Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, transgene Pflanzen zu erzeugen, die intakte Einzelkopie-Insertionen einer Transfer-DNA (T-DNA) auf effiziente Weise tragen. Der BIBAC-Gateway-Vektor ist ein wertvolles Werkzeug für die Generierung transgener Pflanzen, die intakte Einzelkopien-Insertionen von Sequenzen von Interesse tragen, die eine stabile Genexpression zeigen. Mit dem BIBAC-Gateway-Vektor kann man die Gateway-Rekombinationstechnologie nutzen, um mit minimalem Aufwand interessante Sequenzen einzufügen.

Alle BIBAC-Derivate, einschließlich der BIBAC-Gateway-Vektoren, eignen sich für den Transfer großer, transgener DNA-Fragmente in Pflanzengenome. Die BIBAC-GW-Vektoren können verwendet werden, um interessante Sequenzen in viele Pflanzensysteme wie Mais, Reis und Tomate einzufügen. Es stehen zwei BIBAC-GW-Plasmide zur Verfügung.

Das BIBAC-RFP-GW-Plasmid enthält ein DsRed-Gen, das in Samenschalen exprimiert wird. Das BIBAC-BAR-GW-Plasmid enthält ein Gen, das eine Resistenz gegen Glufosinat verleiht. Beide Vektoren enthalten ein Kanamycin-resistentes Gen als Selektionsmarker in Bakterien.

Um die interessierenden Sequenzen in den binären Vektor einzufügen, bereiten Sie zuerst den Gateway Entry und die binären Vektoren vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Um eine Gateway-Reaktion durchzuführen, bereiten Sie die LR-Rekombinationsreaktion gemäß den Vorschlägen des Lieferanten in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur vor. Mischen Sie 100 bis 300 Nanogramm des supercoiled Entry-Klons und 300 Nanogramm des BIBAC-Gateway-Vektors.

Stellen Sie das Volumen der Mischung mit TE auf 16 Mikroliter ein. Zum Schluss fügen Sie vier Mikroliter LR Cllonase Enzymmischung hinzu und mischen durch Vortexen. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius. Beenden Sie die LR-Reaktion, indem Sie der Mischung zwei Mikroliter Proteinase-K-Lösung hinzufügen.

Mischen und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor mit der Umwandlung in E.coli fortgefahren wird, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Arabidopsis-Pflanzen auf die Umwandlung vorzubereiten, züchten Sie Arabidopsis-Pflanzen in einem Gewächshaus oder einer klimatisierten Wachstumskammer, bis sie blühen. Schneiden Sie die ersten Schrauben ab, damit weitere Sekundärschrauben hervortreten können.

Die Pflanzen sind vier bis sechs Tage nach dem Schnitt bereit zum Tauchen, wenn die Pflanzen viele unreife Blütenköpfe und nicht viele befruchtete Siliques haben. Um das Blütendippen durchzuführen, tauchen Sie die Blütenstände fünf bis 10 Sekunden lang in Agrobacterium-Suspension. Sanftes Rühren verwenden.

Wickeln Sie die oberirdischen Teile der Pflanzen in Frischhaltefolie ein, um die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten, und decken Sie die Pflanztöpfe mit einer Schachtel ab, um die Pflanzen im Dunkeln zu halten. Inkubieren Sie die Pflanzen zwei Tage lang in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer. Entfernen Sie nach zwei Tagen die Schachtel und die Frischhaltefolie und lassen Sie die Pflanzen in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer zur Reife heranwachsen.

Um die Effizienz der Umwandlung zu erhöhen, können dieselben Pflanzen sieben Tage nach dem ersten Tauchen erneut getaucht werden. Als nächstes, wenn die transformierten Pflanzen reif und trocken sind, ernten Sie die Samen. Sammeln und analysieren Sie die Samen von Pflanzen, die mit demselben Konstrukt wie ein einzelnes Set transformiert wurden.

Falls Pflanzen mit einem BIBAC-RFP-Gateway-Plasmidderivat transformiert werden, identifizieren Sie transgene Pflanzen durch Analyse der Samen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Um die DsRed-Expression in Samenschalen nachzuweisen, bilden Sie die Samen bei einer Anregung von 560 Nanometern und einer Emission von 600 bis 650 Nanometern ab. Trennen Sie die fluoreszierenden Seeds mit einer Pinzette von den nicht fluoreszierenden Gegenstücken.

Um nach transgenen Pflanzen zu suchen, die mit einem BIBAC-BAR-Gateway-Plasmidderivat transformiert wurden, säen Sie das Saatgut in mit Erde gefüllte Schalen. Sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung der Samen auf den Schalen, indem Sie die Samen in 0,1%Agar in 0,5x MS-Medium suspendieren und die Samen mit einer Ein-Milliliter-Pipette verteilen. Stimulieren Sie die Samen, synchron zu keimen, indem Sie die Samen mindestens zwei Tage lang bei vier Grad Celsius inkubieren.

Dies kann vor oder nach der Aussaat der Samen erfolgen. Zwei und drei Wochen nach der Aussaat der Samen besprühen Sie die Sämlinge mit 0,5%iger Glufosinat-Ammonium-Lösung. Verwenden Sie 500 Milliliter Glufosinat-Ammonium-Lösung pro Quadratmeter.

Setze die überlebenden Sämlinge in Töpfe um. Analysieren Sie die Glufosinat-Ammonium-resistenten Pflanzen mittels PCR auf das Vorhandensein des interessierenden Konstrukts. Bestimmen Sie die Anzahl der T-DNA-Integrationen und deren Integrität durch DNA-Blotting mit Restriktionsenzymen.

Diese Methode ermöglicht die Identifizierung sowohl einzelner als auch wiederholter Integrationen an gleichen oder unterschiedlichen Loci im Genom. Verwenden Sie eine Reihe von Restriktionsverdauungen, um die verschiedenen möglichen Integrationsmuster zu identifizieren. Wählen Sie ein Enzym aus, das einmal in der Mitte der T-DNA schneidet, um Sequenzen vor und hinter der Restriktionsstelle unabhängig voneinander untersuchen zu können.

Wählen Sie außerdem ein Enzym oder eine Kombination von Enzymen aus, die die gesamte gewünschte Sequenz auf einmal ausschneiden. Achten Sie darauf, nur Restriktionsenzyme zu verwenden, die nicht empfindlich auf Cytosinmethylierung reagieren. Führen Sie nach der Durchführung des DNA-Blottings, wie im Textprotokoll beschrieben, eine Blot-Analyse durch.

Die Analyse hängt von der verwendeten Restriktionsstrategie ab. Wenn Sie den Blot mit der Strategie mit einer Restriktionsstelle in der Mitte der T-DNA analysieren, zählen Sie die Anzahl der nachgewiesenen Fragmente. Bei dieser Strategie deutet die Anzahl der hybridisierten Fragmente auf die Anzahl der T-DNA-Integrationen hin.

Vergleichen Sie die Anzahl der mit einer Sonde detektierten Fragmente für die linke und die rechte Seite der T-DNA. Wenn mit den beiden Sonden eine unterschiedliche Anzahl von hybridisierenden Fragmenten nachgewiesen wird, dann liegen entweder mehrere T-DNA-Integrationen in einer invertierten Wiederholung oder unvollständig integrierte T-DNAs vor. Um Tandem- und invertierte Anordnungen der T-DNAs zu identifizieren, schätzen Sie die Größen der hybridisierenden Fragmente auf dem Blot basierend auf der Größe der Markerbanden und vergleichen Sie die geschätzten Größen mit den erwarteten Fragmentgrößen, die auf der Grundlage der Restriktionsstrategie berechnet wurden.

Um zu untersuchen, ob die transgene Sequenz von Interesse intakt ist, wird der gemäß der Strategie präparierte Blot mit Restriktionsstellen an den Enden der interessierenden Sequenz analysiert. Schätzen Sie die Größe der hybridisierenden Fragmente auf dem Blot basierend auf der Größe der Markerbanden und vergleichen Sie sie mit der erwarteten Größe. Eine intakte Insertion ergibt ein einzelnes Fragment mit einer definierten Länge.

Jede Abweichung von der erwarteten Länge deutet auf eine unvollständige Integration hin. Es wird die DNA-Restriktions- und Blotting-Strategie zur Bestimmung der Anzahl und Unversehrtheit der T-DNA-Integrationen gezeigt. Die ScaI-Restriktionsstelle unterteilt die Reportersequenz in die proximalen Teile des linken Randes, die bei Verwendung einer Sonde für bar detektiert werden, und die proximalen Teile des rechten Randes, die bei Verwendung einer Sonde für eYFP detektiert werden.

Die BglII- und PciI-Restriktionsstellen befinden sich innerhalb der T-DNA, außerhalb des Reporterkonstrukts. Ein doppelter Aufschluss führt zu einem Fragment mit definierter Größe, und jede Abweichung ist ein Hinweis auf unvollständige Insertionen. Die Anzahl der identifizierten hybridisierenden Fragmente spiegelt die Anzahl der T-DNA-Insertionen wider.

Ein Blot, der genomische DNA von neun Transgenen enthielt, die mit ScaI verdaut wurden, wurde mit Sonden für bar und eYFP hybridisiert. Mehrere Lanes deuten auf transgene Produkte mit einzelnen T-DNA-Integrationen hin. Spur vier zeigt zwei Fragmente mit Balken und eines mit eYFP, was entweder auf eine Kürzung der eYFP-Sequenz oder eine umgekehrte Wiederholung um den rechten Rand hinweist.

Bahn sechs zeigt zwei Fragmente mit bar und eYFP an. Ein Fragment hat eine schwache Intensität mit der Stabsonde. Das andere Fragment hat eine hohe Intensität, was auf zwei T-DNA-Insertionen hinweist, von denen eine abgeschnitten ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre DNA-Sequenz von Interesse mithilfe der Gateway-Rekombination in einen BIBAC-GW-Binärvektor einbauen können, gefolgt von der Arabidopsis-Transformation, dem Screening und der Bewertung der Anzahl der T-DNA-Integrationen und ihrer Integrität. Die Generierung und Charakterisierung transgener Pflanzen ist zeitaufwändig. Bei der Verwendung des BIBAC-Gateways als binärer Vektor kann der Prozess der Identifizierung von Transgenen mit intakten Einzelkopie-Integrationen verkürzt werden.

Etwa die Hälfte der mit BIBAC-Derivaten erzeugten Transgene weisen intakte Einzelkopie-Integrationen auf. Im Allgemeinen ist den Individuen nicht bewusst, dass viele transgene Pflanzen, die unter Verwendung gemeinsamer binärer Vektoren erzeugt wurden, verkürzte Kopien eines Transgens oder Transgene tragen, die Gen-Silencing zeigen. Mit BIBAC-Derivaten tragen die meisten der erzeugten transgenen Pflanzen intakte, einzelne Integrationen eines Transgens, die selten ein Gen-Silencing zeigen.

Bei der Verwendung von BIBAC-GW zur Erzeugung von Transgenika ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Pflanzenmaterialien zu transformieren, da die Gesamttransformationseffizienz von BIBAC-Derivaten geringer ist als die von üblicherweise verwendeten binären Vektoren. Die Transformationseffizienz von BIBAC-GW liegt im Allgemeinen zwischen 0,2 % und 0,5 %Nach der Identifizierung transgener Pflanzen mit intakten, einzelkopierten T-DNA-Integrationen kann bei Bedarf eine weitere Analyse durchgeführt werden, um die genaue genomische Position der T-DNA-Insertion zu bestimmen. Transgene mit intakten Einzelkopien-Integrationen zeigen vergleichbare Expressionsniveaus der Transgene.

Dies deutet darauf hin, dass die Integrationsposition der T-DNA in das Genom nur einen geringen Einfluss auf das Expressionsniveau des Transgens hat.