Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Genomik und Genregulation zu beantworten, z. B. wie mehrere genregulatorische Regionen, auch Enhancer genannt, zusammenarbeiten, um die Transkription zu steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere Enhancer in der Nähe mehrerer verschiedener Gene gleichzeitig getestet werden können, um schnell Regionen zu identifizieren, die an der Genregulation beteiligt sind. Um mit dem Design der Guide-RNA zu beginnen, generieren Sie zunächst DNA-Sequenzen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwenden Sie ein Programm wie E-CRISP auf die generierten DNA-Sequenzen, um Guide-RNAs mit geringen Off-Targets zu finden. Guide-RNAs bestehen aus 20 Nukleotiden stromaufwärts eines Protospacer-benachbarten Motivs, das die Form von NGG für das dCas9 von S.pyogenes annimmt. Wählen Sie auf der E-CRISP-Website den gewünschten Organismus über das Dropdown-Menü aus.

Die Genomassemblierung befindet sich rechts neben dem Artnamen. Wählen Sie das Optionsfeld Eingang ist FASTA-Sequenz aus. Kopieren Sie die FASTA-Sequenzen von oben und fügen Sie sie in das Dialogfeld ein.

Stellen Sie sicher, dass für jede Sequenz ein FASTA-Header enthalten ist. Wählen Sie im Dropdown-Menü das mittlere Optionsfeld und das einzelne Design aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Einzel-gRNA-Suche starten.

Es öffnet sich ein neuer Browser-Tab und die Ergebnisse werden angezeigt. Laden Sie die Kandidatensequenzen herunter, indem Sie auf die Schaltfläche Herunterladen eines Excel-formulierten tabellarischen Berichts für alle Abfragesequenzen zusammen klicken. Verwenden Sie als Nächstes den UCSC-Genombrowser, um Kandidaten-RNA-Sequenzen in voller Länge zum Genom zu führen.

Navigieren Sie in einem Browser zur UCSC-Genombrowser-Website. Suchen Sie im Abschnitt Unsere Tools das Wort BLAT und klicken Sie darauf. Das BLAT-Suchwerkzeug wird geöffnet.

Verwenden Sie die Dropdown-Menüs unter dem Genomtext der BLAT-Suche, um den gewünschten Organismus und die Genomassemblierung auszuwählen. Kopieren Sie die Guide-RNA-Sequenzen aus dem von E-CRISP generierten tabellarischen Bericht und fügen Sie sie in das Dialogfeld ein. Stellen Sie sicher, dass jede Sequenz über einen eindeutigen FASTA-Header verfügt, und klicken Sie dann unten im Dialogfeld auf Senden.

Auf der BLOB-Suchergebnisseite werden Alignments jeder Guide-RNA-Sequenz angezeigt, wobei jede Zeile ein Alignment darstellt. Im Idealfall sollte es für jede Guide-RNA ein Alignment geben, was auf die Einzigartigkeit dieser Guide-RNA hinweist. Vermeiden Sie nach Möglichkeit Leitfäden, die auf mehrere Stellen im Genom verweisen.

Um die Lokalisierung und Verteilung der Guide-RNA innerhalb der Region of Interest zu untersuchen, klicken Sie auf den Browser-Link unter dem Abschnitt "Aktionen" für eine der abgefragten Guide-RNAs. Der Genombrowser wird angezeigt und auf die ausgewählte Guide-RNA zentriert. Verwenden Sie die Verkleinerungsschaltflächen oben auf der Seite, um die Verteilung anderer von E-CRISP identifizierter Guide-RNAs innerhalb des interessierenden Bereichs zu visualisieren.

Wählen Sie vier vorzugsweise nicht überlappende Guide-RNAs aus, die über die interessierende Region verteilt sind. Wenn der Interessenbereich 600 Basispaare überschreitet, sollten Sie ein bis zwei zusätzliche Hilfslinien hinzufügen. Vermeiden Sie guide-RNAs mit homopolymeren Abschnitten und extremem GC-Gehalt, da diese Merkmale den Klonierungsprozess der guide-RNA behindern und die Effizienz des Guide-RNA-Targetings verringern können.

Rekonstituieren Sie Guide-RNA-Oligos in einer Endkonzentration von 100 Mikromolar in ultrareinem Wasser. Es sollten mindestens vier separate Guide-RNA-Oligos für jede Region von Interesse vorhanden sein. Erstellen Sie für jede regulatorische Region of Interest einen Pool aller Oligos, die der Region of Interest entsprechen.

Kombinieren Sie in einem Eppendorf-Röhrchen fünf Mikroliter jedes einzelnen rekonstituierten Guide-RNA-Oligos für jede Region. Mischen Sie den Pool gut durch, indem Sie ihn vortexen, dann einen Mikroliter entfernen und diesen Eloquat 1 bis 200 in Reinstwasser verdünnen. Führen Sie eine kurze PCR mit den USICS-Primern durch, um Homologieregionen an die Oligos zu binden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Zu jedem Oligo werden etwa 40 Basen hinzugefügt, was ein Produkt von etwa 100 Basenpaaren ergibt, das an beiden Enden eine ausreichende Homologie zum USIC-Spektral enthält. Richten Sie als Nächstes Gibson-Assemblierungsreaktionen auf Eis ein. Verwenden Sie 50 Nanogramm des verdauten Vektors und sieben Nanogramm des Einsatzes in einer 20-Mikroliter-Reaktion.

Richten Sie außerdem eine Gibson-Assemblierungsreaktion ein, bei der 50 Nanogramm des Vektors verwendet werden, und ersetzen Sie den Einsatz durch Wasser. Inkubieren Sie die Reaktionen der Gibson-Assemblierung 15 Minuten lang bei 50 Grad Celsius, gefolgt von einer Pause bei 4 Grad Celsius. Nachdem Sie die zusammengesetzten Produkte auf Eis umgefüllt haben, verdünnen Sie sie 1 bis 4 in Reinstwasser auf Eis.

Fügen Sie beispielsweise fünf Mikroliter Gibson Assembly Produkt zu 15 Mikrolitern Reinstwasser hinzu. Transformieren Sie als Nächstes die verdünnten Gibson Assembly-Produkte. Lassen Sie hocheffiziente kompetente Zellen auf Eis fallen und stellen Sie für jede Umwandlung 25 Mikroliter Eloquats her.

Wenn ein komplexer Pool gewünscht wird, der auf mehrere Stellen abzielt, lassen Sie genügend Zellen in verschiedene Röhren fallen, um mehrere unabhängige Transformationen durchzuführen. Platten 50 Mikroliter der transformierten Zellen und legen Sie die Platten über Nacht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Für Mini-Preps der Pools, die auf einzelne Stellen abzielen, legen Sie die Zellen direkt in drei bis fünf Milliliter LB-Bouillon, die Ampicillin oder Carbenicillin enthält.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht unter Schütteln bei 250 U/min und 37 Grad Celsius. Verwenden Sie für große Bibliotheken einen Plattenschaber, um alle Kolonien von jeder einzelnen Platte in einer Maxi-Vorbereitung zu sammeln. Dies kann erleichtert werden, indem etwa fünf Milliliter LB mit dem entsprechenden Antibiotikum in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen gegossen und die Kolonien in das Röhrchen geschabt werden.

Am Tag vor der Transfektion werden die Zellen in einer 24-Well-Platte mit einer Konfluenz von 30 bis 50 % plattiert. Plattieren Sie genügend Zellen, so dass Transfektionen in doppelter Ausführung durchgeführt werden können, und schließen Sie Vertiefungen ein, die mit Kontrollleit-RNAs transfiziert werden sollen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung verteilt sind, indem Sie die Platte nach der Zellbeschichtung vorsichtig schütteln.

In den ersten 15 Minuten alle fünf Minuten schütteln. Bereiten Sie am nächsten Tag Transfektionen gemäß den Anweisungen des Transfektionsreagenzes Ihrer Wahl vor. Verwenden Sie für Ishikawa-Zellen 550 Nanogramm Gesamtplasmid für jede Vertiefung einer 24-Well-Platte.

Verdünnen Sie die Plasmide auf eine Endkonzentration von 020 Mikrogramm pro Milliliter in serumfreien Medien. Verwenden Sie drei Mikroliter Transfektionsreagenz für jedes Mikrogramm DNA, wirbeln Sie es vorsichtig durch und inkubieren Sie es fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. 25 Mikroliter der fertigen Mischung in jede Vertiefung geben.

Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen an Lysepuffer mit 1%Beta-Mercaptoethanol vor. Saugen Sie das Medium mit einem Vakuumsauger an. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem gleichen Volumen von 1x PBS und aspirieren Sie, um so viel PBS wie möglich zu entfernen.

Geben Sie 300 Mikroliter der Lyse-BME-Lösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung. Pipettieren Sie die Lyselösung acht- bis zehnmal auf und ab und geben Sie sie auf eine Deep-Well-Platte oder 1,7 Milliliter Eppendorf-Röhrchen auf Eis. RNA kann sofort extrahiert werden, oder Lysate können für die zukünftige Verarbeitung bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden.

Es werden Leit-RNA-Designs für die drei Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in der Nähe von MMP17 gezeigt. Die Zielregion ist die Bindungsstelle für ER alpha, wie sie durch ChiP-seq definiert wird, und die vier Guide-RNAs verlaufen in dieser Region. Hier ist das erwartete Guide-RNA-Produkt nach einer kurzen PCR unter Verwendung der internen Primer des USIC dargestellt.

Die Reaktion fügt 20 Basenpaare Sequenz an jedes Ende des 59 Basenpaare umfassenden Guide-RNA-Fragments hinzu, was zu einer Sequenz von etwa 100 Basenpaaren führt. Gezeigt werden qualitative PCR-Ergebnisse aus einem Enhancer-I-Experiment an MMP17. Stellen, auf die Enhancer-I abzielt, sind mit einem schwarzen Sechseck gekennzeichnet.

Die Stellen 1 und 2 sind für die vollständige östrogene Reaktion von MMP17 notwendig, während die Stelle 3 nicht dazu beiträgt. Standort 1 kann an sich einen gewissen Ausdruck beitragen, aber die größte Aktivität ist zu beobachten, wenn die Standorte 1 und 2 aktiv sind. Sobald diese Technik für die gewünschte Zelllinie optimiert ist, kann sie in fünf bis sieben Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Guide-RNAs für Enhancer-I entwirft, komplexe Pools von Guide-RNAs erstellt und transfiziert und transfizierte Zellen erntet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine sterile Gewebekulturumgebung aufrechtzuerhalten und RNase- und DNase-freie Materialien zu verwenden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie ChiP-seq und RNA-seq, verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wo im Genom Enhancer-I bindet und wie es die globale Genexpression beeinflusst.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die östrogeninduzierte Genregulation an endogenen Loci im menschlichen Genom zu untersuchen, anstatt episomale Reporter zu verwenden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in Säugetiergewebekulturen gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen persönlicher Schutzausrüstung.