Name: Rezeptor-Autoradiographie-Protokoll für die Lokalisierte Visualisierung von Angiotensin II-Rezeptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Rezeptor-Autoradiographie zur Lokalisierung und Quantifizierung von Angiotensin-II-Rezeptoren im Rattengehirn. Diese Methode ermöglicht quantitative und qualitative Analysen für neurologische und kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH Grant HL-113905

Alle Tierverfahren für diese Studie durchgeführt von der Institutional Animal Care und Use Committee von Nova Southeastern University in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt wurden, 8. Auflage (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ). 1. Vorbereiten Gewebeschnitten für Receptor Autoradiographiestift <ol><li> Nach dem Opfer, Ernte frische Hirngewebe und in Alufolie wickeln und in einen -20 ° C Gefrierschrank so schnell wie möglich. Um die richtige Form beibehalten, legen Gehirne in einem Gehirnform, die das Innere des Schädels simuliert, in Alufolie wickeln und in eine - 20 ° C Gefrierschrank. Nach 30 min Ort Gewebe in einem verschließbaren Gefrierkombination Aufbewahrungstasche und für die Langzeitlagerung zu einem -80 ° C Gefrierschrank bewegen. <ol><li> Besorgen Sie sich die frisch gefrorene Gewebeprobe von Interesse aus dem -80 ° C Gefrierschrank und Transfer zu einem Kryostaten auf ein Minimum von -10 ° C und maximal 18 ° C eingestellt, Auftauen zu vermeiden. </li&gt; <li> Legen Sie die Probe auf die Gewebehalterung mit einem Glykol und Harzbasis Einbettmediums nur ein kleiner Teil der Probe in das Medium eingebettet wird. Für Gehirn ist das Gehirn vertikal montiert in der koronalen Ebene zu ermöglichen sectioning. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gewebe montieren auf dem Mikrotom innerhalb des Kryostaten und ziehen Sie sie fest an ihrem Platz. Sicherstellen, dass die linken und rechten Seite des Gehirns sind in den gleichen antero-posterior-Koordinaten, und die dorso-ventralen Achse senkrecht zu häufig verwendeten Gehirn Atlanten. </li><li> Beginnen mit der gewünschten Dicke Schneiden (20 &amp; mgr; m empfohlen) und Auftauen die Schnitte auf Objektträger in vertikaler Richtung Halterung eine größere Oberfläche des Raumes in der Folie zu haben. Sammeln Schnitte auf Objektträger in aufeinanderfolgende Gruppen von fünf, dh der erste Satz von Schiebern versehen sind 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 und 1-5 (Figur 3). </li><li> Nach einer Reihe von Folien mit Abschnitten Befüllen lufttrocknen lassen Folien für bis zu 1 Stunde, dann die sli platzierendes in einem Kunststoff-Gleitkastens in einer selbstdichtenden Gefrierschrank Aufbewahrungstasche, und bei -20 ° C. </li></ol> 2. Receptor Autoradiographiestift ACHTUNG: Die Radioaktivität. Verwenden Sie Schutzkleidung Radioaktivität zu behandeln. Die Entsorgung wird bei Einrichtung abhängig und müssen Richtlinien folgen richtig (Halbwertszeit 60 Tage) oder abgeholt werden von einem zertifizierten Unternehmen zu zerfallen. <ol><li> Entfernen Sie die &quot;-1&quot; und &quot;-2&quot; Dias von Interesse aus dem -20 ° C Gefrierschrank und montieren in Schiebegriffe (Abbildung 5). Montieren Sie die &quot;-1&quot; Dias zusammen für &quot;nicht-spezifische&quot; Behandlung, und die &quot;-2&quot; Folien für &#39;total&#39; Behandlung. &quot;Nicht-spezifische&quot; Gläser enthalten 10 uM Endkonzentrationen von PD123319 einem AT 2 R - Antagonisten, und Losartan ein AT 1 R - Antagonisten, in Testmedium Puffer (AM5) (Tabelle 1), die &quot;Gesamt&quot; Bindung Gläser werden nur 10 enthalten uM PD123319 in AM5. </li><li> Kehren Sie die Rutschegreift die Dias in die Vorinkubation Färbetrog mit 35-40 ml AM5 und entsprechende Inhibitoren für 30 Minuten bei Raumtemperatur gefüllt zu platzieren. Starten Sie nachfolgende Sätze in ihrer Vorinkubation Bad in 4-Minuten-Intervallen. </li><li> Objektträger sofort aus der pre Inkubationslösung übertragen an die Inkubation slide mailers 10 ml AM5 enthält, sowie eine vorbestimmte Konzentration von 125 I-SI-Ang II (berechnet in Abbildung 4) mit den jeweiligen Inhibitoren für 60-90 min bei Raum Temperatur. Wenn ausreichend Radioligand ist, kann 10 Folien platziert werden in modifizierten Schiebegriffe (Rücken an Rücken) und mit 125 I-SI-Ang II in Färbetrog inkubiert. </li><li> Platz gleitet zurück in die Schiebegriffe (falls erforderlich), Fleck, und spülen Sie vorsichtig zur Verwirbelung 1-2 sec in 400 ml destilliertem Wasser in zwei getrennten Behältern. </li><li> Die Objektträger nacheinander in vier Coplin Gläser mit 35-40 ml AM5 für genau 1 min jeweils (wie in Abbildung 4 dargestellt &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Nach der letzten 1 Minute Spülen, vorsichtig schwenken die Abschnitte für 1-2 sec in vier Änderungen eiskaltem destilliertem Wasser. </li><li> Föhnen Sie die Folien mit kühler Luft (Achtung: heiße Luft verflüchtigt sich die radioaktive Verbindung) unter Verwendung von vier Haartrockner aus verschiedenen Winkeln für 4 min (Abbildung 5) eingerichtet, bis alle Abschnitte trocken sind, dann legen Sie auf einem Papiertuch. </li><li> Berg Träger mit Gewebe auf einen Karton für Apposition zu einem Röntgenfilm mit doppelseitigem Klebeband nach oben zeigt. </li><li> Berg mindestens eine, 125 Jod Kalibrierstandard Schieber auf jedem Karton (Abbildung 6). Hinweis: Kalibrierstandards von Hirn Paste bestehen gründlich mit 125 Jod an eine Verbindung gebunden gemischt , um einen Phenolring enthält, verdichtet durch Zentrifugation in einer 1 ml Tuberkulin - Spritze, die mit der gleichen Dicke wie die Gehirnschnitte geschnitten Kryostaten und auftauen montiert auf Mikroskop Dias. Alternativ Standards 125 I KalibrierungKunststoffharz bei 20 &amp; mgr; m Dicke geschnitten können kommerziell erhalten werden. Das Kunststoffharz in diesen Standards schirmt den Film partiell vor der Strahlung, so dass eine Gewebeäquivalenz von ~ 40% sollten in die Kalibrierungs berücksichtigt werden. </li></ol> 3. Film Belichtung und Entwicklung <ol><li> Fahren Sie mit einer Dunkelkammer mit einem Riemen-zurück Röntgenkassette und Autoradiographie Film. Öffnen Sie die Kassette und legen Sie den Karton mit Dias innen (Abbildung 6). <ol><li> Schalten Sie das Licht aus, und schalten Sie den Dunkelkammerlicht. Öffnen Sie vorsichtig die Schachtel mit den X-Ray Film, ein Film zu entfernen, und legen Sie den Film glänzenden Seite nach oben (mit dem gezackten Rand auf der unteren rechten Ecke) oben auf den Schlitten in der Kassette. Schließen Sie die Kassette vorsichtig und verdrehen Sie die Verriegelungsstangen Licht (Abbildung 6) heraus zu versiegeln. Belichten der Objektträger für mehrere Tage bis mehrere Wochen bei -20 ° C. </li></ol></li><li> In der Dunkelkammer, öffnen Sie die Kassette und fahren Sie mit dem Filmentwicklungs process. <ol><li> Legen Sie die Dias in die Fächer nacheinander; Entwickler für 2 min, Wasser 5% Eisessig für 30 Sekunden enthält, und Fixiermittel für 5 min. Die Filme werden die in eine Schale gelegt mit Wasser 20 Minuten lang läuft, dann nicht länger als 10 Sekunden in Photoflo gestellt und gehängt. Anmerkung: Die Belichtungszeit wird empirisch bestimmt und mehrere Filme mit unterschiedlichen Belichtungszeiten beinhalten kann: lange genug messbare Signale von den Bereichen mit geringer Bindungs ​​zu erhalten, aber nicht so lange, wie der Film durch Bereiche mit hoher Bindungs ​​zu sättigen. Sobald akzeptablen Belichtungen erhalten werden, dann mit dem nächsten Schritt fort. </li></ol></li></ol> 4. Histologie <ol><li> Bereiten Sie die Thionin - Farbstoff und Färbereagenzien (Tabelle 2, Abbildung 7). <ol><li> Legen Sie die &quot;-3&quot; Folien in der Folienträger, und die Übertragung in der angegebenen Reihenfolge mit entsalztem Wasser beginnt für 1 min, dann Thionin-Farbstoff-Lösung für 10 min, gefolgt von drei Einbrüche in deionized Wasser und einer 30 sec waschen in VE-Wasser. </li><li> Im Anschluss an das Wasser, legen Sie die Dia-Rack in Ethanol wäscht wie folgt; 50%, 70% und 90% für 30 sec, gefolgt von zwei Waschungen Ethanol bei 100% für je 1 min. Schließlich legen Sie die Objektträgergestell in Xylol für 3 Minuten, dann übertragen auf einen zweiten Xylol-Lösung für 5 min. </li></ol></li><li> Jeweils einen Objektträger in einer Zeit aus dem letzten Xylolbad und decken die obere Kante des Schlittens mit einer Harzbasis in einem organischen Lösungsmittel Eindeckmediums, und legen Sie eine 24 mm x 60 mm Deckglas auf die Folie. Lassen Sie Folien ausreichend trocken für ~ 48 Stunden und dann scannen in den Computer bei 2.400 dpi Graustufen. </li></ol> 5. Densitometrische Bildanalyse <ol><li> Legen Sie den Film glänzende Seite nach unten, mit dem gezackten Rand auf der unteren linken Ecke und scannen eine proprietäre Scanner der Lage, die Filmdichte Informationen ohne jegliche Verzerrung in dem Abbildungssystem Computer zu übertragen. </li><li> Öffnen Sie die proprietäre Bildgebungs sysTEM- und verwenden die Kalibrierungsbalken Kalibrierstandards für zukünftige densitometrische Analyse der Bilder auf dem Film (- 12 Figuren 9) herzustellen. </li><li> Messen Sie Bereiche von Interesse entweder durch eine Vorlage zur Gründung oder empirisch umreißt die Bereiche von Interesse. Die Daten werden die gesammelten und basierend auf dem Film getrennt, entweder Kontrolle oder Wildtyp (Abschnitt) und Region. Stellen Sie sicher , Dichte (fmol / g) enthalten, Scan - Bereich und die gesamte Zielgebiet in Messungen (Abbildung 9). <ol><li> Stellen Sie den Scanbereich Bars indem sichergestellt wird, dass Region von Interesse fällt zwischen den Parametern der Hervorhebung (Abbildung 10). </li><li> Exportieren von Daten in eine Tabelle (Tabelle 4). Multiplizieren Sie die Dichte mal die Gesamtzielbereich, dann teilen Sie durch den Scan-Bereich, um den Wert für die Bindung von diesem spezifischen Bereich zu erhalten. Sobald dies für alle Messwerte durchgeführt wird, das Substrat die etablierte unspezifische von insgesamt die spezifische Bindung p zu ergebenübel nehmen. Mittelwerte können auch für diese Werte durchgeführt werden. </li></ol></li></ol>

Robert Speth hat Antikörper gegen Angiotensin-II-Rezeptoren an einen kommerziellen Anbieter lizenziert und erhält Lizenzgebühren aus dem Verkauf dieser Antikörper. Die anderen Autoren haben nichts offenzulegen.

Das beschriebene Protokoll identifiziert die Visualisierung von &quot;total&quot; und &quot;nicht-spezifische&quot; Bindung des Radioliganden in benachbarten Abschnitten der koronalen Abschnitte eines Nagetier Gehirn zuvor geerntet und bei -80 ° C gelagert, und jedes Gewebe leicht auf praktisch sein kann, dass hat anatomisch Unterbauten, die Differential-Display Mengen an Rezeptoren oder Radioligand-Bindungsstellen aufgelöst. Die Verfahren im Protokoll beschrieben sind einfach und die Analyse ist entscheidend für die ko...

Kardiovaskuläre Erkrankungen weiterhin die häufigste Ursache für Tod und Behinderung in den Vereinigten Staaten zu sein, im Jahr 2011 1 mehr als 30% der Todesfälle in den USA verursacht. Aus den jüngsten Statistiken von der American Heart Association zeigen , dass mehr als eine Person in drei hat ein oder mehr Art von kardiovaskulären Erkrankungen. Kardiovaskuläre Forschung weiterhin Fortschritte gegen das Verständnis dieser Krankheit zu machen, aber als Generationen beginnen immer älter es ist zwingend notwendig, diese Bemühungen fortzusetzen. Das Renin-Angiotensin - System (RAS) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des kardiovaskulären Systems in erster Linie von Atherosklerose, Entzündung, systemische Vasokonstriktion, und die Aktivierung des sympathischen Nervensystems (Figur 1) 2-8 fördern. Der RAS ist ein Hormonsystem, das aktiviert wird, wenn juxtaglomerulären Zellen der Niere in den Blutstrom Renin in Reaktion absondern, um Blutdruck verringert, erhöht sympathetic Stimulation oder verminderte Natriumfluss durch die Macula densa. Renin-Angiotensinogen metabolisiert (in der Leber synthetisiert) Angiotensin I zu bilden (Ang I). Ang I wird dann durch das Angiotensin-Converting-Enzym (ACE), ein Ektoenzym auf der luminalen Seite des vaskulären endothelialen Zellen metabolisiert, hauptsächlich in den Lungen und Nieren, Angiotensin II zu bilden (Ang II), das Haupt Effektor Peptid der RAS. Ang II ist in der Lage aktivierenden zwei Rezeptorsubtypen; der Typ 1 - Rezeptor (AT 1 R) und der Typ - 2 - Rezeptor (AT 2 R), die beide die das kardiovaskuläre System zu regulieren, beibehalten Flüssigkeits- und Elektrolyt Homöostase und sind nun die kognitive Funktion zu beeinträchtigen , und neurodegenerative Krankheitsprozessen 8,9 betrachtet. Eine lokale, gehirnspezifische RAS wird berichtet, Ang II unabhängig zu synthetisieren. Im Gehirn wird das Vorläuferprotein Angiotensinogen in Astroglia 10 durch ein Renin-ähnliches Enzym zu Ang I 3 möglicherweise Prorenin umgewandelt synthetisiert, gebunden an den Rezeptor Prorenin11 und überführt anschließend durch das Angiotensin-Converting - Enzym zu Ang II , die reichlich auf der extrazellulären Oberfläche von Neuronen im Gehirn 12 exprimiert wird. Diese intrabrain erzeugt Ang II ist der Agonist für das Gehirn AT 1 und AT 2 Rezeptoren , die von durch Blut übertragbaren Ang II isoliert sind. Während die AT 1 R eine wichtige physiologische Rolle spielt, ist es für seine pathophysiologischen Wirkungen im ganzen Körper besser bekannt ist , in erster Linie das Herz - Kreislauf - System und die Nieren (Abbildung 2) zu beeinflussen. Wenn Ang II an den R AT 1 bindet, verursacht es eine Vasokonstriktion; zunehmende Resistenz des Blutdrucks, um den Blutfluss und erhöht. Es fördert auch die Synthese und Sekretion von Aldosteron und Vasopressin, zu einer erhöhten Natrium- und Wasserretention führt. Diese Effekte können auch ischämischer Hirnschädigung und kognitiven Störungen induzieren und an der Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Diabetes sowie kürzlich Lernen und Gedächtnis beeinflussen 13-15 identifiziert. Es gibt eine Rückkopplungsschleife in der RAS daß AT 1 R auf den juxtaglomerulären Zellen in der Niere inhibiert Renin - Sekretion. Interessanterweise im Allgemeinen die AT 2 R Gegen regelt die Wirkung von AT 1 R, was zu Vasodilatation, Neuritenwachstum, axonalen Regeneration, Anti-Proliferation und cerebroprotection unter vielen anderen 16-20. Der R AT 2 hat auch als Ziel für Anti-Bluthochdruck und vor kurzem, anti-Krebsmittel 21 identifiziert. Die Bestimmung der Lokalisierung und Dichte von Ang II-Rezeptoren in verschiedenen Geweben und wie werden sie durch verschiedene Behandlungen und Krankheitszuständen mit quantitativen densitometrischen Rezeptor Autoradiographie die Rolle spielt, die RAS in bestimmten Krankheiten aufdecken helfen beeinflusst. Rezeptor-Autoradiographie wurde seit über 30 Jahren als wirksames Verfahren zum Anzeigen der Anwesenheit von Angiotensin I verwendetI - Rezeptoren und andere Komponenten der RAS im Gehirn und anderen Geweben der Ratte, Maus, Meerschweinchen, Hund und Mensch unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen 22-34. Die Bedeutung Ang II - Rezeptoren der Lokalisierung innerhalb des Gehirns ist , dass eine funktionelle Neuroanatomie zu den Aktionen der Ang II im Gehirn anwenden kann, beispielsweise auf das Vorhandensein von AT 1 R in paraventricularis Nukleus des Hypothalamus (PVN) eine Funktion von Ang II im Gehirn zu stimulieren Vasopressin, Oxytocin oder Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) Freisetzung oder Aktivierung des sympathischen Nervensystems. So Medikamente, die den AT 1 R blockieren könnten mit Überaktivität des Gehirns RAS assoziiert einige dieser PVN-vermittelte Effekte zu verringern. Unfertige legt nahe , dass die Verwendung von AT 1 R - Antagonisten posttraumatische Belastungsstörung (PTSD) -induzierte Freisetzung von CRH verringern und lindern die Symptome von PTSD (Hurt et al., Zur Veröffentlichung eingereicht). Der PVN, subfornicalOrgel (SFO) und Amygdala zur Regulierung der Homöostase, Appetit / Durst, Schlaf, Gedächtnis, emotionale Reaktionen bekannt, und sind die Zielgebiete dieser Demonstration Studie. Diese Regionen wurden durch Sammeln Koronalschnitte eines Gehirns auf Mikroskop-Objektträger untersucht, und Behandeln der Schnitte mit spezifischen Inhibitoren zusammen mit einem spezifischen Radioligand für Ang II-Rezeptoren. In dieser Studie wurden alle Materialien und Reagenzien zusammen mit vorgeschlagen Anbieter aufgelistet sind, wurde Jod-125 verwendet , um einen Ang II - Rezeptor - Antagonist radioaktiv zu markieren, Sarcosin 1, Isoleucin 8 Ang II (SI Ang II), die dann als mono 125 I gereinigt wurde -SI Ang II Methoden unter Verwendung von HPLC wie zuvor 35 beschrieben. Die Verwendung dieser hohen spezifischen Aktivität Radioligand ermöglicht die Visualisierung von Bereichen mit niedriger, mittlerer und hoher Rezeptordichte nach dem Belichten der radiomarkierten Abschnitte Röntgenfilm. Durch den Film mit Gehirn Paste Standards kalibriert bekannten Mengen von Jod-125 enthält, die spezifische MengeRezeptor Ang II in einem Bereich Bindung kann quantifiziert werden. In experimentellen Untersuchungen kann die Ang II-Rezeptor in den Gehirnen von Versuchspersonen Bindung in den Gehirnen von Kontrollpersonen, die verglichen werden. Dies kann angeben, ob die Wirkungen von Ang II in Reaktion auf eine genetisch bedingte Erkrankung verändert sind, phänotypische Abnormalität, Krankheitszustand oder medikamentöse Behandlung. Dieses Wissen kann dann zur Entwicklung von Therapien angewendet werden, Krankheiten, die mit Dysregulation des RAS verbunden zu behandeln. Alternative Techniken , die Rezeptor identifizieren Bindungsstellen, aber mit reduzierter anatomischen Auflösung sind Bindungsassays , die Gewebemembran - Zubereitungen verwenden aus Gewebehomogenisate abgeleitet, die mit dem Radioligand über einen Bereich von Konzentrationen Radioligand - Bindungsaffinität als die Dissoziationskonstante (K D zu bewerten inkubiert ) und die maximale Bindungskapazität (B max) des Gewebes von Interesse. Das hier beschriebene Protokoll kann in fünf Haupt Co gebrochen werdenmponents: Vorbereiten Gewebeschnitten für Receptor Autoradiographie; Rezeptor-Autoradiographie; Filmbelichtung und Entwicklung; Histologie; und Densitometrische Bildanalyse.

<table><tbody><tr><td>500 ml Kunststoffbecher</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Deckgläser</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiographie-Bildgebungsfilm 24 mm x 30 cm</td><td>Carestream-Biomax MR Film</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin (aus Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>Kartonbogen 8 x 11</td><td>Halbmond Illustrationskarton #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Gewerbliche Haartrockner</td><td>Conair</td><td>Modell SD6X</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Kulturröhrchen</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Dinatriumsalz, Dihydrat)</td><td>USB Corporation</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>16-100-210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formulary Substitute für D-19 Developer</td><td>Photographers Formulary, Inc.&nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep/OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Film Fixer</td><td>Kodak</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>Photo flo</td><td>Kodak</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>Losartan</td><td>Fisher/Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&trade; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Objektträgergriffe</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium geladene Objektträger, fein geschliffene Kante</td><td>Premiere Mikroskop Objektträger</td><td>9308W</td><td></td></tr><tr><td> 125I Liganden</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>125SI-Ang II&nbsp;</td><td>George Washington University</td><td>Radiojodiert von Dr. Speth</td><td></td></tr><tr><td>Slide Mailers</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdibasisches Phosphat wasserfrei (Na2PO4)</td><td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat (wasserfrei)</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Thionin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>Röntgenkassette (10 x 12)</td><td>Spectronics Corporation</td><td>Viereckige</td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Kassette</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

rezeptor-autoradiographie-protokoll für die lokalisierte visualisierung von angiotensin ii-rezeptoren

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Dieses Protokoll beschreibt Rezeptorbindungsmuster für Angiotensin II (Ang II) im Gehirn der Ratte ein Radioligand spezifisch für Ang II-Rezeptoren Rezeptor unter Verwendung von Autoradiographie-Mapping durchzuführen. Gewebeproben werden geerntet und bei -80 ° C gelagert. ist ein Kryostat das Gewebe (Gehirn) und Auftauen montieren die Schnitte auf geladene Objektträger zu koronalen Abschnitt verwendet. Die Objektträger angebrachten Gewebeschnitte werden in 125 I-SI-Ang II inkubiert Ang II - Rezeptoren radioaktiv zu markieren. Benachbarte Objektträger werden in zwei Gruppen unterteilt: &quot;unspezifische Bindung&quot; (NSP) in Gegenwart eines Rezeptor sättigenden Konzentration von nicht-radioaktiv markierten Ang II oder ein AT1 - Ang II - Rezeptor - Subtyp (AT 1 R) selektive Ang II - Rezeptor - Antagonist und ohne AT 1 R - Antagonisten &quot;Gesamtbindung&quot;. Einer sättigenden Konzentration von AT 2 Ang II - Rezeptor - Subtyp (AT 2 R) Antagonist (PD123319, 10 uM) ist auch in der incubatiauf Puffer 125 I-SI-Ang II - Bindung an den AT 1 R Subtyp zu begrenzen. Während eines 30 min Vorinkubation bei ~ 22 ° C, NSP Rutschen ausgesetzt sind 10 uM PD123319 und Losartan, während &quot;Gesamtbindung&quot; Dias 10 uM PD123319 ausgesetzt sind. Die Objektträger werden dann mit 125 I-SI-Ang II in Gegenwart von PD123319 für &quot;Gesamtbindung&quot; und PD123319 und Losartan für NSP in Assay - Puffer, gefolgt von mehreren &quot;wäscht&quot; in Puffer inkubiert und Wasser zu entfernen Salz und nicht spezifisch gebundene Radioligand. Die Folien werden mit Schlag-Trockner getrocknet und dann einer Autoradiographie Film belichtet eine spezielle Folie und Kassette. Der Film wird entwickelt und die Bilder werden in einen Computer gescannt für visuelle und quantitative Densitometrie ein proprietäres Bilderzeugungssystem und eine Tabelle verwendet wird. Ein zusätzlicher Satz von Dias werden für die histologische Vergleiche Thionin-gefärbt. Der Vorteil der Rezeptor-Autoradiographie unter Verwendung ist die Fähigkeit, zu visualisierenAng II - Rezeptoren in situ, in einem Abschnitt einer Gewebeprobe, und anatomisch den Bereich des Gewebes zu identifizieren , indem es zu einem benachbarten histologischen Bezugsabschnitt zu vergleichen.

Der Überblick über den Stoffwechselweg des Renin-Angiotensin - System ist in Abbildung 1 und den direkten Fokus auf die Angiotensin - II - Rezeptor - Subtypen (AT 1 R und AT 2 R) dargestellt ist in Abbildung 2 beschrieben. Abbildung 3 zeigt die Übertragung von koronalen Hirn Schnitte auf Objektträger, die in Figur 4 gesehen werden dann mit einer vorbestimmten 125 I-siang II - Konzentratio...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Beschreibung der Lokalisation von Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptoren im Rattengehirn durch quantitative, densitometrische In-vitro-Rezeptor-Autoradiographie unter Verwendung eines Jod-125-markierten Analogons von Angiotensin II.

Rezeptor-Autoradiographie-Protokoll für die Lokalisierte Visualisierung von Angiotensin II-Rezeptoren

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die anatomische Lokalisation und Quantifizierung der Expression von Angiotensin-II-Rezeptoren in Gehirnschnitten mithilfe der Rezeptor-Autoradiographie und der histologischen Identifizierung von Hirnstrukturen durchzuführen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung der Hirnregionen, in denen Angiotensin II Einfluss auf Verhalten, kognitive Funktionen und das kardiovaskuläre System ausübt, und liefert somit Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Therapien zur Behandlung neurodegenerativer und kardiovaskulärer Erkrankungen. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie quantitativ und qualitativ ist und die Identifizierung funktioneller Rezeptoren für Angiotensin II mit höherer Spezifität als andere Methoden ermöglicht.Diese Methode kann auch die Funktionalität anderer Hormonrezeptorsysteme im gesamten Körper charakterisieren, beispielsweise Rezeptoren, die mit Suchtstoffen in Verbindung stehen. Unmittelbar nach der Entnahme bringen Sie das Gehirngewebe in Gehirnformen unter, die den Schädelinnenraum simulieren, und verpacken die Formen zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius in Aluminiumfolie. Nach 30 Minuten überführen Sie das Gewebe in einen verschließbaren Tiefkühlsack und lagern diesen bei minus 80 Grad Celsius.Vor dem Schneiden entfernen Sie das Gehirn vorsichtig aus der Gehirnform. Um das Gehirngewebe zu schneiden, überführen Sie die Probe in einen bei minus 10 bis minus 18 Grad Celsius eingestellten Kryostaten. Sobald das Gewebe die neue Temperatur ausgeglichen hat, verwenden Sie ein auf Glykol und Harz basierendes Medium, um einen kleinen Teil der Probe vertikal in einer Gewebemontage zu fixieren, um das Schneiden in koronarer Ebene zu ermöglichen.Legen Sie das Gewebe auf den Mikrotom und befestigen Sie es fest, dann beginnen Sie, das Gehirn in der gewünschten Dicke zu schneiden und montieren Sie die Schnitte in vertikaler Ausrichtung auf Objektträgern, um eine größere Oberfläche des Gewebes auf dem Träger aufzubringen. Sammeln Sie die Schnitte in sequenziellen Fünfer-Sätzen. Sobald alle Schnitte gesammelt wurden, lassen Sie die Objektträger bis zu einer Stunde lang an der Luft trocknen.Dann die Proben in eine Kunststoff-R&uuml;hrchenbox geben und in einen wiederverschlie&szlig;baren Gefrierbeutel zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius packen. Um die Proben radioaktiv zu markieren, entfernen Sie die erste und zweite Objekttr&auml;ger aus jedem Satz von f&uuml;nf und befestigen Sie sie in handels&uuml;blichen oder im 3D-Druckverfahren hergestellten Objekttr&auml;gerhaltern. Die Strich-eins-Objekttr&auml;ger dienen der unspezifischen Behandlungsgruppe und die Strich-zwei-Objekttr&auml;ger der Gesamtbehandlungsgruppe.Drehen Sie die Objektträger in 35 bis 40 Milliliter Raumtemperatur-AM5 zusammen mit den jeweiligen Inhibitoren in den entsprechenden Vorinkubations-Coplin-Gläsern um. Das gleichzeitige Bearbeiten mehrerer Objektträgerreihen kann schnell unübersichtlich werden. Daher ist es äußerst wichtig, die Objektträger im Abstand von jeweils vier Minuten in die Vorinkubationsgläser zu geben, um sicherzustellen, dass es während des Trocknungsschritts zu keiner Überlappung kommt.Nach 30 Minuten die Objektträger in Inkubationskassetten überführen, die 10 Milliliter AM5 enthalten, ergänzt mit der geeigneten Konzentration von I125 SI-Angiotensin II und den jeweiligen Hemmstoffen der Behandlungsgruppen, und 60 bis 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die genaue Bestimmung der Konzentration von 125I SI-Ang II ist entscheidend, um die Angiotensin-II-Rezeptoren von Tag zu Tag vergleichen zu können. Am Ende der Inkubation die Objektträger zurück in die Objektträgerhalter bringen, die Objektträger blockieren und sie vorsichtig für ein bis zwei Sekunden in zwei getrennten Behältern mit jeweils 400 Milliliter destilliertem Wasser schwenken.Nach der zweiten Wasserwäsche spülen Sie die Objektträger nacheinander viermal für jeweils eine Minute mit 30 bis 40 Milliliter AM5. Nach der vierten Wäsche schwenken Sie die Schnitte ein bis zwei Sekunden lang in vier Wechseln eiskaltem destilliertem Wasser. Anschließend trocknen Sie die Objektträger vier Minuten lang mit kalter Luft mittels vier Haartrocknern, die in verschiedenen Winkeln positioniert sind.Wenn alle Schnitte trocken sind, überführen Sie die Objektträger auf ein Papiertuch. Befestigen Sie die Objektträger dann mit doppelseitigem Klebeband, Gewebeseite nach oben, auf einem Stück Pappe für Röntgenfilm an der entsprechenden Position, wobei pro Gruppe mindestens ein Kalibrierungsstandard-Objektträger mit Iod-125 enthalten sein muss. Um die Schnitte zu belichten, bringen Sie im Dunkeln die Objektträger auf der Pappe in eine Röntgenkassette mit Rückseite aus strapazierfähigem Material ein und schalten Sie das Licht aus.Schalten Sie das Sicherheitslicht ein und öffnen Sie vorsichtig eine Schachtel mit Röntgenfilm. Legen Sie einen Film mit der glänzenden Seite nach oben und der gezackten Kante in der unteren rechten Ecke auf die Objektträger in der Kassette. Schließen Sie die Kassette dann vorsichtig, wobei die Verriegelungsstangen gedreht werden, um Lichtabschluss zu gewährleisten, und lagern Sie die Kassette bei minus 20 Grad Celsius.Nach der geeigneten Belichtungszeit das Film in Entwicklerlösung für zwei Minuten überführen, gefolgt von 30 Sekunden in Stopfbad, zweifach destilliertem Wasser mit Essigsäure und anschließend fünf Minuten in Fixierlösung. Den Film in einer Schale mit fließendem Wasser 20 Minuten lang waschen. Danach in ein Netzmittel für etwa 10 Sekunden überführen und den Film zum Trocknen aufhängen.Für die histologische Analyse der Gehirngewebeschnitte die DASH-drei-Schnitte in einem Objektträgerhalter auftauen. Anschließend die Schnitte eine Minute lang in entionisiertem Wasser waschen, gefolgt von einer zehnminütigen Inkubation in Thionin-Färbelösung und drei Eintauchvorgängen in einem Behälter mit entionisiertem Wasser. Die Objektträger für weitere 30 Sekunden in entionisiertes Wasser eintauchen.Anschließend die Objektträger in aufeinanderfolgenden Ethanol-Spülungen wie angegeben waschen. Nach der letzten Spülung mit 100 % Ethanol die Objektträger nacheinander in zwei Behältern mit Xylol jeweils drei und fünf Minuten lang waschen. Am Ende des zweiten Xylolwaschschritts die obere Kante eines jeden Objektträgers einzeln mit einer Harzbasis, einem anorganischen Lösungsmittel-Montagemedium, bedecken.Montieren Sie 24 mal 60 Millimeter Deckgläser auf die Objektträger und lassen Sie die Objektträger 48 Stunden trocknen. Scannen Sie anschließend die Objektträger und Filme mit 2400 DPI im Graustufenmodus in den Computer ein. Um die Filme mittels Densitometrie zu analysieren, umreißen Sie nach dem Einscannen empirisch die Bereiche von Interesse auf jedem Film.Dies ist das Pseudofarbenbild, das nach dem Öffnen des gescannten Films im Bildanalyseprogramm erzeugt wurde. Schließen Sie die Dichte, den Scanbereich und die gesamte Zieloberfläche in die Messungen ein. Passen Sie die Balken des Scanbereichs an, um sicherzustellen, dass sich jeder interessierende Bereich innerhalb der Parameter der Hervorhebung befindet.Exportieren Sie anschließend die Daten in eine Tabellenkalkulation, um die spezifische Bindung für jede Probe zu bestimmen. Die Kalibrierstandard-Einheiten für die Quantifizierung werden basierend auf dem Datum, an dem der Assay durchgeführt wurde, festgelegt. Nach dem Scannen der Filme werden die Kalibrierwerte verwendet, um eine Kurve basierend auf den unterschiedlichen Konzentrationen der Iod-125-Standardproben für den jeweiligen Film zu erstellen.Die Kalibrierungs- und Standardwerte werden zur Sicherstellung der Genauigkeit im Dreifachansatz aufgezeichnet. Die Unterschiede zwischen der unspezifischen Bindung und den Gesamtgruppen sowie den Gewebemarkierungen werden hergestellt, indem jeder Datensatz den entsprechenden Untergruppen zugeordnet wird. Ein höherer Schwellenwert sollte eingestellt werden, indem die Parameter von rot nach schwarz angepasst werden, während der niedrigere Schwellenwert nahe null liegen sollte, um eine genauere Messung des gesamten gescannten interessierenden Bereichs zu ermöglichen.Beispielsweise werden hier die endgültig gemessenen Flächen des paraventrikulären Kerns des Hypothalamus in den Gruppen mit Gesamt- versus unspezifischer Bindung mit einem Thioninfärbungsschnitt zur anatomischen Bestätigung verglichen. Die unspezifische Bindung entspricht der Menge an gebundenem Radioliganden an nicht zu Angiotensin-Rezeptoren gehörende Strukturen in Gegenwart einer sättigenden Konzentration eines nicht radioaktiven Liganden für den Angiotensin-I-Rezeptor, während die Gesamtbindung die Menge an gebundenem Radioliganden in Abwesenheit eines nicht radioaktiven Liganden für den Angiotensin-I-Rezeptor angibt. Die Werte der unspezifischen Bindung können anschließend von den Werten der Gesamtbindung subtrahiert werden, um die spezifischen Bindungswerte für die Angiotensin-I-Rezeptoren zu erhalten.Wenn der Schritt der Rezeptor-Autoradiographie einmal beherrscht ist, kann er innerhalb von etwa vier Stunden abgeschlossen werden, während das Entwickeln der Filme etwa 30 Minuten pro Film dauert. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zeit genau zu überwachen, um sicherzustellen, dass alle Objektträger exakt die gleiche Zeit inkubiert, gespült und getrocknet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Untersuchungen der Gehirnmorphologie durchgeführt werden, um Veränderungen in der Größe der Regionen zu bewerten, die die Expression von Angiotensin-II-Rezeptoren zeigen.Diese Technik hat den Weg für Forscher geebnet, die die Rezeptorpharmakologie untersuchen, um zu bestimmen, wie verschiedene Gehirnregionen durch unterschiedliche Neurohormone, Neurotransmitter und Arzneistoffe beeinflusst werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Rezeptor-Autoradiographie-Test erfolgreich durchführt, histologisch gefärbte Objektträger präpariert und Autoradiogramme zur Lokalisation von Rezeptoren in spezifischen Gehirnregionen auswertet. Beachten Sie, dass der Umgang mit Radioaktivität gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie angemessene Abschirmung, Kontainment, Überwachung der Exposition und ordnungsgemäße Entsorgung, um radioaktive Kontamination zu vermeiden.

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