Name: Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Lernen Sie die multiplexe Enhancer-Targeting-Methode mit SID4X-dCas9-KRAB zur Identifizierung genregulierender Regionen in Zelllinien. Dieses Protokoll ermöglicht effiziente Genregulationsstudien.

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Diese Arbeit wurde von NIH/NHGRI R00 HG006922 NIH/NHGRI R01 HG008974, j.g. und Huntsman Cancer Institute unterstützt. J.B.C. wurde von NIH Trainingsprogramm in Genetik T32GM007464 unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Methode für sezieren Enhancer-Funktion bei der endogenen genomischen Lokus ohne physisch verändern die DNA-Sequenz. Zwar ähnlich im Konzept zuvor veröffentlichten CRISPR-Störungen-Protokolle mit dCas9-KRAB27, unterscheidet Enhancer-i sich diese Protokolle auf 3 Arten. Erstens nutzt Enhancer-i die SIN3A interagierende Domäne von MAD120 Enhancer Deaktivierung zu erreichen. Enhancer Deaktivierung kann gerettet werden, mit HDAC-Inhibitoren, was darauf hindeutet, dass der primäre Mechanismus der Deaktivierung HDAC angewiesen ist. Im Gegensatz zu CRISPR Störungen mit dCas9-KRABBE führen Enhancer-i nicht zur Ablagerung von H3K9me3. Dies dürfte die Enhancer-i stützt sich auf vorübergehende Einführung des Leitfadens, die RNAs, Transfektion mit den Zellen geerntet an 3 Tagen veröffentlichen. CRISPR Störungen wird eine Zunahme der H3K9me3 um 7 Tage Post Transduktion12beobachtet. Das Enhancer-i-Protokoll sieht schließlich eine Strategie, um mehrere Websites gleichzeitig Ziel und überwachen Sie die Effizienz des Zielens. Mosaik-Seq17dCas9-KRABBE wird verwendet, um mehrere Enhancer gleichzeitig, aber diese Technik stützt sich auf einzelne Zelle RNA Sequenzierung, Ausdruck Veränderungen zu erkennen und viele Gene (z. B. Östrogen-responsive Gene) unentdeckt aufgrund der geringen Empfindlichkeit der einzelligen RNA-FF Enhancer-i bietet eine zuverlässige Methode um Enhancer einzeln und in Kombination für jedes Gen zu untersuchen.
Der wichtigste Schritt der Enhancer-i ist Transfektion, die für die Zell-Linie von Interesse optimiert werden soll. Dieses Protokoll setzt auf Puromycin Behandlung für transfizierte Zellen zu bereichern, aber es ist möglich, dass Co transfecting Guide RNAs mit einem fluoreszierenden Proteins und Sortierung für fluoreszierende Zellen mittels Durchflusszytometrie erweisen eine bessere Methode der Anreicherung für einige Zelle Typen. Es wird empfohlen, Überwachung der Ausdruck der Guide RNAs und SID4x-dCas9-KRABBE durch qPCR zu beheben und Transfektion zu bestätigen. Wenn Richtmengen RNA niedrig sind (Zyklus Schwelle > 30), Benutzer können auch erwägen alternative Anleitung RNA Produktionsstrategien wie in Vitro Transkription28. Es ist auch möglich, dass trotz der hohen gRNA, Guide RNA Ausrichtung des SID4x-dCas9-KRABBE-Proteins ist ineffizient, können notwendig sein, in welchem Fall Auswahl verschiedener RNA-Sequenzen führen. Durch ChIP-Seq Fusionsprotein mit Chromatin von Enhancer-i behandelt Zellen ausführen, kann die Effizienz des Zielens überwacht werden. Wenn high-Signal des SID4x-dCas9-KRABBE in der Region von Interesse ist, und kein Ausdruck Änderungen in seiner vermeintlichen Zielgen werden erkannt, trägt die Region wahrscheinlich nicht zum Ausdruck, dass gen unter den untersuchten Bedingungen bei.
Eine mögliche Einschränkung der Enhancer-i ist, dass Ziel Effekte ansammeln können, wenn zu viele Seiten gleichzeitig gezielt eingesetzt werden. Nichtsdestotrotz haben CRISPR Störungen Strategien für Knockdown weniger Ziel-Effekte als RNAi29, besonders wenn eine polyklonale Zell-Linie mit dem Ausdruck dCas9-KRAB verwendet wird. Während wir off-Target genomische Bindung des SID4X-dCas9-KRABBE gesehen haben, wenn Sie 10 Seiten gleichzeitig auf, haben wir keine Veränderungen der Genexpression durch diese Bindung Ereignisse identifiziert. Da einige Enhancer mehrere Veranstalter bzw. andere Geschmacksverstärker kontaktieren können, ist es möglich, dass viele Gene Ausdruck bei der Ausrichtung der einzelnen Enhancer, ändern können, aber es unklar ist, ob diese Form der Genregulation üblich ist. Um zu bestätigen, dass der Ausdruck Veränderungen werden beobachtet durch Ausrichtung auf eine bestimmte Enhancer und nicht Ziel Effekte, können Benutzer Enhancer-i mit zwei unterschiedliche Sätze von nicht überlappenden Guide RNAs die gleiche Region durchführen. Darüber hinaus kann die genetische Löschung der Region mit Nuklease-kompetente Cas9 weiter seine Auswirkungen auf die Genexpression bestätigen.
Als Enhancer-i Funktionen durch Histon Deacetylation ist es möglich, dass seine Deaktivierung Fähigkeiten auf Geschmacksverstärker beschränken, die spürbare Histon Acetylierung verfügen. Es gibt eine Vielzahl von alternativen repressiven Fusionen, die möglicherweise effektiver bei Ausrichtung auf spezifische Enhancer. DNA-Methyltransferase Fusionen zu dCas9 können zur Genexpression bei distalen Enhancer30gezielt zu reduzieren, aber diese Unterdrückung ist oft nicht flüchtig. Eine andere repressive Fusion nutzt die Freund GATA1 (FOG1) Domäne, wodurch Histon H3 Lysin 27 Trimethylation und unterdrückt Genexpression auf Ebenen ähnlich wie dCas9-KRABBE in einer Vielzahl von Zelle Linien und Promotoren31. Interessanterweise reduziert hinzufügen mehr Kopien von FOG1 zu dCas9 das repressive Potential an Promotoren, was darauf hindeutet, dass eine einzelne Kopie der SID-Domäne möglicherweise mehr Enhancer Deaktivierung als die 4 Kopien derzeit in Enhancer-i verwendet. Es ist möglich, dass einige Loci von dual targeting durch unterschiedliche Kombinationen der oben genannten dCas9 Fusionen profitieren können. Zum Beispiel kann stabile langfristige Unterdrückung durch gleichzeitige Transduktion von dCas9-DNMT3a und dCas9-KRAB32erreicht werden. Die meisten dieser repressiven Fusionen haben nur auf einen einzigen Nenner zu einem Zeitpunkt gezielt, und es bleibt unklar, welche am effektivsten zu manipulieren gleichzeitig mehrere Enhancer ist.
Enhancer-i, während eine geeignete Methode für die Untersuchung von Kombinationen der Enhancer für eine Handvoll Genen, ist noch etwas im Durchsatz begrenzt, wenn der Benutzer wünscht, vermeintliche Enhancer für Hunderte von Genen zu studieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden Imaging-basierte Technologien um mehrere Gene in mehrere Proben gleichzeitig zu quantifizieren integrieren. Wichtiger ist, sind diese Technologien kompatibel mit direkte Nachweis der RNA-Moleküle aus lysate, wodurch die Notwendigkeit für zeitaufwändige RNA Isolierung. Diese Anpassungen werden das Verhör von größeren Mengen von Enhancer erleichtern.

Groß angelegte Projekte wie ENCODE1, Fahrplan Epigenomics2und FANTOM-Sequenzierung3 haben festgestellt, dass Millionen von vermeintlichen Enhancer innerhalb des menschlichen Genoms über Hunderte von Zelltypen. Schätzungen gehen davon aus, dass jeder Veranstalter mit durchschnittlich 4,9 Enhancer Associates und jede Enhancer durchschnittlich 2,4 Gene3 Kontakte, darauf hindeutet, dass gen-Expression oft das Ergebnis der Integration von mehreren verteilten regulatorischer Wechselwirkungen ist. Eine verbleibende Herausforderung ist zu definieren, nicht nur wie die einzelnen Enhancer zur Genexpression, beitragen, sondern wie sie kombinieren, um den Ausdruck beeinflussen. Gentechnische Ansätze werden häufig verwendet, um Beziehungen zwischen Enhancer in Modellorganismen Drosophila4 Mäuse5identifizieren. Diese Experimente sind jedoch zeitaufwendig und niedrigen Durchsatz für die Untersuchung von mehreren Enhancer an mehreren Genen.
Ein Ansatz für das Studium Enhancer-Funktion auf einer großen Skala umfasst massiv parallelen Reporter Assays. Diese Tests ermöglichen die gleichzeitige Vorführung von Tausenden von DNA-Sequenzen für ihre Fähigkeit, den Ausdruck von einem Reporter-gen6fahren. Während dieser Tests gezeigt haben, dass DNA-Sequenz allein ausreichen kann, um gen Verordnung Informationen7vermitteln, kommen sie mit den Einschränkungen von außerhalb des Kontexts native Chromatin durchgeführt wird und mit einem heterologen Promotor. Darüber hinaus ist die Größe der DNA-Sequenz in massiv parallelen Reporter Assays analysiert in der Regel weniger als 200 Basenpaaren, die gewünschte umliegenden Sequenz ausschließen können. Wichtig ist, wie Reporter-Assays nur die Aktivität einer Sequenz zu einem Zeitpunkt Messen, nehmen nicht berücksichtigt die komplexen Beziehungen sie, die zwischen Enhancer bestehen können. So massiv parallelen Reporter Assays informativ über die intrinsischen Aktivität einer DNA-Sequenz können zwar sein, sie nicht unbedingt der Funktion dieser DNA-Sequenz im Rahmen des Genoms mitteilen.
Vor kurzem haben entwickelte CRISPR/Cas9 Werkzeuge8 erleichtert das Studium der Genregulation wie sie für die Löschung der Enhancer an die endogenen Locus ermöglichen. Jedoch mehrere Enhancer gleichzeitig löschen, genomische Instabilität führen kann, und es ist zeitaufwendig, zu aufeinander folgenden Enhancer Löschungen in einer einzelnen Zelle Linie zu erzeugen. Darüber hinaus neue genomischen Sequenz entsteht an der Stelle der Löschung nach Reparatur, und diese Sequenz kann regulatorischen Funktion gewinnen. Eine alternative Version des Cas9 wurde entwickelt, speziell für modulierende Genexpression, unter Berufung auf Verschmelzungen von Aktivierung9,10 oder11,12 Domänen der Nuklease-defizienten Form des Cas9 zu unterdrücken (dCas9). Diese Schmelzverfahren Proteine sind ideal für das Studium mehrere Loci gleichzeitig, da sie nicht physisch die DNA-Sequenz verändern, und stattdessen Epigenetik modulieren um eine regulatorische Region zu befragen. Die am weitesten verbreitete repressive Fusion ist KRABBE, die Rekruten den KAP1 Co Repressor Komplex, Förderung der Ablagerung von Repression-assoziierten Histone H3 Lysin 9 Trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRABBE, auch bekannt als CRISPR Störungen14, wurde für ihren Beitrag zur Gen Ausdruck15,16, Ziel- und Bildschirm einzelne Enhancer verwendet. jedoch wurde es nicht für mehrere Bereiche gleichzeitig gezielt optimiert. Eine Version von multiplex CRISPR-Störungen für Enhancer, Mosaik-Seq17, verwendet einzelne Zelle RNA-Seq als ein Auslesen, aber diese Technologie ist teuer und nur geeignet für die Untersuchung von stark exprimierten Genen aufgrund der geringen Sensitivität der Einzelzelle RNA-Seq.
Wir wollten eine CRISPR Interferenz basierende Methode für kombinatorische Enhancer-Funktion im Rahmen einer transcriptional Antwort auf Östrogen sezieren zu entwickeln. Etwa die Hälfte der Östrogen-responsive Gene enthalten mindestens 2 Enhancer durch Östrogen-Rezeptor Alpha (ER) gebunden, in der Nähe18, was darauf hindeutet, dass mehrere Enhancer können an die Östrogen-Antwort Teilnahme, und das Verständnis die rechtliche Logik erfordern würde Ausrichtung auf gleichzeitig mehrere Enhancer. Wie ausgangsstudien mit CRISPR Störungen bei Promotoren vorgeschlagen, dass nicht alle Veranstalter gleichermaßen auf KRAB-vermittelten Repression19reagieren, begründete wir, dass die Zugabe von einer deutlichen repressiven Domäne dCas9 die Deaktivierung des erleichtern können diverse Enhancer. Wir entschieden uns für die Sin3a Interaktion Domain von Mad1 (SID)20 führt auf die Rekrutierung von Histon Deacetylases21, die Acetyl-Gruppen auf Histone zu entfernen, die transkriptionelle Aktivität zugeordnet sind. Wichtig ist, die SID der Domäne war effektiv bei der Reduzierung der Genexpression bei dCas922 und Geschichten23verschmolzen, und Sin3a hat gezeigt, dass ein potenter repressiven Co-Faktor in einer Vielzahl von Enhancer Sequenz Kontexten24werden. Wir verwendet, SID4x-dCas9-KRABBE (Enhancer-i) um 10 verschiedene Enhancer, an der ER gebunden und ER Bindungsstellen (Stabilisierungen), die notwendig sind für die Östrogen transcriptional Antwort bei 4 Genen18zu identifizieren. Wir gezielt auch die Kombinationen der Enhancer, die Standorte zu identifizieren, die in der Produktion von Östrogen transcriptional Antwort kooperieren. Wir fanden, dass bis zu 50 Seiten möglicherweise gleichzeitig mit Veränderungen der nachweisbaren Genexpression ausgerichtet werden können. Mit ChIP-Seq und RNA-Seq, haben wir bewiesen, dass Enhancer-i eine hochspezifische Technik für mehrere Enhancer gleichzeitig zu studieren.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte bei der Durchführung von Enhancer-i, eine flexible Technik, die die funktionelle Studie von mehreren Enhancer gleichzeitig in einer Gewebekultur-Umgebung ermöglicht. Enhancer-i ist hoch korreliert mit genetischen löschen sondern bietet vorübergehende Deaktivierung, das Histon Deacetylases (HDACs) abhängig ist. Durch die Bereitstellung von Guide RNAs über Transiente Transfektion im Gegensatz zu stabilen Integration über virale Vektoren, vermeidet dieses Protokolls Ablagerung und potentielle Verbreitung von H3K9me3. Dieses Protokoll Details Guide RNA-Design und Klonen über Gibson Versammlung, die Transfektion von guide RNAs mit Lipofektion, und die Analyse der resultierenden Genexpression von qPCR ändert. Wir berücksichtigen auch die Methoden zur Bewertung der Spezifität des Zielens Enhancer-i auf der Ebene des Genoms und Transkriptom. Während diese Technik entwickelt wurde, um zu studieren Genregulation durch ER Enhancer in menschlichen Krebszelllinien gebunden, es gilt für die Zerlegung von jedem Säugetier Enhancer.

<table><tbody><tr><td>ZR 96-well Quick-RNA Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>AflII Restriktionsenzym</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA Reinigen & Reinigen Konzentrator-Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Puffer RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>Mensch: Ishikawa-Zellen</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac Kaninchen polyklonal</td><td>Aktives Motiv&nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 polyklonales Kaninchen</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAG Maus monoklonal</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER alpha Kaninchen polyklonales</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro Plasmid</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen et al., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector Plasmid</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali et al., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 Puromycin-Plasmid</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB-Plasmid</td><td>Addgen&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I reduziertes Serummedium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, mit KAPA mRNA Capture</td><td>Beads Kapa Biosytems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease und Phosphatase Inhibitor Mini Tabletten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin Selektives Antibiotikum (G418 Sulfat) (50 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Lila 2-Log DNA Leiter</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

dissektion der enhancer-funktion mit multiplex crispr-basierte enhancer einmischung in zell-linien

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Mehreren Enhancer häufig Regeln eines bestimmten Gens, doch für die meisten Gene, es bleibt unklar, welche Enhancer für die Genexpression notwendig sind und wie diese Enhancer kombinieren, um eine transcriptional Antwort zu produzieren. Da Millionen von Enhancer identifiziert wurden, sind Hochdurchsatz-Werkzeuge notwendig, Enhancer-Funktion auf einer genomweiten Skala bestimmen. Aktuelle Methoden zur Untersuchung von Enhancer-Funktion auch die Abgabe von genetischen Deletionen mit Nuklease-kompetente Cas9, aber es ist schwierig, die kombinatorische Effekte von mehreren Enhancer mit dieser Technik zu studieren, wie mehrere aufeinander folgende klonalen Zelllinien werden muss generiert. Hier präsentieren wir Ihnen Enhancer-i, eine CRISPR Interferenz basierende Methode, die für funktionelle Verhör von mehreren Enhancer gleichzeitig ihre endogenen Loci ermöglicht. Enhancer-i nutzt zwei repressiven Domänen mit Nuklease-defizienten verschmolzen Cas9, SID und KRABBE, Enhancer Deaktivierung über Histon Deacetylation an gezielte Loci zu erreichen. Dieses Protokoll nutzt Transiente Transfektion von Guide RNAs, vorübergehende Inaktivierung von Zielregionen zu ermöglichen und ist besonders effektiv bei der induzierbare transkriptionelle Reaktionen auf Reize in Gewebekultur Einstellungen blockieren. Enhancer-i ist hochspezifisch, sowohl in seiner genomischen targeting und seine Auswirkungen auf die globalen Genexpression. Aus diesem Protokoll erzielten Ergebnisse helfen um zu verstehen, ob ein Enhancer ist zur Genexpression, das Ausmaß des Beitrags und wie der Beitrag von anderen nahe gelegenen Enhancer betroffen ist.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Workflows im Protokoll beschrieben. Um festzustellen, dass die Beiträge von ER-gebundenen Enhancer in der Nähe von Östrogen-regulierten Gens MMP17, hat 3 Bindungsstellen in der Nähe im Sinne von ChIP-Seq (Abbildung 2A) und RNAs leiten wurden für jede Region entwickelt. Design Guide RNAs, ein 600-900 bp Fenster rund um jede ER-Sequenz wurde Bindungsstelle von Interesse ausgewählt und ein Führer-RNA-Design-Programm. Resultierenden Guide Sequenzen RNA mit 0-2 vorausgesagt vom Zielwert, die Seiten des menschlichen Genoms mit BLAT ausgerichtet waren. Vier nicht-überlappende guide RNAs, die durch ChIP-Seq definierten Bereichs überspannt und DNaseI Überempfindlichkeit wurden ausgewählt, für die Ausrichtung (Abb. 2 b). Zusätzliche Sequenz (Tabelle 1) wurde hinzugefügt, um jedem Ende Erleichterung der nachgeschalteten Klonen und die daraus resultierenden bestellte waren 59 Nukleotid-Fragmente. Bei der Ankunft war Guide RNAs verdünnt und gebündelt durch die Website und eine kurze PCR wurden durchgeführt, um Homologie Regionen vor der Gibson-Montage hinzufügen. Abbildung 2 zeigt die erwarteten Guide RNA Produkt nach einer kurzen PCR unter Verwendung der "U6_internal" Zündkapseln (Tabelle 1), die an jedem Ende der 59 Länge 20 Basenpaaren Sequenz hinzufügen guide RNA Fragment, was in einer Länge von ~ 100-Sequenz. Anschluss an Gibson Vollversammlung diese Anleitung RNA-Pools verwandelten sich in Bakterien und Plasmid Minipreps waren am nächsten Tag vorbereitet. Abb. 2D zeigt Ergebnisse aus einem Enhancer Dissektion Experiment, wo mehrere Enhancer in der Nähe MMP17 allein ausgerichtet sind und in Kombination mit Enhancer-i. Seiten gezielt durch Enhancer-i sind mit einem schwarzen Sechseck gekennzeichnet. Guide RNA Plasmide Ausrichtung auf den angegebenen Seiten wurden in einer Östrogen-beraubt Ishikawa Zelllinie stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRAB transfiziert. Zwei Tage später änderte sich die Medien und Puromycin wurde hinzugefügt, um für transfizierte Zellen anzureichern. Am folgenden Tag wurden die Zellen geerntet, nach einem 8 h 10 nM Estradiol Behandlung. RNA wurde isoliert und eine einstufige qPCR erfolgte. In diesem Beispiel sind Seiten 1 und 2 erforderlich für eine vollständige Östrogene Antwort des MMP17, während Seite 3 nicht unter diesen Bedingungen (Abb. 2D, Fahrspuren Ii-iv) beiträgt. Wenn nur die Seiten 2 oder 3 aktiv sind (vi und Vii), die Östrogen-Reaktion ist ähnlich wie wenn keine Standorte sind aktiv (Viii), was darauf hindeutet, dass diese Seiten nicht selbständig beitragen. Seite 1 kann ein Ausdruck von selbst (V) beitragen, aber die größte Aktivität wird gesehen, wenn die Seiten 1 und 2 aktiv sind (iv).
10-Enhancer in der Nähe von 4 verschiedenen Genen gleichzeitig bearbeiten (Abbildung 3A), führen komplexe Pools von RNAs mit 42 Enhancer-Guides und 16 Veranstalter Guides generiert wurden. Anleitung RNS Oligos wurden vor der ersten Guide RNA Verlängerung PCR (Schritt 3.3) zusammengefasst und daraus resultierende PCR-Produkte wurden gereinigt und in Kombination mit der leeren Puromycin U6 klonen Vektor mit Gibson Assembly. Anschluss an die Vollversammlung Gibson wurden mehrere unabhängige Transformationen durchgeführt und vernickelt. Die Platten wurden in LB geschabt und erlaubt zu wachsen, für 2-4 h vor Maxiprep. Abbildung 3 b zeigt repräsentative Reduktionen in der Genexpression von qPCR wenn diese Anleitung RNA Pools waren in einer Östrogen-beraubt Ishikawa Zelllinie stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRAB transfiziert und behandelt wie beschrieben (Abb. 2D). Reduzierungen von Enhancer-i sind ähnlich denen, die durch die Ausrichtung des Projektträgers des vermeintlichen Zielgens. Abbildung 3 zeigt die Auswirkungen der Verdünnung des Guide RNAs auf Reduzierung der Östrogen-Antwort mit Enhancer-i. Eine 01:50, die Verdünnung eines Guide RNA-Pools, die Ausrichtung der Enhancer in der Nähe von G0S2 noch deutliche Reduzierung der Genexpression ergibt, was darauf hindeutet, dass Enhancer-i verwendet werden kann bis zu 50 Seiten auf einmal. Jedoch kann die Deaktivierung, verdünnt werden, darauf hinweist, dass Hunderte von Websites können nicht gleichzeitig ausgerichtet werden, es sei denn, empfindlichere Nachweisverfahren beschäftigt sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> Abbildung 1: Protokoll für Multiplex-Enhancer Dissektion mit Enhancer-i. schematische Guide RNAs (rot und blau) sind mit e-knackig und ausgewählten Genom der UCSC Browser gestaltet. Vier Guide RNAs sind gewählt, die die Regionen von Interesse (Transkription Faktor Bindungsstellen definiert durch ChIP-Seq) umspannen. Guide RNA-Oligonukleotide, die von der Region von Interesse (rot und blau) gebündelt haben durchlaufen eine PCR um Homologie Regionen (Orange) vor der Gibson Montage und Transformation hinzuzufügen. Daraus resultierende Plasmid-Pools sind über Lipofektion in Zelllinien stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRABBE oder in Wildtyp Zellen in Verbindung mit SID4X-dCas9-KRAB Plasmid transfiziert. Guide RNA Plasmid Becken können individuell transfiziert werden, um eine Seite zu einem Zeitpunkt oder in Kombination mit mehreren Standorten gleichzeitig gezielt ansprechen. Transfizierte Zellen sind mit Antibiotika zu bereichern für Zellen mit Guide RNAs behandelt. ~ 72 h Post Transfektion sind die Zellen geerntet. Nukleinsäuren extrahiert werden können, für qPCR, RNA-Seq oder ChIP-Seq <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> Abbildung 2. Führen RNA Design und Enhancer Dissektion für MMP17. (A) Genom Browser Screenshot von ER Alpha-gebundenen Enhancer (grau) in der Nähe von zielgerichtet sein MMP17. Diese Zahl wurde von Carleton, Et Al. modifiziert 18. (B) Guide RNA entwirft für die 3 Seiten18verbindlich. Die Bindungsstelle für ER definiert durch ChIP-Seq ist das Ziel und die 4 Guide RNAs Fliese in dieser Region. Die DNaseI Empfindlichkeit Signal, das die Bindungsstelle erstreckt, kann auch zur Zielsequenz für Guide RNA Design definieren. ChIP-Seq und DNaseI HS Daten stammen aus Ishikawa Zellen behandelt mit 10 nM Estradiol für 1 h (C) repräsentative Guide RNA Sequenzen, die montagebereit Gibson, eine kurze PCR Homologie Regionen hinzufügen unterzogen worden sind. (D) Relative Expression von MMP17 über qPCR nach Ausrichtung der einzelnen Regionen mit Enhancer-i und eine 8-h10 nM Estradiol Behandlung gemessen. Ausdruck ist relativ CTCF und Ausdruck Ebene der MMP17 in den Zellen nicht mit Estradiol behandelt. Kontrolle Guide RNAs der Veranstalter des Ziel IL1RN. Alle Fehlerbalken darzustellen SEM, doppelte Sternchen geben p &lt; 0,01 und einzelne Sternchen geben p &lt; 0,05 in ein gepaarter t-Test. Diese Zahl wurde von Carleton, geändert Et Al. 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> Abbildung 3. Ausrichtung auf mehrere Enhancer in der Nähe von verschiedenen Genen gleichzeitig mit gebündelt Enhancer-i. (A) schematische Darstellung der Bindungsstellen und Promotoren in gepoolten Enhancer-i ausgerichtet werden. (B) die Auswirkungen auf Ausdruck qPCR gemessen, nachdem E2 Behandlung auf Ishikawa Zellen mit Enhancer-i Plasmid Pool (grün), Promoter-i Plasmid Pool (blau) oder Kontrolle gRNAs (weiß)18transfiziert. Eine signifikante Reduktion bei aller Gene wird mit Enhancer-i beobachtet. Diese Zahl wurde modifiziert von Carleton, Et Al. 18. (C) die Effekte auf G0S2 Ausdruck Ebenen nach E2 Behandlung auf Ishikawa Zellen transfiziert mit unterschiedlichen Mengen an Guide RNAs gezielt G0S2. Eine signifikante Reduktion kann man schon mit kleinen Beträgen Guide RNA (01:50 Verdünnung), darauf hindeutet, dass bis zu 50 Seiten kann gleichzeitig ausgerichtet. Alle Fehlerbalken darzustellen SEM, doppelte Sternchen geben p &lt; 0,01 und einzelne Sternchen geben p &lt; 0,05 in ein gepaarter t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name</td>
			<td>Sequenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Primer für RNA Verlängerung und Sequenzierung, qPCR und Erkennung des Fusionsproteins verwendet.

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Genomik und Genregulation zu beantworten, z. B. wie mehrere genregulatorische Regionen, auch Enhancer genannt, zusammenarbeiten, um die Transkription zu steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere Enhancer in der Nähe mehrerer verschiedener Gene gleichzeitig getestet werden können, um schnell Regionen zu identifizieren, die an der Genregulation beteiligt sind. Um mit dem Design der Guide-RNA zu beginnen, generieren Sie zunächst DNA-Sequenzen, wie im Textprotokoll beschrieben.Verwenden Sie ein Programm wie E-CRISP auf die generierten DNA-Sequenzen, um Guide-RNAs mit geringen Off-Targets zu finden. Guide-RNAs bestehen aus 20 Nukleotiden stromaufwärts eines Protospacer-benachbarten Motivs, das die Form von NGG für das dCas9 von S.pyogenes annimmt. Wählen Sie auf der E-CRISP-Website den gewünschten Organismus über das Dropdown-Menü aus.Die Genomassemblierung befindet sich rechts neben dem Artnamen. Wählen Sie das Optionsfeld Eingang ist FASTA-Sequenz aus. Kopieren Sie die FASTA-Sequenzen von oben und fügen Sie sie in das Dialogfeld ein.Stellen Sie sicher, dass für jede Sequenz ein FASTA-Header enthalten ist. Wählen Sie im Dropdown-Menü das mittlere Optionsfeld und das einzelne Design aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Einzel-gRNA-Suche starten.Es öffnet sich ein neuer Browser-Tab und die Ergebnisse werden angezeigt. Laden Sie die Kandidatensequenzen herunter, indem Sie auf die Schaltfläche Herunterladen eines Excel-formulierten tabellarischen Berichts für alle Abfragesequenzen zusammen klicken. Verwenden Sie als Nächstes den UCSC-Genombrowser, um Kandidaten-RNA-Sequenzen in voller Länge zum Genom zu führen.Navigieren Sie in einem Browser zur UCSC-Genombrowser-Website. Suchen Sie im Abschnitt Unsere Tools das Wort BLAT und klicken Sie darauf. Das BLAT-Suchwerkzeug wird geöffnet.Verwenden Sie die Dropdown-Menüs unter dem Genomtext der BLAT-Suche, um den gewünschten Organismus und die Genomassemblierung auszuwählen. Kopieren Sie die Guide-RNA-Sequenzen aus dem von E-CRISP generierten tabellarischen Bericht und fügen Sie sie in das Dialogfeld ein. Stellen Sie sicher, dass jede Sequenz über einen eindeutigen FASTA-Header verfügt, und klicken Sie dann unten im Dialogfeld auf Senden.Auf der BLOB-Suchergebnisseite werden Alignments jeder Guide-RNA-Sequenz angezeigt, wobei jede Zeile ein Alignment darstellt. Im Idealfall sollte es für jede Guide-RNA ein Alignment geben, was auf die Einzigartigkeit dieser Guide-RNA hinweist. Vermeiden Sie nach Möglichkeit Leitfäden, die auf mehrere Stellen im Genom verweisen.Um die Lokalisierung und Verteilung der Guide-RNA innerhalb der Region of Interest zu untersuchen, klicken Sie auf den Browser-Link unter dem Abschnitt "Aktionen" für eine der abgefragten Guide-RNAs. Der Genombrowser wird angezeigt und auf die ausgewählte Guide-RNA zentriert. Verwenden Sie die Verkleinerungsschaltflächen oben auf der Seite, um die Verteilung anderer von E-CRISP identifizierter Guide-RNAs innerhalb des interessierenden Bereichs zu visualisieren.Wählen Sie vier vorzugsweise nicht überlappende Guide-RNAs aus, die über die interessierende Region verteilt sind. Wenn der Interessenbereich 600 Basispaare überschreitet, sollten Sie ein bis zwei zusätzliche Hilfslinien hinzufügen. Vermeiden Sie guide-RNAs mit homopolymeren Abschnitten und extremem GC-Gehalt, da diese Merkmale den Klonierungsprozess der guide-RNA behindern und die Effizienz des Guide-RNA-Targetings verringern können.Rekonstituieren Sie Guide-RNA-Oligos in einer Endkonzentration von 100 Mikromolar in ultrareinem Wasser. Es sollten mindestens vier separate Guide-RNA-Oligos für jede Region von Interesse vorhanden sein. Erstellen Sie für jede regulatorische Region of Interest einen Pool aller Oligos, die der Region of Interest entsprechen.Kombinieren Sie in einem Eppendorf-Röhrchen fünf Mikroliter jedes einzelnen rekonstituierten Guide-RNA-Oligos für jede Region. Mischen Sie den Pool gut durch, indem Sie ihn vortexen, dann einen Mikroliter entfernen und diesen Eloquat 1 bis 200 in Reinstwasser verdünnen. Führen Sie eine kurze PCR mit den USICS-Primern durch, um Homologieregionen an die Oligos zu binden, wie im Textprotokoll beschrieben.Zu jedem Oligo werden etwa 40 Basen hinzugefügt, was ein Produkt von etwa 100 Basenpaaren ergibt, das an beiden Enden eine ausreichende Homologie zum USIC-Spektral enthält. Richten Sie als Nächstes Gibson-Assemblierungsreaktionen auf Eis ein. Verwenden Sie 50 Nanogramm des verdauten Vektors und sieben Nanogramm des Einsatzes in einer 20-Mikroliter-Reaktion.Richten Sie außerdem eine Gibson-Assemblierungsreaktion ein, bei der 50 Nanogramm des Vektors verwendet werden, und ersetzen Sie den Einsatz durch Wasser. Inkubieren Sie die Reaktionen der Gibson-Assemblierung 15 Minuten lang bei 50 Grad Celsius, gefolgt von einer Pause bei 4 Grad Celsius. Nachdem Sie die zusammengesetzten Produkte auf Eis umgefüllt haben, verdünnen Sie sie 1 bis 4 in Reinstwasser auf Eis.Fügen Sie beispielsweise fünf Mikroliter Gibson Assembly Produkt zu 15 Mikrolitern Reinstwasser hinzu. Transformieren Sie als Nächstes die verdünnten Gibson Assembly-Produkte. Lassen Sie hocheffiziente kompetente Zellen auf Eis fallen und stellen Sie für jede Umwandlung 25 Mikroliter Eloquats her.Wenn ein komplexer Pool gewünscht wird, der auf mehrere Stellen abzielt, lassen Sie genügend Zellen in verschiedene Röhren fallen, um mehrere unabhängige Transformationen durchzuführen. Platten 50 Mikroliter der transformierten Zellen und legen Sie die Platten über Nacht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Für Mini-Preps der Pools, die auf einzelne Stellen abzielen, legen Sie die Zellen direkt in drei bis fünf Milliliter LB-Bouillon, die Ampicillin oder Carbenicillin enthält.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht unter Schütteln bei 250 U/min und 37 Grad Celsius. Verwenden Sie für große Bibliotheken einen Plattenschaber, um alle Kolonien von jeder einzelnen Platte in einer Maxi-Vorbereitung zu sammeln. Dies kann erleichtert werden, indem etwa fünf Milliliter LB mit dem entsprechenden Antibiotikum in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen gegossen und die Kolonien in das Röhrchen geschabt werden.Am Tag vor der Transfektion werden die Zellen in einer 24-Well-Platte mit einer Konfluenz von 30 bis 50 % plattiert. Plattieren Sie genügend Zellen, so dass Transfektionen in doppelter Ausführung durchgeführt werden können, und schließen Sie Vertiefungen ein, die mit Kontrollleit-RNAs transfiziert werden sollen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung verteilt sind, indem Sie die Platte nach der Zellbeschichtung vorsichtig schütteln.In den ersten 15 Minuten alle fünf Minuten schütteln. Bereiten Sie am nächsten Tag Transfektionen gemäß den Anweisungen des Transfektionsreagenzes Ihrer Wahl vor. Verwenden Sie für Ishikawa-Zellen 550 Nanogramm Gesamtplasmid für jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.Verdünnen Sie die Plasmide auf eine Endkonzentration von 020 Mikrogramm pro Milliliter in serumfreien Medien. Verwenden Sie drei Mikroliter Transfektionsreagenz für jedes Mikrogramm DNA, wirbeln Sie es vorsichtig durch und inkubieren Sie es fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. 25 Mikroliter der fertigen Mischung in jede Vertiefung geben.Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen an Lysepuffer mit 1%Beta-Mercaptoethanol vor. Saugen Sie das Medium mit einem Vakuumsauger an. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem gleichen Volumen von 1x PBS und aspirieren Sie, um so viel PBS wie möglich zu entfernen.Geben Sie 300 Mikroliter der Lyse-BME-Lösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung. Pipettieren Sie die Lyselösung acht- bis zehnmal auf und ab und geben Sie sie auf eine Deep-Well-Platte oder 1,7 Milliliter Eppendorf-Röhrchen auf Eis. RNA kann sofort extrahiert werden, oder Lysate können für die zukünftige Verarbeitung bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden.Es werden Leit-RNA-Designs für die drei Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in der Nähe von MMP17 gezeigt. Die Zielregion ist die Bindungsstelle für ER alpha, wie sie durch ChiP-seq definiert wird, und die vier Guide-RNAs verlaufen in dieser Region. Hier ist das erwartete Guide-RNA-Produkt nach einer kurzen PCR unter Verwendung der internen Primer des USIC dargestellt.Die Reaktion fügt 20 Basenpaare Sequenz an jedes Ende des 59 Basenpaare umfassenden Guide-RNA-Fragments hinzu, was zu einer Sequenz von etwa 100 Basenpaaren führt. Gezeigt werden qualitative PCR-Ergebnisse aus einem Enhancer-I-Experiment an MMP17. Stellen, auf die Enhancer-I abzielt, sind mit einem schwarzen Sechseck gekennzeichnet.Die Stellen 1 und 2 sind für die vollständige östrogene Reaktion von MMP17 notwendig, während die Stelle 3 nicht dazu beiträgt. Standort 1 kann an sich einen gewissen Ausdruck beitragen, aber die größte Aktivität ist zu beobachten, wenn die Standorte 1 und 2 aktiv sind. Sobald diese Technik für die gewünschte Zelllinie optimiert ist, kann sie in fünf bis sieben Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Guide-RNAs für Enhancer-I entwirft, komplexe Pools von Guide-RNAs erstellt und transfiziert und transfizierte Zellen erntet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine sterile Gewebekulturumgebung aufrechtzuerhalten und RNase- und DNase-freie Materialien zu verwenden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie ChiP-seq und RNA-seq, verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wo im Genom Enhancer-I bindet und wie es die globale Genexpression beeinflusst.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die östrogeninduzierte Genregulation an endogenen Loci im menschlichen Genom zu untersuchen, anstatt episomale Reporter zu verwenden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in Säugetiergewebekulturen gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen persönlicher Schutzausrüstung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Das Protokoll beschreibt Methoden zur CRISPR-basierten Epigenom-Editierung (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in humanen Zelllinien unter Verwendung von Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion.

CRISPR-Epigenom-Editierung in menschlichen Zellen mittels Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Lernen Sie die multiplexe Enhancer-Targeting-Methode mit SID4X-dCas9-KRAB zur Identifizierung genregulierender Regionen in Zelllinien. Dieses Protokoll ermöglicht effiziente Genregulationsstudien.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

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