Name: Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 32 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Identifikation von erythroiden Vorläufern in Mausgeweben. Diese Methode ermöglicht die Analyse von CD71/TER119-markierten Zellen zur Untersuchung der Erythropoese.

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Wir danken der UMass Durchflusszytometrie Kern: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu und Tammy Krupoch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) und NIH CA T32-130807 (JRS) finanziert. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center gewähren DK32520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet.

1. Harvesting von Geweben <ol><li> Bereiten Röhrchen mit 2 bis 5 ml kaltem Färbepuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Zusatz von 0,2% BSA und 5 mM Glucose). Keep Röhrchen auf Eis vor der Gewebe zu ernten. </li><li> Cull Mäusen nach geeigneten genehmigten Protokoll (z. B. CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte). </li><li> Draw Blut durch Herzpunktion in EDTA-oder Heparin-Blut-Sammlung Rohre für eine spätere Analyse, z. B. von Hämatokrit, Retikulozyten oder CBC-Analyse. </li><li> Ernte der Milz und Knochen, indem Gewebe aus jeder Maus in ein separates Röhrchen, die in Schritt 1 vorbereitet. Einfacher Zugang zu Milz ist von der linken Seite. Für das Knochenmark, die Ernte eines oder beider Oberschenkel. Keep geerntet Gewebe auf Eis. </li><li> Wenn gewünscht, wiegen die Milz. Mäuse Einwirkung einer Erythropoetin-Stress-Reaktion geeignet sind, einen signifikanten Anstieg in Milzgewicht zeigen. </li></ol> 2. Vorbereitung von Milzzellen <ol><li> Mit einem vorbefeuchtete 3 ml Spritzenkolben, schieben Sie die Milz, oder ein Teil der Milz (idealerweise 0,1 Gramm oder weniger, das entspricht ungefähr 10 8 Zellen) durch ein 40 um sterile Zellsieb (Fisherbrand Katalog-Nummer 22363547 oder andere) platziert auf einem 50 ml konischen Rohr. Halten Sie das Röhrchen auf Eis während dieses Vorgangs. Waschen Sie die Zellen durch das Sieb mit einer Gesamtfläche von 2 ml Färbepuffer. </li><li> Gently Pipette die angespannte Zellsuspension aufzubrechen jede kleine Klumpen. Falls erforderlich, erneut belasten die Zellen. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugieren und in kaltem Puffer resuspendieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Typische Ausbeuten sind 1-2 x 10 8 Zellen / Milz. Für Durchflusszytometrie-Analyse, aliquot 1 bis 2.000.000 Zellen pro Probe, entweder in FACS Färbung Röhrchen (BD Falcon Polystyrol Rundboden-Röhrchen, 352008) oder U-Boden 96-Well-Platte (BD Falcon 353910). Beispiel Färbung Volumen 200 ul, um eine endgültige Zellkonzentration von 0,5 bis 1 x 10 7 Zellen / ml oder 1-2 x 10 6 Zellen / 200 ul Probe. </li></ol> 3. Vorbereitung von Knochenmarkzellen <ol><li> Bereiten Sie 1 oder 3 ml Spritzen mit einem angehängten 26G Nadel, mit kaltem Färbepuffer vorgefüllt. </li><li> Entfernen Sie Muskeln, die an den Oberschenkelknochen, so dass der Knochen deutlich sichtbar zu machen. </li><li> Mit scharfen chirurgischen Schere, schneiden Sie beide Enden des Oberschenkelknochens, so nah wie möglich an den Enden der Knochen. Dies sollte ein kleines Loch an jeder abgeschnittene Ende zeigen, was in das Knochenmark Hohlraum, der durch die Länge des Oberschenkelknochens läuft. </li><li> Mit dem Fertigspritzen in Schritt 1 Führen Sie die Nadel durch eines dieser Löcher, und sanft spülen das Knochenmark durch das Loch am anderen Ende, in ein Rohr. </li><li> Dissoziieren die gespülten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren, und durch ein 40 um Sieb für die Milz vor (siehe Abschnitt 2.1). </li><li> Wash Zellen zweimal durch Zentrifugation in kalten Färbepuffer </li><li> Zählen Sie die Zellen und Zellen, wie in Abschnitt 2.4. Typische Ausbeuten sind ungefähr 10 7 Zellen pro Femur. </li></ol> 4. Vorbereitung der fötalen Leberzellen <ol><li> Zur Vorbereitung timed-trächtigen weiblichen Mäusen, Einrichten Mäusen zur Paarung in den Abend, zu untersuchen auf Vaginalpfropf vor 10 Uhr des folgenden Tages, der Tag, an dem die Vaginalpfropf erkannt wird als Tag 0,5. Veterinary Mitarbeiter können möglicherweise Ermittler, die nicht mit dieser Technik, um schwangere Frauen zu identifizieren, zu unterstützen. Eine Schwangerschaft kann auch durch die Überwachung der Maus Gewicht bestimmt werden. </li><li> Timed-schwangeren weiblichen Mäusen werden an den Tagen 12,5 bis 14,5 der Schwangerschaft getötet. Die Uterushörner in eine Petri-Schale mit eiskaltem Kulturmedium oder Färbepuffer entfernt. </li><li> Die Embryonen werden von jedem Gebärmutter entfernt und die fetale Leber präpariert. Ein Binokular ist für Embryonaltag 12,5 (E12.5) oder jünger erforderlich. </li><li> Livers kann getrennt werden mechanisch durch Pipettieren in Puffer und werden entweder einzeln in 96-Well-Platten verarbeitet, oder zusammen, je nach experimentellen Anforderungen zusammengefasst. </li><li> Eine fetale Leber bei E13.5 hat ~ 10 7 Zellen. Die Zellen werden zweimal in Färbepuffer gewaschen und bei 1-2 x 10 6 Zellen / 200 ul Probe für die durchflusszytometrische Analyse. </li></ol> 5. Antikörper-Färbung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Bereiten Sie eine primäre Antikörper-Färbung Pre-Mix für alle Proben verwendet werden, mit Ausnahme von Kontrollproben, mit folgendem Inhalt: <ul><li> ChromePure Rabbit IgG (Jackson, 015-000-003), bis zu einer Endkonzentration von 200μg/ml. Prüfen Sie die Lager-Konzentration auf der Flasche (es kann variieren). Dies wird verwendet, um Fc-Rezeptoren in Zellen der Maus blockieren; alternative Arten, die dafür verwendet werden können, sind IgG-oder Ratten-IgG. Species Wahl wird durch die mögliche Anwesenheit in der Färbung Protokoll sekundäre Antikörper gegen primäre Ratte / Maus / Kaninchen-Antikörper, in welchem ​​Fall diese Arten nicht verwenden können gerichtet bestimmtd als blockierende Antikörper. Alternativ können 5% Kaninchenserum auch anstelle von gereinigtem IgG verwendet werden. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder Fab-Fragmente an der Maus Fc-Rezeptoren gerichtet. Das grundlegende Protokoll unten enthält keine Sekundärantikörper und so IgG von jeder der drei Arten verwendet werden kann. </li><li> CD71-FITC, verdünnt 1:200 (stock 0,5-Promillegrenze, BD-Biosciences, 553266) </li><li> TER119-PE, 1:200 (Lager 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) verdünnt </li><li> Jede weitere Antikörper an der Oberfläche Epitope von Interesse gerichtet, z. B. Antikörper an Fas oder FasL (siehe 1,2) gerichtet. Mix der Antikörper-Lösung vorsichtig durch Invertieren des Röhrchens 2-3 mal. </li></ul></li><li> Add 200 ul der Pre-Mix für jede Zelle Probe und sanft wieder aussetzen Zellen. </li><li> Bereiten Kontrolle Zellproben wie folgt: <ul><li> "Ungefärbte ': Diese Zellen sind in Färbepuffer links und bilden den Hintergrund Autofluoreszenz der Zellen. </li><li> 'Single color' steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das verwendete Protokoll benötigt. Die Zellen in dieser Kontrollen sind entweder mit einem direkt konjugierten Primärantikörper gefärbt, oder sowohl mit einem primären Antikörper und einem konjugierten sekundären Antikörper. Diese Kontrollen dienen dazu, für die spektrale Überlappung zwischen den Kanälen zu korrigieren. </li><li> "Fluorescence minus eins" (FMO) steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das Protokoll erforderlich: die Zellen werden mit allen Farben / Antikörper in das Protokoll mit Ausnahme der Farbe gefärbt / Antikörper, bei denen dies der FMO-Steuerung. Die FMO-Steuerung für einen bestimmten Kanal bietet den wahren Hintergrund für diesen Kanal. Es können auch nicht-spezifische Antikörper der gleichen Isotyp und konjugiert mit der gleichen Fluoreszenz-Markierung wie der Test Antikörper (Isotyp-Kontrolle). </li></ul></li><li> Inkubieren Proben und entsprechende Kontrollen in den primären Antikörper auf Eis Fleck für 45 'bis 1 Stunde im Dunkeln (put Alufolie abdecken auf Eis-Eimer). </li><li> Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml Färbepuffer jedem Probenröhrchen und Spin für 3 'bis 5' bei etwa 400 xg bei 4 ° C. Bei Verwendung von 96-Well-Platten, waschen Sie die Zellen dreimal in einem Volumen von 200 ul. </li><li> Wenn relevant, gelten sekundären Antikörper-Färbung. Übernehmen und waschen wie für den ersten Antikörper-Färbung. </li><li> Gegebenenfalls ist ein Fleck mit Annexin V am Ende der Inkubationszeit aufgetragen, mit einem HEPES-Puffer, wie in der Anleitung des Herstellers. Dieser Fleck ist für 15 Minuten bei Raumtemperatur angewendet, oder für 1 Stunde auf Eis. </li><li> Die Zellen sind für die Durchflusszytometrie-Analyse in Färbelösung mit einem Zell-undurchlässige DNA-Farbstoff resuspendiert, um tote Zellen auszuschließen. Mehrere DNA-Farbstoffe sind verfügbar, einschließlich Propidiumiodid, 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) oder DAPI. Die Wahl aus den Reihen dieser hängt von der verfügbaren Kanäle, da die Kanäle für spezifische Antikörper-Färbung genommen und Kanälen auf dem Durchflusszytometer. 7AAD von BD-Biosciences (559925) gewonnen und nach den Anweisungen des Herstellers. Für DAPI-Färbung, einen Bestand von 1mg/ml in Dimethylformamid (DMF) aus Pulver (Roche, Kat. Nr. 236276), halten bei -20 ° C und verdünnt 1:10.000 bis 1:15.000 in Färbepuffer. </li></ol> 6. Durchflusszytometrische Sortierung <ol><li> Die Zellen werden mit Antikörpern gegen CD71, TER119, Abstammung Marker und eine Lebensfähigkeit Farbstoff als für durchflusszytometrische Analyse (Abschnitt 5) beschrieben gekennzeichnet. Zellkonzentration während Kennzeichnung kann auf 5 erhöht werden x 10 7 / ml. </li><li> Mix ein gleiches Volumen an jedem der folgenden Antikörper an die Linie Master-Mix zu machen: <ul><li> FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087 </li><li> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396 </li><li> FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li><li> Verwenden Sie die Master-Mix auf 1:80 (Dies ist gleichbedeutend mit 1:400 Verdünnung der einzelnen Antikörper Bestände, die alle 0,5 mg / ml sind). </li></ul></li><li> Verwenden Niederdruck-Sortier-Bedingungen und große Düsen. Für die Aria (BD Biosciences) Wir verwenden 100 μ Düse, 20 psi Druck. </li><li> Sammlung Puffer: PBS mit Zusatz von 20% Fetal Bovine Serum. </li><li> Zur Überprüfung der Reinheit der sortierten Populationen, erneut eine kleine Teilmenge von jeder Probe in einem Puffer, der eine Lebensfähigkeit Farbstoff enthält (7AAD oder ähnliches). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: CD71/Ter119 Färbung der erwachsenen Knochenmark oder Milz identifiziert eine Entwicklungsstörung Sequenz von vier Untergruppen, etikettiert ProE, Erya, EryB und EryC (Abbildung 1) 1. Morphologisch sind diese zunehmend reifen Erythroblasten entsprechen. Abbildung 1 zeigt die Gating-Sequenz an der Datenanalyse Bühne, die sehr kleine Veranstaltung (einschließlich Kerne, roten Blutkörperchen), aggregierten Zellen und tote Zellen verworfen. Expression von Zelloberflächen-Proteine ​​können gleichzeitig für jede dieser Teilmengen gemessen werden, indem die entsprechenden Antikörper zur gleichen Zeit wie TER119 und CD71 Färbung. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel von Zell-Oberflächen-Expression des Todes-Rezeptor Fas 1. Diese Messung wurde in Mäusen mit Epo gespritzt durchgeführt oder in Kontroll-Mäusen mit Kochsalzlösung injiziert. Es ist offensichtlich, dass Epo Fas Ausdruck unterdrückt in der Erya Bevölkerung in vivo 1. Expression von intrazellulären Proteinen oder Zellzyklus-Status kann auch für die Zellen in jeder Teilmenge gemessen werden. Abbildung 2 zeigt repräsentative Zellzyklus-Analyse von frisch geernteten Knochenmarkszellen. Diese Messungen erfordern neben Zelloberflächenfärbung mit CD71 und TER119, die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen für den intrazellulären Kennzeichnung (siehe Diskussion Abschnitt). In fetale Leber, sind nicht-erythroiden Zellen zuerst durch Gating auf "Lin-" Zellen, die negativ sind für CD41, Mac-1, Gr-1, B220 und CD3 (Abbildung 3) ausgeschlossen. Die restlichen Zellen sind unterteilt in 6 Teilmengen, S0 bis S5. Die genaue Muster der Zellen in der fötalen Leber ist abhängig von embryonalen Alter (siehe Diskussion Abschnitt). Ein Vertreter des Zellzyklus Analyse der S3 Teilmenge in E13.5 fetale Leber wird angezeigt (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Die CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Mäusemilz A. Gating-Strategie:.. Milzzellen wurden verarbeitet und gekennzeichnet mit Antikörpern an CD71, TER119 und Fas gerichtet. Diese Abbildung zeigt die Analyse-Strategie nach der Datenerfassung fort. Histogramm I zeigt alle erfassten Ereignisse. Die Diagonale Tor repräsentiert Ereignisse, die wahrscheinlich einzigen Zellen, ohne Dubletten oder größere Aggregate werden. Cells in diesem Tor sind weitere in Histogramm II analysiert. Hier sehr kleine Veranstaltungen, wahrscheinlich Kerne oder Schmutz sind ausgeschlossen. Die gated Zellen werden in Histogramm III, wo DAPI-positive Zellen, die wahrscheinlich sind membranpermeabel apoptotischen Zellen, von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden angezeigt. Histogramm IV zeigt die resultierende Population von lebensfähigen Milzzellen. Die ProE Tor enthält CD71 hohen TER119 intermediären Zellen. TER119 hohen Zellen werden weiter in Histogramm analysiert V. Hier CD71 hohen Zellen in weniger reifen, großen 'Erya "Erythroblasten (CD71 hohen TER119 hohen FSC hoch) und kleiner, reifer' EryB" Erythroblasten (CD71 hohen TER119 hohen FSC niedrig) unterteilt . Die reifsten Erythroblasten Teilmenge EryC (CD71 niedrigen TER119 hohen FSC low). Histogramm VI zeigt Zelloberflächen-Fas Ausdruck, insbesondere in den Erya Teilmenge, bei Mäusen in den Grundzustand (Injektion von Kochsalzlösung) und Mäuse, die mit einer Einzeldosis von Epo gespritzt. Die Färbung mit Fas-Antikörper wurde gleichzeitig mit der CD71/Ter119 Färbung durchgeführt. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich in Liu et al., Blood. 2006 Jul 1, 108 (1) :123-33. Epub 2006 Mar 9. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Zellzyklus-Analyse von CD71 hohen TER119 hohen Erythroblasten im Knochenmark der Maus. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit BrdU injiziert und Milz oder Knochenmark wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert und abgesehen davon, dass für CD71 und TER119 gebeizt, wurden BrdU-Einbau in die DNA-Replikation mit einem monoklonalen Antikörper an BrdU gerichtet gefärbt (Fixierung, Permeabilisierung und BrdU-Färbung Protokoll wurde nach Herstellerangaben). BrdU-positive Zellen in S-Phase des Zyklus. Interphase-Zellen sind BrdU-negative und kann in G1 oder G2 / M Phasen gelöst werden, mit dem DNA-Farbstoff 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Maus fetale Leber A. Gating-Strategie:.. Fötalen Leberzellen wurden für CD71, TER119 beschriftet und ein Cocktail von FITC-markierter Antikörper bei nicht-erythroiden Linie Marker ("Lin") inszeniert. Lebensfähige Zellen (7AAD-negativ) wurden für Lin Ausdruck analysiert und die Lin-Zellen werden weiter in die S0 bis S5 erythroiden Teilmengen unterteilt. Jüngere, ist E13 fetale Leber von weniger reifen Erythroblasten, die durch das Fehlen von Zellen in den reifen S4/S5 Teilmengen gezeigt zusammen. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich published in Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Zellzyklus-Analyse der fötalen Leber erythroiden Teilmengen. Schwangere Mäuse wurden mit BrdU injiziert und fötalen Lebern wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet fixiert, permeabilisiert und gefärbt mit Antikörpern gegen CD71, TER119 und BrdU. Zellzyklus-Status der S3-Zellen gezeigt.

<ol><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li>
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</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Massachusetts Medical School IACUC eingesetzten Ausschusses durchgeführt.

Die durchflusszytometrische Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller zellulären Funktion, die mit einem Fluoreszenz-konjugierte spezifische Antikörper oder Liganden, einschließlich Zelloberflächenmarker, Proteinexpression, das Überleben der Zelle, Zell-Signal mit Hilfe phospho-spezifische Antikörper 3 und Zellzyklus-Status nachgewiesen werden kann. Diese Messungen können in jedem der eine Reihe von Differenzierungs-Bühne spezifische Teilmengen erfolgen, die im Rahmen von frisch isolierten eryth...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Fas-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidin-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 um sterile Zellsieb </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polystyrol Rundboden-Röhrchen für FACS-Färbung </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-Boden 96-Well-Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0,5-Promillegrenze) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> TER119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI Pulver </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Flow Kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexin V-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identifikation und analyse von maus erythroid vorläufern mit dem cd71/ter119 durchflusszytometrische assay

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Das Studium der Erythropoese möchte verstehen, wie rote Blutkörperchen sind aus früheren hämatopoetischen Vorläuferzellen und erythroiden gebildet. Genauer gesagt, ist die Rate der roten Blutkörperchen Bildung durch das Hormon Erythropoietin (Epo), dessen Synthese durch Hypoxie ausgelöst geregelt. Eine Bedrohung für die ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes führt zu einem raschen Anstieg der Epo, Fahren eine Erhöhung der Erythropoese-Rate, ein Verfahren, wie der erythropoetischen Stress-Reaktion bekannt. Der daraus resultierende Anstieg der Zahl der zirkulierenden roten Blutkörperchen verbessert Gewebe Sauerstoffzufuhr. Eine effiziente erythropoetischen Stress-Reaktion ist daher entscheidend für das Überleben und die Wiederherstellung von physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Höhenlage, Anämie, Blutungen, Chemotherapie oder Stammzelltransplantation. Die Maus ist ein Schlüssel-Modell für das Studium der Erythropoese und ihre Reaktion auf Stress. Maus definitive (Erwachsenen-Typ) Erythropoese findet in der fetalen Leber zwischen embryonalen Tage 12.5 und 15.5, in der Neugeborenen-Milz und in der Erwachsenenbildung Milz und Knochenmark. Klassische Methoden zur Identifizierung erythroiden Vorläuferzellen im Gewebe verlassen sich auf die Fähigkeit dieser Zellen zu steigen, um red cell Kolonien geben, wenn in Epo-haltigen halbfesten ausplattiert. Ihre erythroiden Vorläuferzellen Nachkommen werden auf der Basis morphologischer Kriterien identifiziert. Keiner von diesen klassischen Methoden erlauben den Zugriff auf eine große Anzahl von Differenzierungs-Stadium-spezifischen erythroiden Zellen für die molekulare Untersuchung. Hier präsentieren wir Ihnen eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und Differenzierung Studium-stage-spezifischen erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt im Zusammenhang mit der frisch isolierten Maus Gewebe. Der Test beruht auf der Zell-Oberflächenmarker CD71, TER119, und auf der durchflusszytometrischen &#39;forward-scatter&#39; Parameter ist das eine Funktion der Größe der Zellen. Die CD71/Ter119 Assay verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen während ihrer Antwort auf erythropoetischen Stress in vivo-Studie werden zum Beispiel bei anämischen Mäusen oder Mäusen in sauerstoffarmen Bedingungen untergebracht. Es kann auch verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen direkt in das Gewebe von genetisch veränderten adulten Mäusen oder Embryonen zu studieren, um die spezifische Rolle der modifizierten molekularen Signalweg in Erythropoese zu beurteilen.

Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

Die Untersuchung der Erythropoese zielt darauf ab, zu verstehen, wie rote Blutkörperchen aus früheren hämatopoetischen und erythroiden Vorläuferzellen gebildet werden. Insbesondere die Rate der ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Vorläuferzellen der roten Blutkörperchen direkt in frisch gewonnenem Gewebe von Mäusen nachzuweisen. Dies ermöglicht es uns, ihre molekularen Eigenschaften während Phasen zu untersuchen, in denen das erythropoetische System dieser Mäuse Veränderungen unterliegt. Beispielsweise wird während der embryonalen Entwicklung oder als Reaktion auf hypoxischen Stress zunächst das hämatopoetische Gewebe aus der fetalen Leber der Maus oder aus der adulten Milz oder dem Knochenmark isoliert und in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert.Anschließend werden die Zellen mit Antikörpern gegen die Oberflächenmarker CD 71 und TER one 19 sowie mit weiteren gewünschten Markern markiert. Um beispielsweise das Zellüberleben oder den Zellzyklusstatus zu messen, wird die markierte Zellsuspension anschließend mit einem Durchflusszytometrie-Analysator untersucht, und spezifische Erythroblast-Teilpopulationen in unterschiedlichen Reifungsstadien werden identifiziert. Diese spezifischen Teilpopulationen können durch Zellsortierung angereichert werden. Danach können zelluläre und molekulare Analysen für jede Erythroblast-Reifungsstufe durchgeführt w

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung einer Bevölkerung von orthochromatischen Erythroblasten enucleating durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie, die eine Visualisierung der Erythroblasten Enukleation Prozess.

Identifizierung einer Subpopulation Murine Erythroblast Enriched in Enucleating Veranstaltungen durch multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Wir stellen ein in-vitro-Maus fötalen Leber Erythroblasten Kultursystem, das die frühen und späten Stadien der Erythropoese Anschluß seziert. Dieses System erleichtert die funktionelle Analyse von spezifischen Genen in verschiedenen Entwicklungsstadien.

Maus fötalen Leberkultursystem zur Ziel Gen-Funktionen in der frühen und späten Stadien der Klemme Erythropoese Dissect

Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Quantifizierung der Spender gewonnenen Zellen ist erforderlich, um Engraftment nach Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwachen. Eine Kombination von Flow Cytometry-basierte Zellsortierung Kolonie Bildung Assay und anschließende Analyse von kurzen Tandem, die wiederholt verwendet werden, um die Verbreitung zu beurteilen und Differenzierung im Fach erythroiden Vorläuferzellen.

Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.

Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Die Modellierung der Erythropoese bietet eine wertvolle Möglichkeit, die biologische Bedeutung der Akteure in diesem Prozess zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu evaluieren, die Differenzierungsdefekte lindern können. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode, um CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen ex vivo effizient zu differenzieren.

Eine umfassende Pipeline zur Bewertung der Effizienz der menschlichen Erythropoese in vitro und ex vivo

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Identifikation von erythroiden Vorläufern in Mausgeweben. Diese Methode ermöglicht die Analyse von CD71/TER119-markierten Zellen zur Untersuchung der Erythropoese.

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

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