Beurteilung der Atemfunktion in bewusste Mäuse durch Doppel-Kammer-Plethysmographie

Diese Technik wird dazu beitragen, Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen zu beantworten, darunter Atemwegsforschung, Sicherheitspharmakologie und Arzneimittelentwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Messwerte liefert, auf die man sich verlassen kann, um die Atmungsfunktion bei bewussten Tieren sowohl zu Beginn als auch bei Herausforderungen zu beurteilen. Die Technik ist besonders nützlich, wenn das Versuchsprotokoll nur eine geringe Abweichung vom normalen physiologischen Zustand der Tiere erfordert.

Das Tier ist fixiert, atmet aber ansonsten normal, was eine Beurteilung des Atemmusters und der Obstruktion der Atemwege ermöglicht. Starten Sie am Tag des Experiments eine experimentelle Sitzung, und laden Sie die entsprechende Konfigurationsdatei. Geben Sie das Experiment und die Informationen zum Tier ein.

Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen am unteren Rand des Fensters. Fahren Sie mit der Kalibrierung des Systems fort. Kalibrieren Sie jede Stelle und jedes Eingangssignal separat.

Schalten Sie den Bias-Flow-Generator ein, der über ein Stück Schlauch mit der Kopfkammer verbunden ist, und stellen Sie die Durchflussmenge ein. Verschließen Sie die obere Öffnung der Kopfkammer mit einer Kappe. Nehmen Sie die Rückwand der Brustkammer ab.

Führen Sie dann das Kalibrierwerkzeug fest in die Gummiöffnung zwischen dem Kopf und der Körperkammer ein, um eine hermetische Abdichtung zu schaffen. Schließen Sie die Rückwand der Brustkammer und befestigen Sie sie wieder. Gehen Sie im Menü der Software-Symbolleiste zu Tuning und dann zu Kalibrieren.

Gehen Sie zu Eingang eins und wählen Sie Kalibrieren, um das Kalibrierungsdialogfeld für das Thoraxflusssignal zu öffnen. Stellen Sie sicher, dass die im Kalibrierungsdialogfenster aufgelisteten Parameter die entsprechenden Einstellungen anzeigen. Der niedrige Wert der physikalischen Belastung sollte Null sein.

Der hohe Wert für die physikalische Belastung sollte minus 20 Milliliter pro Sekunde betragen, und die Proben sollten auf Integration eingestellt werden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie im Beispielfenster auf niedrig. Vergewissern Sie sich, dass das erzeugte Signal im gesamten Anzeigefenster konstant ist, und klicken Sie dann auf Schließen.

Schließen Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit einem Kunststoffverbinder in einem Schlauchstück durch den seitlichen Anschluss der Thoraxkammer an. Wählen Sie im Probenfenster hoch und injizieren Sie sofort 20 Milliliter Luft über einen Zeitraum von zwei Sekunden bei einer möglichst konstanten Durchflussrate in die Kammer. Vergewissern Sie sich, dass das erzeugte Signal vollständig im Anzeigefenster angezeigt wird.

Verwenden Sie das Pfeilsymbol, um zu überprüfen, ob das Signal zentriert und symmetrisch um die Nulllinie herum ist. Klicken Sie dann auf Schließen. Entfernen Sie jeden Offset von Null, indem Sie im Samples-Fenster auf Remove AC offset klicken.

Kalibrieren Sie die Kopfkammer auf ähnliche Weise wie die Thoraxkammer, indem Sie Eingang Nummer zwei auswählen. Legen Sie dieses Mal den hohen Wert auf plus 20 Milliliter pro Sekunde statt auf minus 20 fest. Arbeiten Sie in einer ruhigen Gegend, die weit vom Wohnraum entfernt ist.

Gewöhnen Sie die Tiere vor Beginn des Versuchs an die Rückhalteeinrichtung und die Verfahren. Da es nicht invasiv ist und keine Anästhesie erfordert, wird die Arbeit unter Bedingungen, unter denen das Tier bequem, gut angepasst und ruhig ist, die Neigung zu Haarlecks zwischen den Kammern begrenzen und dadurch die Qualität der Daten maximieren. Wiegen Sie die Tiere.

Wählen Sie das passende Fixierungsmittel für das Tier aus. Führen Sie das Tier in den Rückhalteapparat ein, indem Sie von der hinteren Öffnung ausgehen. Es kann hilfreich sein, das Gerät senkrecht zu halten.

Sobald das Tier in Position ist, setzen Sie den hinteren Stößel ein und verriegeln Sie ihn vorsichtig, ohne übermäßige Kraft auszuüben. Überprüfen Sie visuell, ob das Tier normal atmet. Passen Sie bei Bedarf die Position an, indem Sie den Verriegelungsmechanismus bewegen.

Stellen Sie sicher, dass die Nasenlöcher des Tieres außerhalb des Nasenkegels herausragen und die Schnauze an den Innenwänden des Rückhaltesystems anliegt. Nehmen Sie die Rückwand der Brustkammer ab. Führen Sie den Beutel mit dem Tier durch die Gummiöffnung in der Brustkammer ein und schließen Sie die Kammer.

Befestigen Sie die Kopfkammer, sorgen Sie für einen Bias-Flow und lassen Sie das Tier mindestens fünf Minuten lang entspannen. Sobald sich das Tier beruhigt hat, starten Sie das Befehlsprotokoll, indem Sie den ersten Schritt auswählen und dann auf Ausführen klicken. Überprüfen Sie auf dem Computerbildschirm, ob die Atemsignale des Tieres regelmäßig und gleichmäßig sind.

Die Software zeigt die berechneten Parameter automatisch Atemzug für Atemzug an. Stellen Sie sicher, dass die Parameter des Tieres stabil sind. Zeichnen Sie das Atemmuster unter Ausgangsbedingungen bis zu 10 Minuten lang auf.

Bei Protokollen, bei denen eine Prüfsubstanz per Aerosol verabreicht wird, stellen Sie zunächst die Zeit und den Arbeitszyklus des Verneblers nach Bedarf ein. Führen Sie eine Fahrzeugherausforderung durch und notieren Sie die Antwort. Bei Bedarf ist das Tier steigenden Konzentrationen der Prüfsubstanz auszusetzen, indem die Konzentration im Vernebler geändert und die Schritte eskaliert werden.

Notieren Sie die Antwort nach jeder Verabreichung. In diesem Beispiel werden 15 Milligramm Methacholin pro Milliliter getestet. Der maximale Anstieg des spezifischen Atemwegswiderstands wird einen Moment danach aufgezeichnet und kehrt dann langsam zum Ausgangswert zurück

Am Ende der Versuchssitzung bringen Sie das Tier in seinen Raum und Käfig zurück. Reinigen Sie zwischen den Sitzungen die Plethysmographenkammern und spülen Sie den Vernebler mit Wasser aus. Fahren Sie mit der Datenanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Hier ist das Ergebnis einer wiederholten Bewertung der Atemfunktion zu Studienbeginn über drei aufeinanderfolgende Tage in zwei Gruppen von BALB/c-Mäusen dargestellt. Eine Kontrolle und eine mit pulmonalallergischer Entzündung. Für eine Auswahl von Parametern, die durch die Doppelkammerplethysmographie bereitgestellt wurden, wurden stabile und vergleichbare Werte erhalten.

Diese Werte wurden für die Atemfrequenz, das Titelvolumen, die Minutenbeatmung, die endinspiratorische Pause, die Strömung in der Mitte des exspiratorischen Titelvolumens und den spezifischen Atemwegswiderstand aufgetragen. Veränderungen der Atmungsfunktion und des Ansprechens auf steigende Dosen von inhalativem Methacholin wurden auch an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt, um den Grad der Reaktionsfähigkeit bei Kontroll- und allergischen C57BL/6-Mäusen zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigen den erwarteten progressiven Anstieg des spezifischen Atemwegswiderstands bei Erhöhung der Methacholin-Dosen mit einem übertriebenen Grad der Reaktionsfähigkeit bei den allergischen Mäusen am zweiten und am dritten Tag.

Am folgenden Tag wurde der Newtonsche Widerstand mit Hilfe der erzwungenen Schwingungstechnik gemessen. Die Änderungen dieses Parameters spiegeln hauptsächlich Schwankungen des Widerstands der großen leitenden Atemwege wider. Der gemessene Newtonsche Widerstand zu Studienbeginn und als Reaktion auf Methacholin korrelierte gut mit dem gemessenen spezifischen Atemwegswiderstand, der am Vortag bei denselben Tieren erhalten wurde.

Diese Technik ist praktisch, um mehrere Tiere gleichzeitig zu beurteilen, die Kinetik einer akuten Reaktion zu erfassen und die Atmungsfunktion während eines mehrtägigen Experiments wiederholt zu messen. Im Anschluss an den Eingriff können weitere Methoden wie die Force-Assoziationstechnik durchgeführt werden, um die Auswertung durch direkte Messungen der Atemmechanik wie z.B. des Atemwegswiderstands zu ergänzen. Die Doppelkammer-Plethysmographie bietet wirklich einen interessanten Ansatz zur Beurteilung des Atemmusters und der Geographie der Atemwegsobstruktion, insbesondere wenn das Versuchsprotokoll erforderte, dass die Tiere bei Bewusstsein waren.