Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe einer hochauflösenden Respirometrie den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei den Syndromen und Krankheiten zu beantworten, die mit mitochondrialer Dysfunktion verbunden sind, wie zum Beispiel: Sepsis, diverse neurologische Erkrankungen und altersbedingte Störungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine höhere Empfindlichkeit aufweist und die Möglichkeit bietet, Substrat-on-Coupled-Inhibitor-Titrationsexperimente mit einer kleinen Anzahl biologischer Proben wie intakten oder permeabilisierten Zellen durchzuführen.

Das Verfahren wird von Sandra Nansoz, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Vor Beginn des Eingriffs werden die polarographischen Sauerstoffsensoren mit Luft kalibriert, dann werden die Zellen im Atmungspuffer auf eine Konzentration von eins mal zehn bis sechs Zellen pro Milliliter resuspendiert und das Atmungsmedium in einer Kammer des Oxygraphen durch 2,1 Milliliter der Zellsuspension ersetzt. Verschließen Sie die Kammer mit dem Stopfen und stellen Sie den Magnetrührstab in der Kammer auf 700 Umdrehungen pro Minute ein.

Zeichnen Sie dann die Zellatmung 5 bis 10 Minuten lang auf, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist. Injizieren Sie anschließend mit einer Spritze zwei Mikroliter Rotenon durch die Titan-Injektionsöffnung in die Oxygraphenkammer und zeichnen Sie die Zellatmung für weitere 5 bis 10 Minuten auf. Wenn ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist, injizieren Sie 20 Mikroliter eines molaren Succinats, gefolgt von 10 Mikrolitern 0,5 molaren ADP.

Injizieren Sie dann zwei Volumina von zwei Mikrolitern von zwei Millimolaren Digitonin und zeichnen Sie die Zellatmung für zwei bis fünf Minuten nach jeder Injektion auf, gefolgt von der schrittweisen Injektion von zwei bis vier Mikrolitern von zwei Millimolaren Digitonin, bis das Sauerstoffflusssignal den Höchstwert erreicht und weitere Digitonin-Injektionen die Atmungsrate nicht erhöhen. Zur Beurteilung der Integrität der mitochondrialen Außenmembran bereiten Sie eine Oxygraphenkammer vor, wie gerade gezeigt, und injizieren Sie zwei Mikroliter achtmillimolares Digitonin, um die Zellen zu permeabilisieren. Nach fünf Minuten injizieren Sie 20 Mikroliter eines molaren Succinats und zeichnen Sie die Zellatmung 5 bis 10 Minuten lang auf, bis ein stabiles Sauerstoffflusssignal erreicht ist.

Injizieren Sie dann 10 Mikroliter 0,5 molare ADP, um den zweiten Komplex zu stimulieren und einen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs zu induzieren. Wenn ein stabiles Flusssignal erreicht ist, injizieren Sie fünf Mikroliter vier Millimolare Cytochrom c, gefolgt von einem Mikroliter vier Milligramm pro Milliliter Ligamycin. Um die ADP-stimulierte Atmung der hepatozellulären Karzinomzellen der Leber zu messen, bereiten Sie eine Oygraphenkammer vor, wie gerade gezeigt, und injizieren Sie zwei Mikroliter achtmillimolares Digitonin in die Sauerstoffkammer, um die Zellen fünf Minuten lang zu permeabilisieren, gefolgt von der Injektion von 12,5 Mikrolitern 0,8 molaren Mallade und 10 Mikrolitern zweimolaren Glutamat.

Wenn ein stabiler Sauerstofffluss erreicht ist, injizieren Sie 10 Mikroliter 0,5 molare ADP, um den Sauerstoffverbrauch zu erhöhen, gefolgt von zwei Mikrolitern 0,2 millimolaren Rotenon und 20 Mikrolitern einem molaren Succinat. Injizieren Sie anschließend zwei Mikroliter fünf Millimolare Antimycin und zeichnen Sie die Zellatmung auf. Wenn das Signal abnimmt und sich stabilisiert, injizieren Sie 2,5 Mikroliter 0,8 Millimolare Escorbat, gefolgt von der sofortigen Injektion von 2,5 Mikrolitern 0,2 Millimolar TMPD, wobei die Zellatmung aufgezeichnet wird, bis das Sauerstoffflusssignal zunimmt und sich stabilisiert

Injizieren Sie dann 10 Mikroliter eines molaren Natriumazits in die Oxygraph-Kammer und zeichnen Sie die zelluläre Aspiration auf, bis das Sauerstoffflusssignal abnimmt und sich stabilisiert. Um den Sauerstoffverbrauch intakter Zellen zu messen, bereiten Sie eine Oxygraphenkammer vor, wie gerade gezeigt, und injizieren Sie 1 Mikroliter mit vier Milligramm pro Milliliter Aligimicyn, gefolgt von einem und drei Mikrolitern Injektionen mit 0,2 Millimolar FCCP. Als nächstes titrieren Sie das FCCP in Schritten von 0,1 bis 0,3 Mikromolaren, indem Sie ein bis drei Mikroliter 0,2 bis 1 Millimolar FCCP injizieren, bis das Sauerstoffflusssignal sein maximales Niveau ohne weitere Erhöhungen erreicht und dann zu sinken beginnt.

Injizieren Sie dann zwei Mikroliter 0,2 millimolares Rotenon und zwei Mikroliter fünf millimolare Antimycin A und zeichnen Sie die Atmung auf, bis das Sauerstoffflusssignal abnimmt und sich stabilisiert. In Abwesenheit von Digitonin ist die Zellatmung sehr gering, und die Atmung intakter, nicht permeabilisierter Zellen wird in Gegenwart von mitochondrialem Substrat und ADP nicht stimuliert. Bei schrittweiser Zugabe von Digitonin wird jedoch die zelluläre Plasmamembran permeabilisiert und die mitochondriale Atmung nimmt zu, bis zur vollständigen Permeabilisierung, woraufhin das Succinat und ADP in die Zellen gelangen.

Integrität der mitochondrialen Außenmembran kann jedoch beeinträchtigt werden, wenn übermäßige Mengen an Digitonin verwendet werden, was zu einer Verringerung der Atmung im komplexen bis abhängigen Zustand 3 führt. Cytochrom c verbessert nicht die Atmung des komplexen bis abhängigen Zustands 3 in mit Digitonin behandelten Zellen, was darauf hindeutet, dass es keinen Verlust von Cytochrom c aus der mitochondrialen Außenmembran gibt und dass die mitochondriale Integrität erhalten bleibt, obwohl Cytochrom c die Atmung von Zellen verbessern kann, die mit sehr hohen Dosen von Digitonin behandelt wurden. Die Zugabe von exogenen Substraten der mitochondrialen Komplexaktivität nach der Digitonin-Permeablisierung induziert eine Erhöhung der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe eins, zwei und vier maximale Atemfrequenzen.

Die Erzeugung reduzierter Atemwerte kann auf eine Kontamination der Oxygraphenkammern mit mitochondrialen Inhibitoren aus dem vorherigen Experiment zurückzuführen sein. In Gegenwart von Alygimycin und der sequentiellen Zugabe von FCCP wird die maximale entkoppelte Atemfrequenz der Zellen beobachtet. Einmal gemeistert, kann jede dieser Techniken in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, sich nach jedem Experiment ausgiebig an die Waschen von Oxygraphenkammern und Stopfen zu erinnern. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. Messungen des zellulären ATP-Gehalts, die jeweils in der kymatischen Aktivität und den mitochondrialen Substratspiegeln vorhanden sind, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob Veränderungen der Atemfrequenz auf einen Mangel an mitochondrialen Substraten oder eine verminderte ATP-Cyntataktivität zurückzuführen sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Bionegetik, um die mitochondriale Funktion in Bereichen wie erworbenen und genetischen mitochondrialen Erkrankungen, oxidativem Stress, Hautdurchblutungsverletzungen und Alterung in intakten oder permeabilisierten Zellen oder Fasern und isolierten Mitochondrien zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mitochondrienfunktion in permeabilisierten und intakten Zellen mithilfe der hochauflösenden Respirometrie unterstützen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Antimycin a, Rotenon, Natriumiozid, FCCP und Aricomycin äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.