Protokoll für akute und chronische Ökotoxizität Prüfung von Türkis Killifische Nothobranchius furzeri

In dieser Arbeit beschreiben wir eine akute, chronische und Mehrgenerationen Bioassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Einzel- und kombinierte Stressoren auf die türkisfarbene Killifische Nothobranchius Furzeri. Dieses Protokoll dient zur Lebensgeschichte Züge (Mortalität, Wachstum, Fruchtbarkeit, Gewicht) und kritische thermische Maximum zu studieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Auswirkungen von Giftstoffen auf den türkisfarbenen Killifisch Nothobranchius furzeri zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Ökotoxikologie zu beantworten, wie z.B. die langfristigen Auswirkungen von Stressoren auf wichtige lebensgeschichtliche Merkmale, wie z.B. die Reifezeit, das Wachstum oder die Fruchtbarkeit. Der Hauptvorteil dieses Experiments besteht darin, dass wir ein Wirbeltier mit einem sehr schnellen Lebenszyklus verwenden, was zu zeit- und kosteneffizienten Experimenten führt.

Diese Killifische sind ideale Modelle, um die Auswirkungen langfristiger und generationenübergreifender Auswirkungen von Stressoren zu untersuchen. Letztendlich werden sie zu einem besseren Verständnis der Umweltauswirkungen von Giftstoffen beitragen. Obwohl diese Methode neue Einblicke in die kombinierte Wirkung von Giftstoffen und Temperatur liefern kann, kann sie auch auf andere Stressfaktoren wie UV-Strahlung, Nahrungsentzug und PH-Veränderungen angewendet werden.

Es ist schwierig, mit Killifischen zu arbeiten, da es sich um ein neues Modellsystem in der Ökotoxikologie handelt und ihre Empfindlichkeit gegenüber vielen Schadstoffen noch unbekannt ist. Die Idee zu dieser experimentellen Methode haben wir entwickelt, als wir zum ersten Mal von der außergewöhnlich kurzen Lebensdauer von Killifischen und ihrer Fähigkeit erfuhren, ruhende Eier zu produzieren, die jahrelang im Regal gelagert werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Art des Experiments sowie der Umgang mit den Personen die Ergebnisse verändern können.

Wählen Sie zunächst in der Stufe D3 die Eier des Gonarochenzoos oder GRZ aus, die an den goldenen Augen erkennbar sind. Und verwenden Sie eine weiche Pinzette, um sie vorsichtig in einen Zwei-Liter-Plastiktank zu übertragen. Geben Sie einen Zentimeter des Schlupfmediums bei 12 Grad Celsius hinzu und lassen Sie die Wassertemperatur allmählich an die Raumtemperatur anpassen.

Füttern Sie die geschlüpften Jungtiere nach 24 Stunden mit einer konzentrierten Dosis frisch geschlüpfter Artemia-Nauplien und erhöhen Sie die Wassertiefe auf fünf Zentimeter, indem Sie Fischmedium hinzufügen. 48 Stunden nach dem Schlüpfen werden gesunde, schwimmfähige Larven in einzelne Behälter mit Expositionsmedium und Giftstoffkonzentrationen umgefüllt, wie im Textprotokoll beschrieben. Kontrollieren Sie jeden Morgen und Abend die Fische auf Sterblichkeit, Stress und Krankheiten und berechnen Sie die LC50-Werte gemäß dem Textprotokoll.

Führen Sie einen chronischen Expositionsversuch durch, indem Sie einzelne Behälter mit dem richtigen Expositionsmedium füllen und einen Luftschlauch hinzufügen, um das Glas zu belüften. Füllen Sie den Fisch für den Rest des Experiments in die Gläser um. Füttern Sie die Fische zwei bis 23 Tage nach dem Schlüpfen oder DPH zweimal täglich ad libitum mit Artemia-Nauplien.

Dann, nach der Ergänzung mit gehackten Chironomus-Larven bis 37 DPH, verwenden Sie gefrorene Chironomus-Larven, um den Fisch zweimal täglich ad libitum zu füttern, jeden Tag. Um das Wachstum zu bestimmen, messen Sie wöchentlich die Körpergröße, indem Sie den Fisch in eine Petrischale geben, die mit Medium aus dem Reservoir gefüllt ist. Machen Sie vier bis fünf größenkalibrierte Bilder der Rückenansicht des Fisches in fester Höhe.

Und nutzen Sie ein räumliches Messprogramm, um sie digital zu analysieren. Ab 15 DPH den männlichen Fisch visuell auf Färbung untersuchen, um die Reife zu bestimmen. Überprüfen Sie die Flossen auf die ersten Anzeichen einer Hochzeitsfärbung und verwenden Sie den Tag, an dem die erste Färbung sichtbar war, als Indikator für die männliche Reifungszeit.

Ab dem 30. DPH wird die Fruchtbarkeit überprüft, indem bei jeder Behandlung ein Ein-Liter-Laichbecken für ausgewachsene Männchen und Weibchen mit Expositionsmedium aus dem Aquarium des Männchens eingerichtet und mit Laichsubstrat ergänzt wird. Setze sowohl das Männchen als auch das Weibchen in das Laichbecken um. Und während Sie menschliche Aktivitäten oder Störungen in der Umgebung der Laichbehälter minimieren, lassen Sie sie zwei Stunden lang laichen.

Anschließend werden die Fische ohne unnötiges Mischen des Wassers, das die Eier im Laichsubstrat aufwirbeln würde, vorsichtig wieder in ihre ursprünglichen Haltungsbehälter umgesiedelt. Filtern Sie die Eier heraus, indem Sie das Laichsubstrat über ein 500-Mikrometer-Netz gießen. Zählen Sie die Eier und geben Sie sie mit einer Pipette auf feuchtes Torfmoos in Petrischale.

Entferne täglich abgestorbene Eier. Verwenden Sie nach einer Woche eine Siegelfolie, um die Petrischale zu verschließen. Und lagern Sie es in einem temperaturgesteuerten Inkubator bei 28 Grad Celsius mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 bis 10 Grad, um sofort in die D3-Phase zu gelangen.

Für eine langfristige Konservierung lagern Sie die Eier in ständiger Dunkelheit bei 17 Grad Celsius, danach gehen die Eier in die Ruhephase über und bleiben mehrere Jahre lang lebensfähig. Um Fische aus den ruhenden Eiern zu rekrutieren, werden die Eier etwa drei Wochen lang auf 28 Grad Celsius und einen Hell-Dunkel-Zyklus von 14 bis 10 Grad Celsius gebracht, damit sie sich zur D3-Phase entwickeln können. Um das kritische thermische Maximum (CT max) von erwachsenen Fischen zu messen, beginnen Sie mit einem kontinuierlich zirkulierenden Wasserbad, das mit einer konstanten Rate von 0,33 Grad Celsius pro Minute erhitzt wird.

Fügen Sie mehrere Ein-Liter-Aquarien für jeden einzelnen Fisch hinzu. Beginnen Sie die Wanderung, indem Sie den Fisch in das Aquarium setzen, wenn das Wasser die experimentelle Aufzuchttemperatur der Fische erreicht hat. Verwenden Sie ein digitales Thermometer, um die Temperatur in den Ein-Liter-Aquarien des CT max-Bades alle fünf Minuten zu überwachen.

Wenn der Fisch es versäumt, eine dorsale Bauchlage aufrecht zu halten, oder stark zu zucken beginnt, messen Sie die Temperatur im Ein-Liter-Aquarium, die die kritische Maximaltemperatur ist. Bringen Sie den Fisch dann zur Erholung zurück in sein experimentelles Gehäuse. Wie in dieser Grafik gezeigt, führte die akute Exposition von Enfurzeri gegenüber unterschiedlichen Kupferkonzentrationen zu einem Anstieg der Mortalität mit zunehmender Schadstoffkonzentration.

Die LC50-Werte nehmen mit der Zeit ab, was bedeutet, dass mit abnehmenden Konzentrationen mehr Zeit vergeht, bis 50% der Replikate absterben. Bei einem chronischen Expositionstest mit wasserbasiertem Kupfer sind die Fische kürzer lang, gemessen nach drei Wochen, wenn sie mit der höchsten getesteten Konzentration aufgezogen wurden. In diesem Experiment mit wasserbasierten Chlorpyrifos oder CPH produzierten Fische, wenn sie bei 28 Grad Celsius aufgezogen wurden, weniger Eier, wenn sie der höchsten CPF-Konzentration ausgesetzt waren, jedoch produzierten Kontrollfische bei 30 Grad Celsius mehr Eier als Fische, die einer der beiden CPF-Konzentrationen ausgesetzt waren, was darauf hindeutet, dass die Kombination von CPF und einem Temperaturanstieg die Fruchtbarkeit stärker beeinflusste als jeder Stressor einzeln.

Hier wird das mittlere Alter angegeben, in dem die ersten Anzeichen einer Färbung bei Enfurzeri-Männchen auftraten, die bei 28 und 30 Grad Celsius CPF ausgesetzt waren. Nach der Exposition gegenüber vier Mikrogramm pro Liter CPF brauchten die männlichen Fische 18 % länger, um zu reifen als Kontrollfische. Die Messung des CT max von Fischen, die entweder bei 24 oder 28 Grad Celsius aufgezogen wurden, und die Exposition gegenüber dem Schadstoff 3, 4-DCA, zeigte, dass unregelmäßiges Schwimmen, erhöhte operkuläre Bewegungen und der Verlust der Fähigkeit, in dorsoventral aufrechter Position zu bleiben, bei einer niedrigeren Temperatur auftraten, wenn die Fische bei 24 Grad Celsius aufgezogen wurden.

Sobald dieses Protokoll gemeistert ist, kann es einschließlich der Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit in zwei Monaten gemessen werden. Um die Auswirkungen auf die gesamte Fortpflanzungsperiode oder sogar eine nachfolgende Generation zu messen, kann das Protokoll verlängert werden, kann aber immer noch in sechs Monaten durchgeführt werden.