Messung der Endoreduplikation durch Durchflusszytometrie von isolierten Knolle Protoplasten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Grad der Endoreduplikation in Kartoffelknollen zu bewerten. Diese Methode kann bei der Beantwortung wichtiger Fragen zur Morphologie der Kartoffelknolle helfen, z. B. in welchem Entwicklungsstadium das Knollengewebe eine Endoreduplikation durchläuft. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zu typischen Durchflusszytometrie-Präparaten viel klarere Ergebnisse liefert.

Vorführung des Verfahrens ist Parker Laimbeer. Ein Doktorand aus meinem Labor. Nach der Herstellung von Lösungen und Puffern gemäß dem Textprotokoll werden die Kartoffelknollen oberflächensterilisiert, indem sie mindestens fünf Minuten lang in 71%iges Ethanol getaucht werden.

Entfernen Sie die Pflanzenmaterialien aus dem Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen für jede Probe vorbereiten und etikettieren und jeweils 15 Milliliter filtersterilisierte Plasmolyse-Inkubationslösung (PIS) aliquotieren. Mit einem sterilisierten Skalpell oder einer Korkbohrung wird etwa ein Kubikzentimeter des Wunsches zur Sterilisation von Gewebe gebohrt.

Schneiden Sie das Gewebe mit dem Sterilskalpell grob in etwa drei Kubikmillimeter große Stücke. Und übertragen Sie das Gewebe in ein konisches Röhrchen, das PIS enthält. Anschließend wird das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.

Um Kartoffelprotoplasten zu erzeugen, beginnen Sie mit der Zubereitung und Filtration einer angemessenen Menge Enzymlösung oder ES mit 0,71 molar Mannitol, drei millimolar Calciumchlorid und einem millimolaren Monokaliumphosphat. Ein Millimolar Magnesiumchlorid, 4 % Onozuka R-10 Cellulase, 0,8 % Macerozym R-10, 1 % Hemicellulase und 10 Millimolar MES Puffer, pH 5,8. Aspirieren Sie mit einer serologischen Pipette das PIS aus den Proben in den Röhrchen.

Geben Sie 10 Milliliter des ES zu jeder Probe und drehen Sie die Röhrchen zwei- bis dreimal um. Anschließend werden die Proben über Nacht bei 29%Celsius und 180 U/min inkubiert. Am dritten Tag, um die Protoplasten zu ernten und zu waschen, nehmen Sie die Proben aus dem Schüttler und lassen Sie sie etwa 10 Minuten lang absetzen.

Saugen Sie mit einer serologischen Pipette so viel wie möglich von der ES-Lösung ab und achten Sie darauf, das verdaute Gewebe zu vermeiden. Entfernen Sie dann mit einer Mikropipette und halten Sie das Röhrchen schräg und entfernen Sie die restliche ES-Lösung wieder, wobei Sie das verdaute Gewebe vermeiden. Es ist wichtig, so viel wie möglich von der Protoplasten-Waschlösung zu entfernen, um eine Schädigung der Zellkerne zu vermeiden.

Wenn Sie das Röhrchen in einem Winkel halten, kann dies bei der Entfernung der Lösung helfen, während die Protoplasten belassen werden. Geben Sie 15 Milliliter PWS zu jeder Probe. Und drehen Sie das Rohr zwei- bis dreimal vorsichtig um.

Lassen Sie die Protoplasten 10 Minuten lang einwirken. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um das PWS zu entfernen. Und eine Mikropipette, um verbleibende Flüssigkeit zu entfernen.

Während Sie die Proben auf Eis halten, geben Sie 1,5 Milliliter eiskaltes FCB in jedes Röhrchen. Schütteln oder wirbeln Sie jede Probe kurz, um aggregiertes Gewebe aufzubrechen. Es ist wichtig, die Klumpen des Knollengewebes aufzubrechen, damit das FCB die Zellen vollständig durchdringen und die Zellkerne freisetzen kann.

Wenn ab diesem Schritt eine Kontrolle hinzugefügt werden soll, verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein kleines Blatt in 1,5 Millilitern eiskaltem FCB fein zu hacken. Die Kontrollproben sollten den gleichen Ton haben wie die Versuchsproben, vorzugsweise den gleichen Genotyp. Führen Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit abgeschnittener Spitze und 106-Mikrometer-Metallgewebe zum Boden geschmolzen in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein.

Anschließend wird ein Milliliter der FCB-Gewebesuspension durch den Filter geleitet. Geben Sie 250 Mikroliter der RNA-Lösung zu jeder Probe. Dann drehen Sie die Röhrchen um und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie 125 Mikroliter zuvor hergestelltes Propidiumiodid oder PI-Lösung zu jeder Probe. Drehen Sie die Röhrchen um und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Verwenden Sie die Proben so schnell wie möglich und innerhalb von zwei Stunden vermeiden Sie eine Degradation.

Erstellen Sie zwei Punktdiagramme mit der logarithmischen Skala von Vorwärtsstreuung versus Seitenstreuung und PI vs. Seitenstreuung. Erstellen Sie außerdem ein Histogramm mit PI auf der x-Achse. Eine logarithmische Skala ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Ereignisse innerhalb der Skala liegen, da sich die Zellkerne in der Fluoreszenz stark unterscheiden können.

Laden Sie ein Röhrchen mit einer bekannten Kontrollprobe, z. B. einem In-vitro-Blattgewebe aus einem Probengenotyp. Und passen Sie die Spannung so an, dass alle Ereignisse auf der Skala liegen. Notieren Sie sich den Kanal des 2C-Peaks in der Kontrollprobe.

Die 2C-Peaks der experimentellen Proben sollten an der gleichen Stelle liegen. Laden Sie eine experimentelle Knollenprobe und stellen Sie erneut sicher, dass alle Ereignisse im Maßstab sind. Falls Anpassungen erforderlich sind, wiederholen Sie die Spannungsanpassung der Kontrollprobe, um den Kanal der 2C-Spitzen zu identifizieren.

Gaten Sie die Protoplastenkerne manuell mit dem Side-Scatter-Twin-PI-Diagramm. Stellen Sie dann das PI-Histogramm so ein, dass nur die Gated Protoplasten-Kernregion angezeigt wird. Erfassen Sie die gewünschte Anzahl von Ereignissen aus jeder Stichprobe.

Häufig verwenden Forscher 10.000 Gated Events für die Durchflusszytometrie. Für Knollenprotoplastenproben werden hier jedoch 2000 Ereignisse verwendet, um mehr Proben und Proben mit niedrigen Konzentrationen aufzunehmen. Die Erzeugung von Protoplasten ist notwendig, um reproduzierbare Durchflusszytometrie-Ergebnisse aus Kartoffelknollen zu erzielen.

Die allgemeine Morphologie davon ist hier dargestellt. Die Trennung zwischen Mark und perimedullärem Parenchym ist mit schwarzen Linien dargestellt. Der Gefäßring, der das Parenchym von der Hirnrinde trennt, ist mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet.

Isolierte Protoplasten sollten kugelförmig und symmetrisch sein, wobei die Plasmamembran intakt sein sollte. Beachten Sie den Größenunterschied zwischen Blatt- und Knollenprotoplasten sowie die Größenunterschiede innerhalb eines Gewebes, die auf unterschiedliche Endoreduplikationsgrade hinweisen können. Diese Abbildung zeigt die Variation der Ergebnisse, die sowohl in den Streudiagrammen der Durchflusszytometrie als auch in den Histogrammen auftreten kann.

Intakte Zellkerne zeigen eine saubere Trennung zwischen den Peaks, um die relative Häufigkeit der Zellen zu quantifizieren, während in die Peaks integrierte Proben verschobene breite und überlappende Basen zeigen. In den entsprechenden Streudiagrammen zeigen die Black Boxes das Gating nuklearer Ereignisse für Histogramme an, und die Häufung von Ereignissen spiegelt sich in der Breite der Histogrammpeaks wider. Dieses Experiment, in dem die Endoreduplikationsstufen (EI) analysiert wurden, bestätigt frühere Ergebnisse, dass Markgewebe eine höhere EI aufweist als Kortexgewebe.

Überraschenderweise ähnelte das Profil des Parenchymgewebes dem der Rinde und unterschied sich auch signifikant von dem des Markgewebes. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Sterilität der Proben für die ersten beiden Inkubationen aufrechtzuerhalten und die Proben nach der Lyse der Protoplasten so weit wie möglich auf Eis zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie genetische Manipulation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Gene den Endoreduplikationsgrad der Knollen beeinflussen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Protoplasten aus Kartoffelknollen extrahiert und sie für die Durchflusszytometrie vorbereitet, um ihre Endoreduplikationswerte zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Propidiumiodid äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die richtige PSA getroffen werden sollten.