Rezeptor-Autoradiographie-Protokoll für die Lokalisierte Visualisierung von Angiotensin II-Rezeptoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die anatomische Lokalisierung und Quantifizierung der Angiotensin-II-Rezeptor-Expression in Hirnschnitten unter Verwendung der Rezeptor-Autoradiographie und der histologischen Identifizierung von Hirnstrukturen. Diese Methode identifiziert die Gehirnregionen, in denen Angiotensin II das Verhalten, die kognitive Funktion und das Herz-Kreislauf-System beeinflusst, und liefert Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Therapien zur Behandlung von neurodegenerativen und kardiovaskulären Erkrankungen. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie quantitativ und qualitativ ist und die Identifizierung von funktionellen Rezeptoren für Angiotensin II mit größerer Spezifität als andere Methoden ermöglicht.

Diese Methode kann auch die Funktionalität anderer Hormonrezeptorsysteme im ganzen Körper charakterisieren, wie z. B. Rezeptoren, die mit Drogen des Missbrauchs in Verbindung stehen. Legen Sie das Hirngewebe unmittelbar nach der Entnahme in Gehirnformen, die das Innere des Schädels simulieren, und wickeln Sie die Formen für eine Lagerung bei minus 20 Grad Celsius in Aluminiumfolie ein. Nach 30 Minuten geben Sie die Taschentücher in einen verschließbaren Gefrierbeutel und lagern den Beutel bei minus 80 Grad Celsius.

Entfernen Sie vor dem Schnitt das Gehirn vorsichtig aus der Hirnform. Um das Hirngewebe zu schneiden, überführen Sie die interessierende Probe in einen Kryostaten, der zwischen minus 10 und minus 18 Grad Celsius eingestellt ist. Wenn sich das Gewebe an die neue Temperatur angepasst hat, verwenden Sie ein Medium auf Glykol- und Harzbasis, um einen kleinen Teil der Probe vertikal in eine Gewebehalterung einzubetten, um das Durchtrennen der koronalen Ebene zu ermöglichen.

Laden Sie das Gewebe auf das Mikrotom und ziehen Sie die Halterung fest fest, beginnen Sie dann mit dem Schneiden des Gehirns in der gewünschten Dicke und montieren Sie dann die Schnitte in vertikaler Ausrichtung auf Objektträger, um eine größere Oberfläche des Gewebes auf den Objektträger aufzubringen. Sammeln Sie die Abschnitte in aufeinanderfolgenden Fünfersätzen. Wenn alle Abschnitte eingesammelt sind, lassen Sie die Objektträger bis zu einer Stunde an der Luft trocknen.

Legen Sie die Proben dann in eine Kunststoff-Objektträgerbox in einem selbstverschließenden Gefrierbeutel zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius. Um die Proben mit einem Funk zu beschriften, entfernen Sie den ersten und zweiten Objektträger von jedem Fünfersatz und montieren Sie ihn in handelsübliche oder 3D-gedruckte Gleitgriffe. Der Strich mit den ersten Folien ist für die unspezifische Behandlungsgruppe und der Strich mit zwei Folien für die gesamte Behandlungsgruppe.

Invertieren Sie die Objektträger in 35 bis 40 Millilitern AM5 bei Raumtemperatur zuzüglich der entsprechenden Inhibitoren in den entsprechenden Coplin-Gläsern vor der Inkubation. Das Ausführen mehrerer Foliensätze kann überwältigend sein. Daher ist es äußerst wichtig, die Objektträger in den Vorinkubationsgläsern im Abstand von vier Minuten zu platzieren, um sicherzustellen, dass es während des Trocknungsschritts zu keiner Überlappung kommt.

Nach 30 Minuten werden die Objektträger 60 bis 90 Minuten lang bei Raumtemperatur in Inkubations-Objektträger-Versandtaschen mit 10 Millilitern AM5 überführt, die mit der entsprechenden Konzentration von I125 SI, Angiotensin II und den entsprechenden Inhibitoren der Behandlungsgruppe ergänzt sind. Die Bestimmung der genauen Konzentration von 125I SI Ang II ist entscheidend, um die Angiotensin-II-Rezeptoren von einem Tag auf den nächsten vergleichen zu können. Am Ende der Inkubation legen Sie die Objektträger wieder in die Objektträgergriffe, blockieren Sie die Objektträger und schwenken Sie sie vorsichtig ein bis zwei Sekunden lang in zwei separaten Behältern mit 400 Millilitern destilliertem Wasser.

Spülen Sie die Objektträger nach der zweiten Wasserwäsche mit vier aufeinanderfolgenden einminütigen Wäschen in 30 bis 40 Millilitern AM5. Nach der vierten Wäsche schwenken Sie die Abschnitte vorsichtig ein bis zwei Sekunden lang in vier Wechseln mit eiskaltem destilliertem Wasser. Verwenden Sie dann vier Föhne, die in verschiedenen Winkeln eingestellt sind, um die Objektträger vier Minuten lang mit kalter Luft zu trocknen.

Wenn alle Abschnitte trocken sind, übertragen Sie die Objektträger auf ein Papiertuch. Befestigen Sie dann die Objektträger mit doppelseitigem Klebeband mit der Gewebeseite nach oben auf einem Stück Pappe für den Röntgenfilm in Position, und mit mindestens einem Jod-125-Kalibrierstandardobjektträger pro Gruppe. Um die Ausschnitte zu filmen, legen Sie die Pappdias in einem dunklen Raum in eine Röntgenkassette mit Umschnallgurt und schalten Sie das Licht aus.

Schalten Sie das sichere Licht ein und öffnen Sie vorsichtig eine Schachtel mit Röntgenfilm. Legen Sie einen Film mit der glänzenden Seite nach oben und der gezackten Kante in der unteren rechten Ecke auf die Dias in der Kassette. Verschließen Sie dann die Kassette vorsichtig mit den verdrehten Verriegelungsstangen, um das Licht abzudichten, und lagern Sie die Kassette bei minus 20 Grad Celsius.

Nach der entsprechenden Einwirkzeit wird der Film zwei Minuten lang in die Entwicklerlösung überführt, gefolgt von 30 Sekunden in einem Stoppbad, doppelt destilliertem Wasser mit Essigsäure und dann fünf Minuten in einer Fixierlösung. Waschen Sie die Folie 20 Minuten lang in einer Schale mit fließendem Wasser. Übertragen Sie es für ca. 10 Sekunden in ein Oberflächenmittel und hängen Sie die Folie zum Trocknen auf.

Für die histologische Analyse der Hirngewebeschnitte tauen Sie den Strich drei Abschnitte in einem Objektträgergestell auf. Waschen Sie anschließend die Abschnitte eine Minute lang in entionisiertem Wasser, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in Thionin-Fleckenlösung und drei Tauchgängen in einem Behälter mit entionisiertem Wasser. Tauchen Sie die Objektträger für eine zusätzliche 30-Sekunden-Spülung mit entionisiertem Wasser ein.

Waschen Sie dann die Objektträger wie angegeben in aufeinanderfolgenden Ethanol-Waschgängen. Waschen Sie die Objektträger nach der letzten 100%igen Ethanolwäsche drei und fünf Minuten hintereinander in zwei Behältern mit Xylol. Am Ende der zweiten Xylolwäsche bedecken Sie jeweils die Oberkante eines Objektträgers mit einem anorganischen Einbettmittel auf Harzbasis.

Montieren Sie 24 x 60 Millimeter große Deckgläser auf die Objektträger und lassen Sie die Objektträger 48 Stunden trocknen. Scannen Sie dann die Dias und den Film mit 2400 DPI Graustufen in den Computer ein. Um den Film durch Densitometrie zu analysieren, skizzieren Sie nach dem Scannen empirisch die interessierenden Bereiche auf jedem Film.

Dabei handelt es sich um das Pseudofarbbild, das nach dem Öffnen des gescannten Films im Bildanalyseprogramm erzeugt wird. Beziehen Sie die Dichte, den Scanbereich und den gesamten Zielbereich in die Messungen ein. Passen Sie die Balken des Scanbereichs an, um sicherzustellen, dass jeder interessante Bereich zwischen den Parametern der Hervorhebung liegt.

Exportieren Sie dann die Daten in eine Tabelle, um die spezifische Bindung für jede Probe zu bestimmen. Die Kalibrierstandardeinheiten für die Quantifizierung werden auf der Grundlage des Datums bestimmt, an dem der Assay durchgeführt wurde. Nach dem Scannen der Filme werden die Kalibrierwerte verwendet, um eine Kurve zu erstellen, die auf den unterschiedlichen Konzentrationen von Jod-125-Standards für den jeweiligen Film basiert.

Die Kalibrier- und Standardwerte werden aus Gründen der Genauigkeit in dreifacher Ausfertigung aufgezeichnet. Die Unterscheidung zwischen der unspezifischen Bindung und der Gesamtgruppe sowie den Gewebemarkierungen wird durch die Zuordnung der einzelnen Datensätze zu den entsprechenden Untergruppen getroffen. Ein höherer Schwellenwert sollte eingestellt werden, indem die Parameter von Rot auf Schwarz eingestellt werden, während der niedrigere Schwellenwert nahe Null eingestellt werden sollte, um eine genauere Messung des gesamten gescannten Interessenbereichs zu ermöglichen.

So werden hier z.B. die endgültig gemessenen Areale des paraventrikulären Kerns des Hypothalamus in der Gesamt- gegenüber den unspezifischen Bindungsgruppen zur anatomischen Bestätigung mit einem Thionin-gefärbten Schnitt verglichen. Die unspezifische Bindung ist die Menge an Radioliganden, die in Gegenwart einer Sättigungskonzentration des nicht-radioaktiven Angiotensin-I-Rezeptor-Liganden an Nicht-Angiotensin-I-Rezeptor-Liganden gebunden ist, während die Gesamtbindung die Menge an Radioliganden ist, die in Abwesenheit eines nicht-radioaktiven Angiotensin-I-Rezeptor-Liganden gebunden ist. Die unspezifischen Bindungswerte können dann von den Gesamtbindungswerten subtrahiert werden, um die spezifischen Bindungswerte für die Angiotensin-I-Rezeptoren zu erhalten.

Einmal gemeistert, kann der Schritt der Rezeptor-Autoradiographie in etwa vier Stunden abgeschlossen werden, während der Schritt der Filmentwicklung etwa 30 Minuten pro Film dauert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zeit im Auge zu behalten, um sicherzustellen, dass alle Objektträger genau die gleiche Dauer inkubiert, gespült und getrocknet werden. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Studien der Gehirnmorphologie durchgeführt werden, um die Veränderungen in der Größe der Regionen zu bewerten, die die Expression des Angiotensin-II-Rezeptors zeigen.

Diese Technik hat den Weg für Forscher geebnet, die die Rezeptorpharmakologie untersuchen, um festzustellen, wie verschiedene Gehirnregionen von verschiedenen Neurohormonen, Neurotransmittern und Medikamenten beeinflusst werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie erfolgreich einen Rezeptor-Autoradiographie-Assay durchführen, histologisch gefärbte Objektträger und Autoradiogramme zur Lokalisierung von Rezeptoren in bestimmten Gehirnregionen auswerten. Denken Sie daran, dass die Arbeit mit Radioaktivität gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie ordnungsgemäße Abschirmung, Eindämmung, Expositionsüberwachung und Entsorgung immer getroffen werden sollten, um eine radioaktive Kontamination zu vermeiden.