Binäre bakterielle künstliche Chromosomenvektor-basierte Gentransformation in Arabidopsis-Pflanzen: Eine Technik zur Erzeugung transgener Pflanzen mit Single-Copy-Insertion

Beginnen Sie mit Arabidopsis-Pflanzen, die unreife Blütenköpfe tragen. Tauchen Sie die Blütenköpfe in eine Agrobacterium-Zellsuspension mit T-DNA, die mit binärem bakteriellem künstlichem Chromosom oder BIBAC kloniert wurde, einem Vektor, der sich sowohl in E. coli- als auch in Agrobacterium-Systemen repliziert. Dieser binäre T-DNA-Vektor kann große Transgene wie Herbizidresistenzgene und fluoreszierende selektierbare Marker entlang eines samenspezifischen Promotors liefern.

Während die Blütenköpfe noch eingetaucht sind, rühren Sie die Pflanzen vorsichtig, um ihren Kontakt mit Agrobacterium zu verbessern. Mit seiner inhärenten Fähigkeit, Pflanzen zu infizieren, überträgt Agrobacterium das Transgen in die Blütenzelle. Wenn das Transgen in die Zelle eindringt, wandert es zum Zellkern und verschmilzt mit dem Pflanzengenom.

Wickeln Sie die Pflanze nun in Frischhaltefolie ein und inkubieren Sie im Dunkeln, um die Feuchtigkeit für eine bessere Umwandlung zu speichern. Entfernen Sie die Folie und züchten Sie die Pflanzen unter physiologischen Bedingungen, bis sie Samen produzieren.

Ernten Sie anschließend die Samen und beobachten Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop, um Transformanten auszuwählen. Züchten Sie nun die umgewandelten Samen unter geeigneten Bedingungen bis zur Keimung. Besprühen Sie die Pflanzen mit Herbizid und inkubieren Sie.

Pflanzen mit multipler Transgen-Insertion erleben ein Gen-Silencing und verwelken, während Pflanzen mit einer Single-Copy-Insertion ein aktives Herbizid-metabolisierendes Enzym exprimieren und die Behandlung überleben. Extrahieren Sie genomische DNA aus den überlebenden Transformanten und führen Sie eine PCR durch, um die Effizienz der Einzelkopie-Insertion zu berechnen.

Um die Arabidopsis-Pflanzen auf die Umwandlung vorzubereiten, züchten Sie Arabidopsis-Pflanzen in einem Gewächshaus oder einer klimatisierten Wachstumskammer, bis sie blühen. Schneiden Sie die ersten Schrauben ab, damit weitere Sekundärschrauben hervortreten können. Die Pflanzen sind vier bis sechs Tage nach dem Schnitt bereit zum Tauchen, wenn die Pflanzen viele unreife Blütenköpfe und nicht viele befruchtete Siliques haben.

Um das Blütendippen durchzuführen, tauchen Sie die Blütenstände 5 bis 10 Sekunden lang in Agrobacterium-Suspension. Sanftes Rühren verwenden. Wickeln Sie die oberirdischen Teile der Pflanzen in Frischhaltefolie ein, um die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten, und decken Sie die Pflanztöpfe mit einer Schachtel ab, um die Pflanzen im Dunkeln zu halten.

Inkubieren Sie die Pflanzen zwei Tage lang in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer. Entfernen Sie nach zwei Tagen die Schachtel und die Frischhaltefolie und lassen Sie die Pflanzen in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer zur Reife heranwachsen. Um die Effizienz der Umwandlung zu erhöhen, können dieselben Pflanzen sieben Tage nach dem ersten Tauchen erneut getaucht werden.

Als nächstes, wenn die transformierten Pflanzen reif und trocken sind, ernten Sie die Samen. Sammeln und analysieren Sie die Samen von Pflanzen, die mit demselben Konstrukt wie ein einzelnes Set transformiert wurden. Falls Pflanzen mit einem BIBAC-RFP-Gateway-Plasmidderivat transformiert werden, identifizieren Sie transgene Pflanzen durch Analyse der Samen mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Um die DsRed-Expression in Samenschalen nachzuweisen, bilden Sie die Samen bei einer Anregung von 560 Nanometern und einer Emission von 600 bis 650 Nanometern ab. Trennen Sie die fluoreszierenden Seeds mit einer Pinzette von den nicht fluoreszierenden Gegenstücken.

Um nach transgenen Pflanzen zu suchen, die mit einem BIBAC-BAR-Gateway-Plasmidderivat transformiert wurden, säen Sie das Saatgut in mit Erde gefüllte Schalen. Sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung der Samen auf den Schalen, indem Sie die Samen in 0,1 % Agar in 0,5-fachem MS-Medium suspendieren und die Samen mit einer 1-Milliliter-Pipette verteilen.

Stimulieren Sie die Samen, synchron zu keimen, indem Sie die Samen mindestens zwei Tage lang bei 4 Grad Celsius inkubieren. Dies kann vor oder nach der Aussaat der Samen erfolgen. Zwei und drei Wochen nach der Aussaat der Samen besprühen Sie die Sämlinge mit 0,5%iger Glufosinat-Ammonium-Lösung. Verwenden Sie 500 Milliliter Glufosinat-Ammonium-Lösung pro 1 Quadratmeter. Setze die überlebenden Sämlinge in Töpfe um. Analysieren Sie die Glufosinat-Ammonium-resistenten Pflanzen mittels PCR auf das Vorhandensein des interessierenden Konstrukts.