Name: Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die Haltung von Türkis-Killifischen im Labor für Alterungsforschung. Dieses Protokoll ermöglicht Hochdurchsatzstudien zu genetischen und Umweltfaktoren bei Nothobranchius furzeri.

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Wir danken Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar und allen Mitgliedern des Valenzano Labor am Max-Planck-Institut für Biologie des Alterns für Ihren Beitrag zu verschiedenen Aspekten des derzeitigen Killifische Tierhaltung Protokolls im Laufe der Jahre.

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine finanzielle und nicht finanzielle Interessenkonflikte.

Wir beschreiben ein Protokoll für das Labor züchten von Türkis Killifische, einschließlich Embryo Sammlung sowie Inkubation und ausgewachsenen Fischen Gehäuse, Zucht und Fütterung. Unser Protokoll richtet sich speziell an Labore, die forschen konzentrierten sich auf Erwachsene Fische, insbesondere für experimentelle Studien über das Altern und Lebensdauer. Türkis Killifische kann auf standard Zebrafisch-Anlage angehoben werden; wichtige Aspekte der Tierhaltung Killifische unterscheiden sich jedoch von standard Zebrafisch Pflege16. Diese Anpassungen umfassen frühen Übergang von Artemia nur Diät zu einer Ernährung mit Protein-reiche Blut Wurm als auch spezifische Schritte im Embryo Inkubation, bestehend aus einer flüssigen und trockenen Inkubation Bühne ergänzt.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls beinhalten Versand Embryonen im 8-30 ° C Temperaturbereich. Fruchtbarkeit hängt bei Zucht, Fütterung, Frequenz und Qualität des Essens; Wir empfehlen daher, mindestens zwei Fütterungen pro Tag pro Zucht Tank um Embryonen Ertrag (siehe Abschnitt 5.6) zu erhöhen. Während der Embryo zu bleichen, verlängern Sie Embryo Inkubation im Bleichbad nicht. Dies kann Schäden am Ei Chorion und erhöhte Embryo Sterblichkeit führen. Wenn Embryonen mit Methylenblau Inkubation, nicht verlängern Sie, Inkubation von bereit-zu-Luke Embryonen länger als 2 Wochen, da ihre Überlebensfähigkeit drastisch verringert wird. Für Schraffur Türkis Killifische, niedriger Temperatur von Huminsäure saure Lösung verbessert die Schraffur und vollständiges Eintauchen des Embryos in der Lösung ermöglicht synchronisierten Schlupf. Nicht ausreichende Belüftung während der Inkubation resultiert hohe Raten von Fry nicht in der Lage, die Gas-Blase zu füllen ("Bauch-Schieber" Phänotyp, siehe Hinweise in Abschnitt 5.1).
Einschränkung des Protokolls für die Zucht umfasst den Einsatz von Sand Substrat welche Herausforderungen auf zentrale Filteranlagen und sollte in Zukunft durch alternative Methoden ersetzt werden. Mögliche Alternativen könnte die Verwendung von Zebrafisch Zucht Panzer. Embryo bleichen könnte wichtige physikalisch-chemische Veränderungen in der Ei-Chorion, die veränderten Chorion Physiologie und Schraffur Erfolg führen könnte. Ständiger Exposition von Embryonen zu Methylenblau kann langfristige Veränderungen der Erwachsenen Fische Physiologie induzieren. Erhöhung der Erwachsenen Fische in einzelnen Tanks für Überleben Kohortenstudien könnten Fisch Verhalten und Gesundheit beeinträchtigen. Gruppenhaltung für Überleben Kohortenstudien fügt jedoch erhebliche Störfaktoren durch die Etablierung der sozialen Dominanz und männlicher Gebiete führt zu strengen sozialen Hierarchien. Daher beurteilen wir, dass Isolation von männlichen Fischen für Überleben Studien ein vernünftiger Kompromiss ist. Fütterung Labor Killifische Kolonien mit Lebendfutter aus UN-kontrollierten Quellen fügen Sie ein Risiko für externe Verunreinigungen von Parasiten und potenziell pathogenen mikrobieller Gemeinschaften. In Zukunft sollte eine ad-hoc-sterile Fischfutter entwickelt werden.
Zukünftige Verbesserungen dieses Protokolls konzentriert sich auf eine kontrollierte, nicht-live Diät führt nach wie vor Abschluss der Geschlechtsreife innerhalb von 3-4 Wochen. Zusammenfassend bietet unser Protokoll Zugänglichkeit zum türkisblauen Killifische Labor Kultivierung einer breiten Fachöffentlichkeit.

Aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und schnelle Lebenszyklus, sind türkis Killifische als vielversprechende neue Modellorganismus in der Biologie1,2,3rasant. Diese Art zeichnet sich durch einen einzigartigen Lebenszyklus für eine teleost, bestehend aus embryonalen Diapause, schnelle sexuelle Reifung und eine verlängerte post-reproductive Lebensdauer Stufe4,5. Den letzten Arbeit hat dazu beigetragen, Aufklärung die Biologie dieser Arten in Gefangenschaft und im wilden6,7. Türkis Killifische Leben in saisonalen frischen Gewässer dieser Form während der Regenzeit in der afrikanischen Savanne in Simbabwe und Mosambik. Während der Trockenzeit überleben Embryonen im trockenen Schlamm in Abwesenheit von Wasser durch eine Stress-resistente Lebensstadium Diapause genannt.
Genetische Karten für diese Spezies wurden generierten8,9, und vor kurzem wurde ihr Genom sequenziert und montierten10,11. Mehreren Inzucht laborbelastungen Fisch entwickelt worden und Transgenese und Genom Bearbeitung via CRISPR/Cas9 sind verfügbar in dieser Spezies, de-facto- Förderung Türkis Killifische als wettbewerbsfähige Labor vertebrate Modellorganismus geworden 12,13,14.
Obwohl ein Laborprotokoll für diese Arten15bereits veröffentlicht worden, in diesem Protokoll entwickeln wir eine umfassende Liste von experimentellen Labor-Richtlinien, die speziell auf Studien, die untersuchen, Alterung und überleben. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern bereits vertraut mit Zebrafisch und Medaka Tierhaltung in Türkis Killifische Zucht bewandert werden durch die Annahme einer Mindestanzahl von wesentliche Anpassungen. Zur gleichen Zeit bietet dieses Protokoll Forschern ohne Vorkenntnisse in Fisch Zucht mit wichtigen Tools um eine blühende Kolonie Türkis Killifische zu erhöhen.

<table><tbody><tr><td>Sondenkalibrierpufferlösung pH=7,0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>1L Pufferlösung pH=7,0 zur Kalibrierung des Wassersystems pH-Elektrode</td></tr><tr><td>Sondenkalibrierpufferlösung pH=4,0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>1L Pufferlösung pH=4,0 zur Kalibrierung des Wassersystems pH-Elektrode</td></tr><tr><td>Leitfähigkeitsnormal</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL Leitfähigkeitsstandard 1.413 uS/cm zur Kalibrierung des Wassersystems Leitfähigkeits-Elektrode</td></tr><tr><td>Easy Strips Test 6in1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>Teststreifen zur Bestimmung der Chlorwerte von Systemwasser</td></tr><tr><td>Ammoniak Test</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>Test zur Bestimmung des Ammoniakgehalts von Systemwasser</td></tr><tr><td>Rotes Meer Salz</td><td>Rotes Meer</td><td></td><td>22 kg</td></tr><tr><td>Eimer Natriumhydrogencarbonat</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>Huminsäure</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>Neu HUFA Artemia Anreicherung</td><td>ZM Systems UK</td><td></td><td>75g Flasche</td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxidlösung</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>Kokosfaser</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papier</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol rein</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr> <tr><td>Quarzsand</td><td>lokale Zoohandlung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artemia Eier Premium</td><td>Grade Schleifmaschinen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blutwurm</td><td>lokaler Händler</td><td></td><td>Poseidon Aquakultur Deutschland</td></tr><tr><td>dNTPs Lösungsmischung</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq DNA-Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/uL</td></tr><tr><td>PCR 10x Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8,0 Lösung</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Aquarien</td><td>Aquaneering-Volumen</td><td></td><td>: 0,8 l, 2,8 l, 9,5 l; ausgestattet mit Leitblechen, Frittiernetz und Deckeln</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>Modell 5000</td></tr><tr><td>Mikrobiologischer Inkubator</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>Modell IMC18; für die Lagerung von Embryonen in der flüssigen Phase, eingestellt auf t=27-28°; C</td></tr><tr><td>Kühlinkubator</td><td>Binder</td><td>9020-0209</td><td>Modell KT115; für die Lagerung von Embryonen in der festen Phase, eingestellt auf t=27-28°; C</td></tr><tr><td>Brutbrutapparat</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>Modell OGS180; für schlüpfende Embryonen auf t=27-28°; C</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Modell M80</td></tr><tr><td>Zuchtsand/Brutkästen</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 mL Konisches Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteurpipette aus Kunststoff</td><td>Roth</td><td>EA71.1</td><td>2 ml; Für die Fütterung von Fischen mit Blutwürmern oder Embryonen Selektion schneiden Sie die Spitze ab, um sie zu öffnen</td></tr><tr><td>Serologische Pipette</td><td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>50mL</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10mL</td></tr><tr><td>Metallsieb</td><td></td><td></td><td>Feinheit < 1 mm; für die Entnahme von Embryonen</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>Typ5/45; für Embryotransfer</td></tr><tr><td>25 L Salinengarnelen-Brutstätte</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>Hauptbrutstätte</td></tr><tr><td>500 mL Salinengarnelen-Brutmaschine</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>Modell Artemio 1; Backup-Schlupfmaschine</td></tr><tr><td>Engmaschige Fischernetze</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandbecher</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000mL</td></tr><tr><td>Salinengarnelen Trennbecher</td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>Kunststoff Reißverschlusstasche</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>zur Aufbewahrung von toten Fischen</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>Modell Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>Luftschlauch</td><td></td><td>www.zajac.de AQ380</td><td>4-6 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>1 L Glasflasche</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L Glasflasche</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Quetschflasche</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>für die Fischfütterung mit Artemie</td></tr><tr><td>Garnelen 120-&#956; m Salzgarnelensieb</td><td>Florida Aqua Farms</td><td>BB-PC2</td><td>für die Sammlung von Salzgarnelen/Blutwürmern</td></tr><tr><td>Finish Filtersocken</td><td>Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td>25-&#956; m</td></tr><tr><td>Zentrale Filterung Haltungssystem</td><td></td><td></td> für <td>Fische Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

ein protokoll für labor housing von türkis killifische (nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

Die Entwicklung von Tierhaltungspraktiken in Labor-Modell Fisch für experimentelle Zwecke hat profitiert von der Gründung des Referenz-Fisch Modellsysteme wie Zebrafisch und Medaka. In den letzten Jahren hat eine wachsende Zahl von Forschungsgruppen in den Bereichen der Biologie des Alterns und Ökologie einer aufstrebenden Fisch – die türkisfarbenen Killifische (Nothobranchius Furzeri) – angenommen. Mit einer Gefangenschaft Lebensdauer von 4 bis 8 Monate diese Art ist die kurzlebigsten Wirbeltier in Gefangenschaft angehoben und ermöglicht die wissenschaftliche Gemeinschaft Test – in kurzer Zeit – experimentelle Interventionen, die zu Veränderungen des Alterns Rate und Lebenserwartung führen können. Angesichts die einzigartigen Biologie dieser Art, gekennzeichnet durch embryonale Diapause markiert explosive sexuelle Reifung, morphologische und Verhaltensstörungen Geschlechtsdimorphismus- und ihrer relativ kurzen Erwachsenen Lebensdauer - ad-hoc- Tierhaltung sind Praktiken in dringenden Nachfrage. Dieses Protokoll berichtet eine Reihe von wichtigen Tierhaltung Maßnahmen, mit denen optimale Türkis Killifische Labor Pflege, Aktivierung der wissenschaftlichen Gemeinschaft, diese Spezies als ein leistungsfähiges Labor Tiermodell anzunehmen.

Türkis Killifische richtige Haltung führt mediane Überlebenszeit zwischen 12-18 Wochen in der GRZ Belastung (z. B. Abbildung 4A). Variationen der mediane Überlebenszeit abhängig von Ernährung, Fütterung Frequenz und Temperatur Wohnbedingungen. Schlechte Haltung führt zu überleben Kurven präsentiert erhöht frühe Sterblichkeit und repetitive, plötzlichen Tropfen des Überlebens im Laufe der Zeit zeichnet sich durch mehrere Wendepunkte (Abbildung 4 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative embryonalen Entwicklungsstufen mit entsprechenden Inkubation Substrat. (A) frisch gesammelten Embryonen, inkubiert in Methylenblau-Lösung im Inkubator bei 28 ° C. (B) Embryonen bereit, auf festem Medium übertragen werden entweder Papier oder Kokos Faser filtern. (C) Embryonen bereit, die schraffiert werden, typische golden IRIS anzeigen. Der Maßstab ist gleich bis 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg"> Abbildung 2: Phasen des türkisfarbenen Killifische nach dem Schlüpfen Entwicklung. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Fisch ID-Tag für Fische aus Stufe 3 ab. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative überleben Kurve für 70 männlichen Türkis Killifische. (A) typische überleben Kurve für Labor-raiste Türkis Killifische. (B) Vergleich der überleben Kurven gewonnenen Fische unter optimalen Haltungsbedingungen (schwarz) angehoben und schlechte Tierhaltung (rot und blau). Die gestrichelte rote horizontale Linie gibt 50 % überleben, sich überschneidenden überleben Kurve an mittlere Lebensdauer (auf der x-Achse angegeben). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Forward primer</td>
			<td colspan="2">Rückwärts-primer</td>
			<td>Größenbereich (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166 - 214</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220 - 272</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209 - 240</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198 - 238</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164 - 226</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196 - 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252 - 295</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216 - 248</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174 - 205</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355 - 373</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">* - sex Bestimmung Marker</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Genotypisierung Zündkapseln für Stamm-Identifikation.

Labor-Gehäuse von Türkis, die Killifische unterzubringen und effizient erhöhen Tausende von einzelnen Fische in eine zentralisierte Wasserfilter-System, mit der gleichen Infrastruktur für standard Zebrafisch genutzt skaliert werden kann. Hier zeigen wir eine Liste von standardisierten Verfahren, die effiziente Killifische Wartung ermöglichen.

Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, erfolgreich eine Laborkolonie von türkisfarbenen Killifischen zu züchten, um das Altern und altersbedingte Krankheiten in einem schnellen und hohen Durchsatz zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Alterns zu beantworten, z. B. ob einzelne Genmutationen oder Umwelteingriffe den Alterungsprozess bei Wirbeltierarten modulieren können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass durch die Befolgung unserer grundlegenden Protokolle nun mehrere Laboratorien Experimente mit türkisfarbenen Killifischen durchführen können.Im Allgemeinen werden Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Killifische-Zucht einige einzigartige Merkmale aufweist. Zum Beispiel werden Embryonen vor dem Schlüpfen auf einem trockenen Substrat aufgezogen, was sich stark von kanonischen Fischmodellen wie dem Zebrafisch unterscheidet. Richten Sie zunächst 9,5-Liter-Zuchtbecken mit jeweils einem fünf Wochen alten Rüden und zwei sechs bis sieben Wochen alten Hündinnen ein.Befüllen Sie dann einen etwa zwei bis drei Zentimeter tiefen Plastikbehälter mit autoklaviertem Sand und stellen Sie den Sandkasten in die Mitte des Aufzuchtbeckens. Lassen Sie den Türkis-Killifisch kontinuierlich brüten und entnehmen Sie einmal pro Woche Embryonen für die Embryoneninkubation. Um Embryonen im Zellstadium zu entnehmen, die für die Injektion und Erzeugung transgener Linien verwendet werden, richten Sie ein Zuchtbecken mit einem männlichen und zwei weiblichen Fischen ein, wie gerade gezeigt.Setzen Sie das Männchen zwei Tage vor der Embryoentnahme in ein einzelnes Becken um und halten Sie es in Sichtkontakt mit den erwachsenen Weibchen. Am Tag der Entnahme stellen Sie das Männchen und einen Sandkasten in das Zuchtbecken und lassen Sie die Fische zwei Stunden lang laichen. Nachdem du den Sandkasten gespawnt und aus dem Tank genommen hast, entleere den Sandkasten in ein Sieb und verwende Systemwasser, um ihn zu spülen.Tauchen Sie dann das Sieb teilweise in Systemwasser und schwenken Sie es vorsichtig, so dass sich die Embryonen in der Mitte gruppieren. Entnehmen Sie die Embryonen mit einer Zwei-Milliliter-Pasteur-Pipette und geben Sie sie in eine 90-Millimeter-Petrischale mit etwa 40 Millilitern Systemwasser. Untersuchen Sie unter einem Lichtmikroskop die Embryonen in der Petrischale und entfernen Sie diejenigen, die ein gerissenes Chorion und Anzeichen von Schäden aufweisen.Nach dem Bleichen der Embryonen gemäß dem Textprotokoll untersuchen und entfernen Sie alle toten Embryonen, die blau gefärbt werden könnten. Nachdem die Embryonen in frischer Methylenblaulösung inkubiert wurden, überprüfen Sie, ob die entwickelten Embryonen sichtbare schwarze Augen haben. Übertragen Sie dann die Embryonen mit einer Einwegpipette von Pasteur oder einer feinen gebogenen Pinzette auf eine Filterpappplatte.Bewahren Sie alle unentwickelten Embryonen in Methylenblau auf und überwachen Sie sie täglich. Sobald sich schwarze Augen entwickelt haben, übertragen Sie sie auf festes Substrat. Spreizen Sie die Embryonen mit einer Pinzette im Abstand von etwa fünf Millimetern bis zu 100 Embryonen pro 90-Millimeter-Platte.Dann verschließen Sie die Schale mit Paraffin und inkubieren die Embryonen zwei bis drei Wochen lang bei 28 Grad Celsius, bis sie ihre goldene Iris voll entwickelt haben und bereit zum Schlüpfen sind. Für die Langzeitlagerung bis zu einem Jahr werden die Embryonen nach dreitägiger Inkubation in Methylenblau-Lösung wie gerade gezeigt auf feste Substrat-Mediumplatten übertragen und bei 17 Grad Celsius inkubiert. Um die Fische auszubrüten, verwenden Sie eine feine gebogene Pinzette, um 50 bis 100 entwickelte Embryonen vorsichtig in die Brutbox zu übertragen und sie vollständig in Huminsäurelösung zu tauchen, die nicht tiefer als zwei Zentimeter bei vier Grad Celsius ist.Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist das Schlüpfen von Killifischen-Embryonen, der durch den Transfer von Embryonen, die auf einem trockenen Substrat inkubiert wurden, in eine Huminsäure-haltige Brutlösung mit ausreichender Belüftung erreicht wird. Decken Sie den Brutkasten mit einem Deckel ab und brüten Sie ihn bei 28 Grad Celsius in einem Brutkasten aus. Um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, schließen Sie die Box an eine Luftzufuhr mit Schläuchen an.Um eine angemessene Wasserqualität in der Brutbox zu erhalten, füllen Sie die Box ab dem Tag nach dem Schlüpfen einmal täglich mit einem Verhältnis von eins zu eins autoklaviertem Systemwasser auf, wobei Sie eine Endtiefe von zwei Zentimetern beibehalten sollten. Übertragen Sie alle noch nicht geschlüpften Embryonen zurück in das feste Substrat und versuchen Sie, eine Woche später zu schlüpfen. Um Jungfische und erwachsene Fische fünf Tage nach dem Schlüpfen aufzuziehen, bringen Sie die Jungtiere mit Einweg-Plastikpipetten oder einem Plastiklöffel vorsichtig in das Wasserkreislaufsystem, indem Sie fünf Jungtiere pro 0,8-Liter-Tank vorsichtig umsetzen, der mit einem 400-Mikrometer-Brutsieb ausgestattet ist.Im Alter von 14 Tagen werden die Jungfische in ein 2,8-Liter-Aquarium umgesiedelt, das mit einem 850-Mikrometer-Brutsieb ausgestattet ist. Von diesem Zeitpunkt an beschriften Sie jedes Aquarium mit einer Fisch-ID.Für Überlebenstests halten Sie jeden Fisch einzeln in einem einzigen Tank. Fische, die für Überlebenstests gezüchtet werden, werden ebenfalls einzeln in einem 2,8-Liter-Tank untergebracht.Füttern Sie die Jungtiere in den folgenden sieben Tagen zweimal täglich mit fünf Millilitern Salinengarnelen, die mit ein bis drei lebenden Blutwürmern ergänzt werden. Im Alter von vier Wochen füttern Sie jeden Fisch zweimal täglich mit Salinengarnelen und einem Milliliter Blutwürmern. Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass der Fisch die vollständige sexuelle Reife erreicht, indem Sie bei den Männchen auf das Vorhandensein großer Rücken-, After- und Schwanzflossen mit Anzeichen von Färbung und bei den Weibchen auf runde Hinterleiben voller Eier prüfen.Hier ist eine repräsentative Überlebenskurve für 70 männliche türkisfarbene Killifische zu sehen. Bei richtiger Haltung ergibt sich ein medianes Überleben von 12 bis 28 Wochen im GRZ-Stamm. Die Schwankungen des medianen Überlebens hängen von der Ernährung, der Fütterungshäufigkeit und den Bedingungen der Stalltemperatur ab.Die Überlebenskurve für Fische, die unter schlechten Haltungsbedingungen aufgezogen wurden, zeigt einen Anstieg der frühen Sterblichkeit und einen wiederholten plötzlichen Rückgang des Überlebens im Laufe der Zeit im Vergleich zu Fischen, die unter optimalen Haltungsbedingungen aufgezogen wurden. Bei der Befolgung dieses Protokolls ist es wichtig, den Wasserzustand und das überschüssige Futter von frisch geschlüpften Jungfischen genau zu überwachen, da es wichtig ist, dass diese in einer sauberen Umgebung aufbewahrt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, experimentelle Manipulationen an türkisfarbenen Killifischen zu erforschen, einschließlich Transgenese, Genom-Editierung und Ernährungsmanipulationen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Türkis-Killifische erfolgreich im Labor aufzieht, und dieses Modell verwenden, um die Biologie des Alterns bei den kurzlebigsten Wirbeltieren zu erforschen, die in Gefangenschaft aufgezogen werden können.

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JoVE Journal

Biology

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