Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Diese Methode kann Wissenschaftlern helfen, die produktive Nutzung von Pankreasinseln zu maximieren, um mehrere Ergebnisse an jeder Probe in ihrer nativen Gewebearchitektur zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser neuen Einbettungsmethode besteht darin, dass die Inselzellen gleichmäßig über einen genau definierten Bereich verteilt sind, wodurch viele Inselzellen in der Schnittebene platziert werden, was die experimentelle Ausbeute aus diesem Material mit geringer Abundanz optimiert. Das Verfahren wird von Dr. Yahui Kong, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter in meinem Labor, vorgeführt.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie eine p200-Pipettenspitze mit geringer Bindung und ein kalibriertes Gitter unter einem Stereomikroskop, um 250 Inseläquivalente von Hand auszuwählen. Sie werden in jedes 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen mit geringer Bindung übertragen. Lassen Sie die Inselzellen am Boden des Mikroröhrenröhrchens absetzen.

Verwenden Sie dann eine Pipette mit einer frischen p200-Spitze, um den größten Teil des Überstands vorsichtig zu entfernen. Achten Sie darauf, keine Inseln zu entfernen. Geben Sie einen Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie in einer Schwingschaufelzentrifuge, bis die Geschwindigkeit das 200-fache der Schwerkraft erreicht, und stoppen Sie dann die Drehung.

Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen gesamten PBS-Waschvorgang für insgesamt zwei Waschgänge. Fügen Sie als nächstes 500 Mikroliter entweder 10%ige Formalinlösung oder 4%frisch hergestelltes Paraformaldehyd hinzu.

Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fixieren. Verwenden Sie danach eine Pipette mit einer p200-Spitze, um das Fixiermittel zu entfernen. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie, bis die Geschwindigkeit die 200-fache Schwerkraft erreicht, und stoppen Sie dann die Drehung.

Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie dann den gesamten PBS-Waschvorgang noch einmal für insgesamt zwei Waschgänge. Bereiten Sie das gewünschte Gel in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie anschließend diese Mikrozentrifugenröhrchen in einen Heizblock bei 70 Grad Celsius, um das Gel zu erwärmen.

Verwenden Sie eine abgeschnittene Mikropipettenspitze, um 10 Mikroliter agaroseblaue Kügelchen pro Probe in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Geben Sie einen Milliliter PBS zu den Kügelchen und zentrifugieren Sie dann eine Minute lang bei 800-facher Schwerkraft. Entfernen Sie das PBS und wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal.

Nach dem zweiten Waschen suspendieren Sie die Perlen wieder in einer angemessenen Menge PBS. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Inseln, bis die Geschwindigkeit das 200-fache der Schwerkraft erreicht, und stoppen Sie dann die Drehung. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands.

Schneiden Sie mit einer Schere das Ende einer 10-Mikroliter-Mikropipettenspitze für jede Probe ab. Geben Sie 10 Mikroliter Kügelchen in jedes Inselröhrchen mit einer sauberen abgeschnittenen Spitze für jede Probe. Dann zentrifugieren, bis die Geschwindigkeit das 200-fache der Schwerkraft erreicht.

Verwenden Sie danach einen ungeschnittenen 200-Mikroliter, gefolgt von einer 10-Mikroliter-Spitze, um so viel PBS wie möglich zu entfernen. Beschriften Sie die Objektträger zur Probenidentifikation und legen Sie sie mit dem erwärmten Gel auf die Bank in der Nähe des Heizblocks. Schneiden Sie mit einer Schere die Enden von einigen Mikropipettenspitzen mit geringer Bindung pro Probe ab.

Geben Sie mit einer Mikropipette mit einer abgeschnittenen Spitze warmes Gel in ein Röhrchen mit Inselchen und Kügelchen. Sofort mischen, dabei die Bildung von Blasen vermeiden. Tragen Sie diese Mischung auf einen Objektträger auf, der eine Scheibe in der Nähe des Randes des Objektträgers bildet, während Sie Platz für den äußeren Gelring lassen.

Tippen Sie dann ein paar Mal vorsichtig auf die Folie, um die Inselchen und Perlen zu setzen. Geben Sie 20 Mikroliter warmes Gel in das Probenröhrchen und mischen Sie das neue Gel mit den verbleibenden Inseln und Kügelchen. Wenden Sie diese Mischung auf dieselbe Folie an, die die Originalscheibe umgibt.

Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit frischen, vorgestanzten Spitzen, bis die Scheibe die gewünschte Größe und Dicke hat. Stellen Sie sicher, dass Sie jede Disk einzeln vorbereiten und die Probenreihenfolge im Auge behalten, wenn Sie mehrere Disks auf jeder Seite platzieren. Legen Sie dann die Objektträger auf eine ebene Fläche aus nassem Eis und decken Sie sie ab.

Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten ruhen oder bis das Gel fest wird. Entfernen Sie dann die Objektträger und achten Sie darauf, die Rückseite jedes Objektträgers zu trocknen. Beschriften Sie für jede Probe eine Gewebekassette für die Biopsieverarbeitung und das Einbetten.

Drücke die Scheibe mit der stumpfen Kante einer Rasierklinge vorsichtig aus jeder Richtung, um sie aus dem Glas zu befreien. Wenn sie sich leicht gleiten lässt, schieben Sie die Scheibe langsam von der Folie und legen Sie die Scheibe mit der flachen Seite nach unten direkt auf das Papier. Es kann schwierig sein, die unterschiedlichen Scheiben intakt zu halten, wenn man sie vom Glasschieber auf das Papier schiebt.

Wenn eine Falte in der Scheibe auftritt, lassen Sie sie in die ursprüngliche Position zurückkehren, fügen Sie mehr Gel hinzu und gelieren Sie den Objektträger erneut. Falten Sie das Papier um die Disk, um Bewegungen zu vermeiden. Übertragen Sie diese in die Kassette und schließen Sie dann die Kassette.

Tauchen Sie die Kassette in ein mit PBS gefülltes Becherglas. In dieser Studie wird eine modifizierte Gelscheiben-basierte Einbettungsmethode verwendet, um effizient eine hohe Ausbeute an Inselzellen pro Schnitt zu erzeugen. Die Morphologie der Nagetierinseln ist nach der Genesung nach der Isolierung im Inselmedium deutlich intakter und zeigt eine glatte, abgerundete Oberfläche und eine kompakte kugelförmige Form.

Die Tatsache, dass die Morphologie der menschlichen Inselzellen ähnlich ist, unabhängig davon, ob sie am Tag der Ankunft oder nach der Bergung nach dem Versand über Nacht eingebettet sind, könnte darauf zurückzuführen sein, dass sich die Inselzellen vor dem Versand von der Isolationsbelastung erholen. Im Vergleich dazu weisen die Paraffinschnitte, die mit der alten Mikroröhrchentechnik gewonnen wurden, eine kleinere Gewebequerschnittsfläche mit weniger Inselzellen pro Schnitt und dicht gepackten Inselzellen und Kügelchen auf. Wie hier gezeigt, ist diese Technik in der Lage, qualitativ hochwertige Inselschnitte für die histologische und Immunfluoreszenzfärbung zu erstellen.

Die Insulin- und Glukagonfärbung zeigt die vielfältige Zusammensetzung und Heterogenität der Inselarchitektur und zeigt die bekannten Architekturunterschiede zwischen menschlichen, Maus- und Ratteninseln. Diese Bilder zeigen auch serielle Schnitte derselben Inseln. Dies zeigt, dass diese Technik in der Lage ist, mehrere Schnitte von denselben Inseln zu erhalten.

Einmal gemeistert, spart diese Technik Zeit gegenüber der Mikrozentrifugentechnik. Wenn die Scheibe auf einer ebenen Fläche statt in einem Rohr geformt wird, ist es einfacher, die Scheibe zur Verarbeitung physisch auf die Kassette zu übertragen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie der Inselzellen geben kann, kann sie auch auf andere Zellblöcke oder brüchige Gewebe angewendet werden, die schwer zu schneiden sind.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, ein Gel mit kleinem Volumen zu verwenden, um das Gewebe auf einer kleinen Fläche zu konzentrieren und die Scheibe auf einer ebenen Fläche zu formen. Es ist auch wichtig, Mikrozentrifugenröhrchen und Pipettenspitzen mit geringer Bindung zu verwenden, um die Gewebeausbeute zu verbessern. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Inselbiologie den Weg, um die Zusammensetzung und Heterogenität von Zelltypen, die Zell-Zell-Interaktion und die Genregulation in ganzen kultivierten Inselzellen in ihrer nativen Architektur zu untersuchen.

Die Möglichkeit, 10 oder mehr Schnitte mit vielen Inselzellen aus einer einzigen Versuchsbedingung zu erzeugen, ermöglicht die Quantifizierung mehrerer Ergebnisse auf demselben Material und verbessert so die experimentelle Effizienz. Die Anwendung dieser Technik auf Gewebeproben mit begrenzter Abundanz kann auch für andere Bereiche von Vorteil sein. Elemente dieses Verfahrens müssen möglicherweise geändert werden, um den Anforderungen der Benutzer gerecht zu werden.

Die Fixationsintensität und die Teilung sollten optimiert werden. Mit dieser Technik können dickere oder größere Scheiben erzeugt werden. Einfache Verarbeitungsschritte für die Einbettung müssen ggf. verschachtelt werden und sollten optimiert werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen hochwertigen Agarosezellblock für Paraffinschnitte ganzer kultivierter Pankreasinseln erzeugen können.