Optische Vollfeld-Kohärenzmikroskopie zur histologischen Analyse von Stromamerkmalen in Hornhauttransplantaten

Diese Methode kann das Screening und die Auswahl von Hornhautspendergewebe in Augenbanken verbessern und die Ergebnisse der Hornhauttransplantation verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine hohe Auflösung aufweisen kann und dass die Hornhaut während der gesamten Bildaufnahme in eine geschlossene Kammer eingetaucht bleibt, die mit Speichermedium gefüllt ist, wodurch das potenzielle Risiko einer Kontamination verringert wird. Das Verfahren wird von Maelle Vilbert, einer Doktorandin unseres Labors, demonstriert.

Positionieren Sie zunächst die in Speichermedium getauchte Hornhaut mit dem Epithel nach oben in den Probenhalter. Legen Sie ein sauberes Kieselsäure-Deckglas, das mit dem Probenhalter geliefert wird, auf die Hornhaut. Schließen Sie dann den Halter, indem Sie die Basis vorsichtig drehen, bis die Probe leicht abgeflacht und unter dem Deckglas immobilisiert ist, wodurch eine relativ ebene Bildfläche entsteht.

Treffen Sie Vorkehrungen, um Luftblasen zu vermeiden. Tragen Sie eine dicke Schicht ophthalmologisches oder optisches Gel als Immersionsmedium auf das Deckglas auf. Initialisieren Sie das Gerät, indem Sie den Netzschalter auf der Rückseite des Geräts einschalten.

Das Aufleuchten einer grünen LED an der Vorderseite des Geräts zeigt an, dass das Gerät eingeschaltet ist. Stellen Sie sicher, dass der Bildgebungstisch mit Ausnahme des beweglichen Fachs frei ist. Klicken Sie dann in der Erfassungssoftware auf OK, um die Motoren an der Eingabeaufforderung zu initialisieren.

Um das Gerät einzurichten, geben Sie eine Probenkennung in das dafür vorgesehene Pflichtfeld ein. Geben Sie optional eine Beispielbeschreibung und eine Studienbeschreibung ein. Klicken Sie anschließend auf Makrobild erfassen, um einen Schnappschuss der Probe zu erstellen, der später für die seitliche Positionierung und Navigation verwendet werden kann.

Wenn Sie zufrieden sind, validieren Sie das Bild an der Eingabeaufforderung, indem Sie auf Ja klicken. Danach bewegt das Gerät die Probenschale unter das Objektiv und führt eine automatische Anpassung durch. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskopobjektiv gut in das optische Gel eingetaucht ist, bevor Sie fortfahren.

Bereiten Sie die Akquisition vor, indem Sie auf die Registerkarte Erkunden gehen. Bevor Sie einen Stapel Bilder aufnehmen, navigieren Sie mit dem Joystick oder der manuellen Auswahl auf dem Bildschirm zur Mitte der Hornhaut. Variieren Sie die Abbildungstiefe durch Drehen des Joysticks, Einstellen des Schiebereglers oder manuelle Tastatureingabe in der grafischen Benutzeroberfläche.

Stellen Sie dann den Mittelungswert auf 40 ein, um eine optimale Hornhautbildgebung zu erhalten. Geben Sie den Wert der Hornhautoberfläche oder die erste Bildposition in das Tiefenfeld ein. Wählen Sie dann die Registerkarte Erwerben aus, um Bilder zu erfassen.

Wählen Sie den Schichtabstand aus, der der axialen Auflösung des Geräts entspricht, und stellen Sie ihn ein. Geben Sie den Wert für die Hornhautdicke unter Anzahl der Schichten ein. Überprüfen Sie die Parameter und die Erfassungszeit.

Wenn Sie zufrieden sind, drücken Sie OK, um die Akquisition zu starten. Vermeiden Sie während der Aufnahme den Kontakt mit dem Tisch, auf dem das Mikroskop positioniert ist. Um die Dicke der Stroma- und Bowman-Schicht zu beurteilen, messen Sie die Abstände der Hornhautquerschnitte.

Fügen Sie z. B. fünf gleichmäßig verteilte Punkte über den Querschnitt hinzu, wie im Textmanuskript beschrieben. Zeichnen Sie eine Linie zwischen zwei Punkten mit bekannter Entfernung gemäß dem Standard-Sichtfeld. Wechseln Sie dann zur Registerkarte Analysieren und wählen Sie Skalierung festlegen.

Geben Sie den bekannten Abstand und die Längeneinheit in die entsprechenden Felder ein. Stellen Sie 1024 Pixel oder 780 Mikrometer ein und klicken Sie auf OK. Ziehen Sie eine Linie zwischen zwei Punkten unbekannter Entfernung und lesen Sie die Länge oder den gemessenen Abstand direkt aus der Statusleiste ab. Notieren Sie den Mittelwert und den Variationskoeffizienten.

Klicken Sie auf die Registerkarte Bild und wählen Sie unter Stapel die Option Reslice Z, um die Keratinozytendichte zu bestimmen. Dadurch werden die stromalen En-Face-Bilder in Gruppen von sieben Personen summiert, um Schichten vergleichbarer Dicke zu erhalten. Für die weitere Analyse werden alle verfügbaren En-Face-Schichten für das vorderste Stroma, 15 Bilder für das vordere Stroma, fünf Bilder für das mittlere Stroma und fünf Bilder für das hintere Stroma einbezogen.

Wählen Sie auf jedem Flächenbild einen 300 x 300 Mikrometer großen Interessenbereich aus. Um die Visualisierung des Kerns zu verbessern, invertieren Sie das Bild mit Invertieren auf der Registerkarte Bearbeiten. Passen Sie Kontrast und Helligkeit an, indem Sie auf die Registerkarte Bild klicken und zu Helligkeit-Kontrast navigieren.

Um Zellkerne manuell zu zählen, gehen Sie zu Plugins und navigieren Sie zu Zellzähler auf der Registerkarte Analysieren. Drücken Sie auf Initialisieren und wählen Sie dann einen Indikatortyp aus. Zählen Sie dann die Zellkerne, indem Sie auf dunkle ovale Merkmale im invertierten Bild klicken, wobei diejenigen berücksichtigt werden, die nur für zwei der vier Seiten des Bildes auf einem Bildrand landen.

Die ausgewählte menschliche Spenderhornhaut war nach der Lagerung in Organkulturmedium geschwollen, was ein pathophysiologisches Modell der ödematösen Hornhaut ergab und aufgrund der begrenzten Eindringtiefe eine Bildaufnahme über die gesamte Hornhautdicke verhinderte. Die Übertragung auf ein mit Dextrin ergänztes Organkulturmedium reduzierte die Schwellung und führte zu Spenderhornhäuten normaler Dicke. Erkrankte Hornhäute wurden an morphologischen Veränderungen und typischen stromalen Merkmalen erkannt, einschließlich einer Abnahme der variablen Stromadicke oder der Bowman-Schicht.

Die Beurteilung der Keratinozytendichte und des stromalen Reflexionsvermögens erleichterte die histologische Analyse und Unterscheidung von normalem und pathologischem Hornhautgewebe mit optischer Vollfeld-Kohärenzmikroskopie, was über die Möglichkeiten klinischer optischer Kohärenztomographiesysteme hinausgeht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine qualitative und quantitative histologische Analyse des Hornhautstromas durchführt, die eine Differenzierung der Krankheit von normalem menschlichem Hornhautgewebe ermöglicht.