Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Unsere Gruppe untersucht die Epigenetik und Epitranskriptomik von Enhancern und konzentriert sich darauf, eine genaue Methode zur Quantifizierung von Enhancer-RNAs als Indikatoren für Enhancer-Aktivierung zu entwickeln. Da intragenische Enhancer bei den Wirtstranskripten waren, ist es schwierig, Enhancer-DER-Signale zu unterscheiden und präzise zu quantifizieren. Um zu beginnen, öffnen Sie das Terminal und geben Sie den Befehl ein, um die notwendigen Dateien und Referenzen für die Enhancer-Identifikation vorzubereiten.

Geben Sie den Befehl im Terminal ein, um in das Arbeitsverzeichnis einzutreten. Führen Sie dann den Befehl aus, der die Enhancer-Identifikationsskripte in das aktuelle Verzeichnis kopiert. Dann führt man den entsprechenden Befehl aus, um BED-Dateien für Promotorregionen, Genkörper und proteinkodierende Gene mittels Gencode-Annotation zu generieren.

Zur Vorbereitung der ATAC-seq- und Histon-ChIP-seq-Dateien zur Identifizierung der Enhancer. Geben Sie den entsprechenden Vorverarbeitungsbefehl im Terminal ein. Führen Sie als Nächstes den Befehl aus, um Enhancer mit Chromatin-Peak-Daten zu definieren und zu klassifizieren.

Gib den Befehl ein, um temporäre Strang-Informationen der intergenischen Enhancer-BED-Datei zuzuweisen. Als Nächstes geben Sie den Befehl ein, um die korrekte Strangrichtung für intergene Enhancer, die sich mit Genen auf beiden Strängen überschneiden, zu bestimmen. Berechnen Sie anschließend die strängspezifische RPKM für Gene, die sich auf demselben Strang überlappen.

Dann gib den Befehl ein, um die Strangzuweisung für intergene Enhancer abzuschließen. Weisen Sie allen intergenen Enhancern und ihren entsprechenden Gipfelregionen die endgültige Stranginformationen zu. Geben Sie den Befehl im Terminal ein, um zum Pipeline-Root-Verzeichnis zu wechseln.

Dann verwenden Sie den entsprechenden Befehl, um das Skript zur Vorbereitung der Downstream-Analyse zu kopieren. Mit dem entsprechenden Befehl bereiten Sie alle notwendigen Dateien für die Enhancer-Aggregation, die GRO-seq-Signalverarbeitung und die Quantifizierung der Enhancer-RNA vor. Als Nächstes geben Sie das Skript ein, um in das Arbeitsverzeichnis einzutreten, und kopieren Sie dann die notwendigen Skripte für die nachgeschaltete Analyse. Um Aggregationsdiagramme zu erstellen, die Chromatinsignalmuster um jeden Typ von Enhancer-Gipfel zeigen.

Gib den entsprechenden Befehl im Terminal ein. Sobald der Prompt zurückkehrt, geben Sie den Befehl ein, um die RNA-Expression von Enhancer-Effekten aus GRO-seq mittels Merkmalszählungen zu quantifizieren. Führen Sie schließlich das Skript aus, um die RNA-Expressionsniveaus der Enhancer-Gruppen mit R.In GRO-seq-Datensatz zu visualisieren und zu vergleichen.

Polynukleotid-Tails waren vor dem Trimmen vorhanden und wurden erfolgreich entfernt, nachdem die Trimming-Parameter angewandt wurden, beeinträchtigte End-ATAC-seq-Datensätze. NextEra-Adaptersequenzen wurden in beiden roten Paaren vor dem Trimmen erkannt und nach der Vorverarbeitung der ChIP-seq-Datensätze für die H3K27-Acetylierung entfernt, die minimale Adapterkontamination zeigte, die nur eine Standardtrimmung erforderte. Die Filterung der ATAC-seq-Daten ergab 71.165 nicht-motorische offene Chromatinregionen, darunter 47.317 Enhancer-Regionen, von denen 23.147 als aktive Enhancer und 24.170 als nicht-aktive Enhancer aufgrund von Überlappung mit Histonmarken klassifiziert wurden; von allen Enhancer-Regionen waren 45,2 % intergen und 54,8 % intragen. Diese Verteilung war in den Kategorien von nicht-aktiven und aktiven Enhancern ähnlich.

Ein intergenischer Enhancer stromaufwärts des NENO-Gens zeigte eine starke Anreicherung für ATAC-seq, H3K4-Monomethylierung, H3K27-Acetylierung und GRO-seq-Signale. Ein intragenischer Enhancer in der Nähe des CHD2-Gens zeigte ähnliche Chromatin- und Transkriptionsmerkmale wie der NENOG-Enhancer mit klaren Signalen in allen vier Datensätzen. Aggregationsdiagramme zeigten, dass aktive Enhancer eine koordinierte Anreicherung von ATAC-seq, H3K4-Monomethyl- und H3K27-Acetylierungssignalen aufwiesen.

Während nicht-aktive Enhancer keine H3K27-Acetylierungsanreicherung hatten, aber starke ATAC-seq- und H3K4-Monomethylsignale behielten. Aktive Enhancer zeigten signifikant eine höhere GRO-seq-abgeleitete Transkription als nicht-aktive Enhancer sowohl in intergenen als auch in intragenen Regionen. Wir stellen diese trendbewussten eRNA-Berechnungspipelines zusammen, die durch aktivitätsabhängige Transkription im intergenen oder intragenischen Kontext validiert werden.

Wir untersuchen DER einer standardisierten zugänglichen eRNA-Quantifizierung, insbesondere für intragene Enhancer, die durch das Wirtsgenom gefälscht werden. Wir werden die selbstgesteuerte Identifikation überarbeiten, Betriebstranskripte von Trends und Benchmark-Analysepipeline über Genomassemblierungen, experimentelle Protokolle und Zelltypen trennen.