. Dies stellt eine maximale ungekoppelte Atmung dar.

Zwischen drei und vier Mikroliter FCCP reichen aus, um eine maximale ungekoppelte Atmung von INS-1-abgeleiteten 832/13-Betazellen zu induzieren. Machen Sie eine Markierung mit der Aufschrift FCCP, wenn die Behandlung hinzugefügt wird. Lassen Sie das Signal stabilisieren und zeichnen Sie die Zellatmung auf, bis ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist.

Wählen Sie dann diesen Bereich der Kurve aus. FCCP ist ein Entkopplungsmittel, das die Messung der ungekoppelten Atmung ermöglicht. Nachdem die Signalstabilisierung erreicht ist, geben Sie einen Mikroliter fünf millimolare Antimycin A durch die Ladeöffnung in jede Kammer.

Machen Sie eine Markierung mit der Bezeichnung AntiA, wenn eine Behandlung hinzugefügt wird, und wiederholen Sie das Verfahren zur Kurvenauswahl. Geben Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter ein, die im Assay verwendet werden, indem Sie die Taste F3 des Respirometer-Analyseprogramms drücken. Ändern Sie die Einheiten in Zellen pro Milliliter, geben Sie die Zellkonzentration ein und ändern Sie das Medium in SAB.

Wählen Sie die Hintergrundmesswerte aus, um die Daten zu normalisieren, indem Sie das Sauerstoffkalibrierungsformular auswählen und eingeben. Treffen Sie eine Auswahl von Messwerten von 2,5 Millimolarer Glukose, 16,7 Millimolarer Glukose, Oligomycin A, FCCP und Antimycin A.Geben Sie im Respirometer-Analyseprogramm die Proteinkonzentration ein und wählen Sie die entsprechenden Durchschnittswerte für jede Behandlung während der Atmungsmessung aus. Klicken Sie dann auf F2 und dann auf die Funktion In Zwischenablage kopieren.

Dadurch werden die Daten exportiert, um sie in anderen Analyseprogrammen zu verwenden. Verwenden Sie die negativen Werte für die O2-Steigung für Berechnungen. Kompilieren Sie die Daten für drei bis fünf unabhängige Durchläufe von mit Vehikeln behandelten Kontrollen und mit Naturstoffen behandelten Zellen, um die Wirkung von INS-1-abgeleiteten 832/13-Betazellen auf die intakte Zellatmung zu bestimmen.

Intakte INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen zeigen eine glukoseinduzierte Erhöhung der Sauerstoffverwertung. Es ist wichtig, dass die richtige Anzahl von Zellen verwendet wird. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass eine Million Zellen pro Milliliter die optimale Menge ist.

INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen, die mit Curcumin behandelt wurden, zeigen keine Veränderung der Gesamtatmung. Umgekehrt wiesen INS-1-abgeleitete 832/13-Betazellen, die mit monomeren Kakao-Epicatechinen behandelt wurden, eine erhöhte Atmung bei 2,5 Millimolar Glucose und 16,7 Millimolar Glucose auf. Eine erhöhte Atmung wird auch während des Leckzustands, d. h. des basalen, nicht phosphorylierenden Atemzustands, sowie der Atmung des Elektronentransportsystems oder des ETS-Zustands, d. h. der maximalen Atmung, beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Atmungsfunktion von Betazellen der Bauchspeicheldrüse unter insulinstimulierenden Bedingungen direkt beurteilen können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen mit niedrigem Glukose-SAB-Puffer vorzubehandeln und genaue Zellzahlen für den Assay zu erhalten.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, die richtige Menge an Zellen für effektive Messungen zu erhalten. Bei zu vielen Zellen ist das Signal schwer auszuwerten, und bei zu wenigen ist das Signal nicht hoch genug, um es konsistent zu messen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose von Diabetes und allen Erkrankungen, die durch Veränderungen der Betazellfunktion der Bauchspeicheldrüse beeinflusst werden, da die mitochondriale Atmung eine entscheidende Komponente für die Funktionsweise der Insulinsekretion ist.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die glukosestimulierte Insulinsekretion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Wirkung diese Verbindungen auf die Insulinsekretion haben. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Funktion von Betazellen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Muskel-, Leber-, Fett- und andere mitochondriale Atmungsanalysen angewendet werden.