Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri)

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, erfolgreich eine Laborkolonie von türkisfarbenen Killifischen zu züchten, um das Altern und altersbedingte Krankheiten in einem schnellen und hohen Durchsatz zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Alterns zu beantworten, z. B. ob einzelne Genmutationen oder Umwelteingriffe den Alterungsprozess bei Wirbeltierarten modulieren können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass durch die Befolgung unserer grundlegenden Protokolle nun mehrere Laboratorien Experimente mit türkisfarbenen Killifischen durchführen können.

Im Allgemeinen werden Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Killifische-Zucht einige einzigartige Merkmale aufweist. Zum Beispiel werden Embryonen vor dem Schlüpfen auf einem trockenen Substrat aufgezogen, was sich stark von kanonischen Fischmodellen wie dem Zebrafisch unterscheidet. Richten Sie zunächst 9,5-Liter-Zuchtbecken mit jeweils einem fünf Wochen alten Rüden und zwei sechs bis sieben Wochen alten Hündinnen ein.

Befüllen Sie dann einen etwa zwei bis drei Zentimeter tiefen Plastikbehälter mit autoklaviertem Sand und stellen Sie den Sandkasten in die Mitte des Aufzuchtbeckens. Lassen Sie den Türkis-Killifisch kontinuierlich brüten und entnehmen Sie einmal pro Woche Embryonen für die Embryoneninkubation. Um Embryonen im Zellstadium zu entnehmen, die für die Injektion und Erzeugung transgener Linien verwendet werden, richten Sie ein Zuchtbecken mit einem männlichen und zwei weiblichen Fischen ein, wie gerade gezeigt.

Setzen Sie das Männchen zwei Tage vor der Embryoentnahme in ein einzelnes Becken um und halten Sie es in Sichtkontakt mit den erwachsenen Weibchen. Am Tag der Entnahme stellen Sie das Männchen und einen Sandkasten in das Zuchtbecken und lassen Sie die Fische zwei Stunden lang laichen. Nachdem du den Sandkasten gespawnt und aus dem Tank genommen hast, entleere den Sandkasten in ein Sieb und verwende Systemwasser, um ihn zu spülen.

Tauchen Sie dann das Sieb teilweise in Systemwasser und schwenken Sie es vorsichtig, so dass sich die Embryonen in der Mitte gruppieren. Entnehmen Sie die Embryonen mit einer Zwei-Milliliter-Pasteur-Pipette und geben Sie sie in eine 90-Millimeter-Petrischale mit etwa 40 Millilitern Systemwasser. Untersuchen Sie unter einem Lichtmikroskop die Embryonen in der Petrischale und entfernen Sie diejenigen, die ein gerissenes Chorion und Anzeichen von Schäden aufweisen.

Nach dem Bleichen der Embryonen gemäß dem Textprotokoll untersuchen und entfernen Sie alle toten Embryonen, die blau gefärbt werden könnten. Nachdem die Embryonen in frischer Methylenblaulösung inkubiert wurden, überprüfen Sie, ob die entwickelten Embryonen sichtbare schwarze Augen haben. Übertragen Sie dann die Embryonen mit einer Einwegpipette von Pasteur oder einer feinen gebogenen Pinzette auf eine Filterpappplatte.

Bewahren Sie alle unentwickelten Embryonen in Methylenblau auf und überwachen Sie sie täglich. Sobald sich schwarze Augen entwickelt haben, übertragen Sie sie auf festes Substrat. Spreizen Sie die Embryonen mit einer Pinzette im Abstand von etwa fünf Millimetern bis zu 100 Embryonen pro 90-Millimeter-Platte.

Dann verschließen Sie die Schale mit Paraffin und inkubieren die Embryonen zwei bis drei Wochen lang bei 28 Grad Celsius, bis sie ihre goldene Iris voll entwickelt haben und bereit zum Schlüpfen sind. Für die Langzeitlagerung bis zu einem Jahr werden die Embryonen nach dreitägiger Inkubation in Methylenblau-Lösung wie gerade gezeigt auf feste Substrat-Mediumplatten übertragen und bei 17 Grad Celsius inkubiert. Um die Fische auszubrüten, verwenden Sie eine feine gebogene Pinzette, um 50 bis 100 entwickelte Embryonen vorsichtig in die Brutbox zu übertragen und sie vollständig in Huminsäurelösung zu tauchen, die nicht tiefer als zwei Zentimeter bei vier Grad Celsius ist.

Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist das Schlüpfen von Killifischen-Embryonen, der durch den Transfer von Embryonen, die auf einem trockenen Substrat inkubiert wurden, in eine Huminsäure-haltige Brutlösung mit ausreichender Belüftung erreicht wird. Decken Sie den Brutkasten mit einem Deckel ab und brüten Sie ihn bei 28 Grad Celsius in einem Brutkasten aus. Um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, schließen Sie die Box an eine Luftzufuhr mit Schläuchen an.

Um eine angemessene Wasserqualität in der Brutbox zu erhalten, füllen Sie die Box ab dem Tag nach dem Schlüpfen einmal täglich mit einem Verhältnis von eins zu eins autoklaviertem Systemwasser auf, wobei Sie eine Endtiefe von zwei Zentimetern beibehalten sollten. Übertragen Sie alle noch nicht geschlüpften Embryonen zurück in das feste Substrat und versuchen Sie, eine Woche später zu schlüpfen. Um Jungfische und erwachsene Fische fünf Tage nach dem Schlüpfen aufzuziehen, bringen Sie die Jungtiere mit Einweg-Plastikpipetten oder einem Plastiklöffel vorsichtig in das Wasserkreislaufsystem, indem Sie fünf Jungtiere pro 0,8-Liter-Tank vorsichtig umsetzen, der mit einem 400-Mikrometer-Brutsieb ausgestattet ist.

Im Alter von 14 Tagen werden die Jungfische in ein 2,8-Liter-Aquarium umgesiedelt, das mit einem 850-Mikrometer-Brutsieb ausgestattet ist. Von diesem Zeitpunkt an beschriften Sie jedes Aquarium mit einer Fisch-ID.Für Überlebenstests halten Sie jeden Fisch einzeln in einem einzigen Tank. Fische, die für Überlebenstests gezüchtet werden, werden ebenfalls einzeln in einem 2,8-Liter-Tank untergebracht.

Füttern Sie die Jungtiere in den folgenden sieben Tagen zweimal täglich mit fünf Millilitern Salinengarnelen, die mit ein bis drei lebenden Blutwürmern ergänzt werden. Im Alter von vier Wochen füttern Sie jeden Fisch zweimal täglich mit Salinengarnelen und einem Milliliter Blutwürmern. Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass der Fisch die vollständige sexuelle Reife erreicht, indem Sie bei den Männchen auf das Vorhandensein großer Rücken-, After- und Schwanzflossen mit Anzeichen von Färbung und bei den Weibchen auf runde Hinterleiben voller Eier prüfen.

Hier ist eine repräsentative Überlebenskurve für 70 männliche türkisfarbene Killifische zu sehen. Bei richtiger Haltung ergibt sich ein medianes Überleben von 12 bis 28 Wochen im GRZ-Stamm. Die Schwankungen des medianen Überlebens hängen von der Ernährung, der Fütterungshäufigkeit und den Bedingungen der Stalltemperatur ab.

Die Überlebenskurve für Fische, die unter schlechten Haltungsbedingungen aufgezogen wurden, zeigt einen Anstieg der frühen Sterblichkeit und einen wiederholten plötzlichen Rückgang des Überlebens im Laufe der Zeit im Vergleich zu Fischen, die unter optimalen Haltungsbedingungen aufgezogen wurden. Bei der Befolgung dieses Protokolls ist es wichtig, den Wasserzustand und das überschüssige Futter von frisch geschlüpften Jungfischen genau zu überwachen, da es wichtig ist, dass diese in einer sauberen Umgebung aufbewahrt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, experimentelle Manipulationen an türkisfarbenen Killifischen zu erforschen, einschließlich Transgenese, Genom-Editierung und Ernährungsmanipulationen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Türkis-Killifische erfolgreich im Labor aufzieht, und dieses Modell verwenden, um die Biologie des Alterns bei den kurzlebigsten Wirbeltieren zu erforschen, die in Gefangenschaft aufgezogen werden können.