Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Vorläufer von Erythrozyten direkt in frisch geerntetem Gewebe von Mäusen zu identifizieren. Dies ermöglicht es uns, ihre molekularen Eigenschaften in Zeiten zu untersuchen, in denen sich das erythropoetische System bei diesen Mäusen verändert. Zum Beispiel wird während der Embryonalentwicklung oder während der Reaktion auf hypoxischen Stress erstes hämatopoetisches Gewebe aus der fetalen Leber der Maus oder der adulten Milz oder dem Knochenmark isoliert und in eine Einzelzellsuspension dissoziiert.

Als nächstes werden Zellen mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenmarker CD 71 und TER 19 markiert, und mit allen anderen Markern von Interesse, beispielsweise zur Messung des Zellüberlebens oder des Zellzyklusstatus, wird die markierte Zellsuspension dann unter Verwendung eines Durchflusszytometrie-Analysators analysiert und spezifische Erythroblasten-Untergruppen in unterschiedlichen Reifungsstadien identifiziert. Diese spezifischen Untergruppen können durch Zellsortierung aufgereinigt werden. Anschließend kann für jede Untergruppe der Erythroblastenreifung eine zelluläre und molekulare Analyse durchgeführt werden.

Die Möglichkeit, Erythroblasten in bestimmten Reifungsstadien direkt in frisch isolierten hämatopoetischen Geweben zu identifizieren, gibt uns die Möglichkeit, die Zellen im physiologischen Kortex zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns daher, hohe Erythroblasten verschiedener Reifestadien zu untersuchen und in vivo zu reagieren. Wenn Mäuse Reizen ausgesetzt werden, beschleunigen sie die erythropoetische Kiste.

Zum Beispiel hypoxische Zustände, die eine große Höhe oder die Injektion des Hormons Erythropoietin nachahmen. Wir verwenden die Multiparameter-Durchflusszytometrie, um A-Blats in einer komplexen Gewebeumgebung zu identifizieren und gleichzeitig ihr Überleben und ihren Zellzyklusstatus zu untersuchen. Wir können auch Erythroblasten, ihre spezifischen Reifestadien, direkt aus frischem Gewebe sortieren und ihre Genexpressionswerte, ihren Chromatinstatus oder andere molekulare Funktionen untersuchen.

Die definitive Erythropoese der Maus findet in der Milz und im Knochenmark der erwachsenen Maus statt. Daher werden diese Gewebe von einer euthanasierten Maus entnommen. Nach der Euthanasation der Maus wird Blut durch Herzpunktion in EDTA- oder Heparin-Blutentnahmeröhrchen entnommen, dieses Blut wird später für die Hämatokritzahl, die Retikulozytenzahl oder die CBC-Analyse verwendet.

Legen Sie die entnommene Milz und den Oberschenkelknochen in separate Röhrchen, die die Kaltfärbung enthalten. Puffer. Bewahren Sie das entnommene Taschentuch auf Eis auf, falls gewünscht. Wiegen Sie die Milz.

Mäuse, die einer erythropoetischen Stressreaktion ausgesetzt sind, zeigen wahrscheinlich eine signifikante Zunahme des Milzgewichts. Anschließend werden Milzzellen und Knochenmarkzellen aus dem entnommenen Gewebe durch Verfahren hergestellt, die zuvor am Mausembryo demonstriert wurden. Die definitive Erythropoese findet in der fetalen Leber zwischen dem 12.5. und 15.5. Embryonaltag statt.

Zeitlich trächtige weibliche Mäuse werden auf die Gewinnung fötaler Leberzellen an den Tagen 12,5 bis 14,5 der Trächtigkeit vorbereitet. Die zeitlich abträchtigen weiblichen Mäuse werden eingeschläfert und die Gebärmutterhörner werden in eine Petrischale mit Eis gebracht. Kaltkulturmedium oder Färbepuffer.

Ein Präpariermikroskop ist für die Präparierung der fetalen Leber ab dem embryonalen Tag 12,5 oder jünger erforderlich, um Embryonen aus der Gebärmutter zu entfernen. Trennen Sie zuerst jede Perle vom Horn. Schneiden Sie dann vorsichtig die Gebärmutterwand heraus, um den Embryo freizusetzen, der sich in seiner Fruchtblase befindet.

Ziehen Sie die Amnionmembran vorsichtig ab. Die fetale Leber ist das größte rote Bauchgewebe, das sich unter einem viel kleineren Herzen befindet. Um die Leber des Fötus zu präparieren, verwenden Sie eine Pinzette, um den Embryo auf beiden Seiten der Leber zu immobilisieren, und drücken Sie die Leber vorsichtig aus dem Bauch in das Medium.

Übertragen Sie die Leber vorsichtig in ein Röhrchen mit frischem Färbepuffer. Nachdem alle Lebern des Fötus präpariert und in ein Röhrchen mit frischer Färbung übertragen wurden. Puffer dissoziieren die Lebern mechanisch durch Pipettieren, filtrieren Sie dann die dissoziierten Zellen durch ein 40-Mikron-Nylonnetz-Siebwaschzellen zweimal durch Zentrifugation, verwerfen Sie den Überstand und die im Färbepuffer suspendierte Reanimation.

Nach der zweiten Wäsche färben Sie die Zellen mit Trianblau und zählen Sie sie mit einem Hämozytometer. Eine fetale Leber bei E 13,5 hat etwa 10 bis zur siebten. Die Zellen resuspendieren die Zellen ein- bis zweimal 10 bis sechs Zellen pro 200-Mikroliter-Probe für die durchflusszytometrische Analyse.

Für die Zwecke dieses Videoprotokolls wird die Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie nur an den fetalen Leberzellen demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine primäre Antikörper-Färbevormischung vor, die Folgendes enthält, gereinigtes Kaninchen-IgG zur Blockierung von FC-Rezeptoren in Mauszellen CD 71 FETR 19 PE und einen Antikörper, der schnell auf das Protein der Zelloberfläche gerichtet ist. Mischen Sie die Antikörperlösung vorsichtig, indem Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal umdrehen, 200 Mikroliter der primären Antikörperfärbung vorgemischt zu der zuvor vorbereiteten fetalen Leberzellprobe hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Bereiten Sie als Nächstes diese sechs Kontrollzellenproben vor. Eine ungefärbte Probe, in der die Zellen in Färbepuffer belassen werden, um die Hintergrundautofluoreszenz der Zellen zu gewährleisten, eine einzelne Farbe für jeden Antikörper oder die Farbe, die im Protokoll verwendet wird, um die spektrale Überlappung zwischen den Kanälen zu korrigieren, die in diesem Experiment TUR sind: eine 19 PE CD 71 fz schnell, Biotin und Streptavidin A PC und sieben A A DA Fluoreszenz minus eine Kontrolle für schnelles Biotin, Dies stellt den wahren Hintergrund für den Kanal dar, in dem die Zellen mit allen Farben oder Antikörpern des Protokolls mit Ausnahme von schnellem Biotin gefärbt werden. Inkubieren Sie die Probe und die relevanten Kontrollen in der primären Antikörperfärbung auf Eis für 45 Minuten bis eine Stunde im Dunkeln.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen, indem Sie drei Milliliter Färbepuffer in jedes Probenröhrchen geben und drei bis fünf Minuten lang bei etwa der 400-fachen Schwerkraft bei vier Grad Celsius drehen. Tragen Sie anschließend die Streptokokken in einem PC auf und inkubieren Sie die Röhrchen 30 bis 45 Minuten lang auf Eis. Nach Abschluss der Inkubation waschen Sie die Zellen wie bei der ersten Antikörperfärbung.

Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in einer Färbelösung, die den zellundurchlässigen DNA-Farbstoff sieben a a d enthält, um tote Zellen auszuschließen. Die Proben sind nun bereit für die durchflusszytometrische Analyse. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die korrekte Gating-Analyse von durchflusszytometrischen Ereignissen, die eine zuverlässige Identifizierung von Erythroblasten-Untergruppen ermöglicht.

Es erfordert eine sorgfältige maschinelle Einrichtung aller korrekten Kontrollproben, eine sorgfältige Kompensation der spektralen Überlappung und ein anschließendes Gating, das tote Zellen, Aggregate und sehr kleine Ereignisse ausschließt. Zu Beginn der Datenanalyse. Die ungefärbte Probe und die Einzelfarben-Kontrollproben werden verwendet, um die Kompensation der spektralen Überlappung für jede Farbkombination einzurichten.

In diesem Beispiel zeigen wir, wie die Fluoreszenz fit e in den PE-Kanal gelangt und wie diese spektrale Überlappung nach der Kompensation korrigiert wird. Zuerst definieren wir mit der ungefärbten Kontrolle einen Fit E-positiven und einen PE-negativen Bereich. Als nächstes können wir mit der einfarbigen Anpassung E den spektralen Spillover in den PE-Kanal visualisieren.

Nach der digitalen Kompensation mit der FlowJo-Software wird das Spillover-Fit-E-Signal im PE-Kanal minimiert. Einmal kompensierte tote Zellen, Aggregate und kleine Ereignisse können entfernt werden. Aggregate und Zelldubletten werden entfernt, indem die Vorwärts-Streuhöhe im Vergleich zur Vorwärts-Streufläche dargestellt und nach Ereignissen innerhalb eines schmalen diagonalen Gatters ausgewählt wird.

Abgestorbene Zellen werden entfernt, indem Zellen ausgewählt werden, die negativ für den undurchlässigen DNA-Tod einer Zelle sind. Das DAPI-negative Viable Cell Gate schließt auch sehr kleine Ereignisse wie Zellkerne oder Trümmer aus, die eine sehr geringe Vorwärtsstreuung aufweisen. Als nächstes zeigen wir die Gating-Strategie für fötale Leberzellen.

Frisch geerntete Zellen wurden für CD 71, TUR und 19 markiert, und ein Cocktail aus ZI-markierten Antikörpern, die auf nicht-erythroide Linienmarker gerichtet waren. In diesem Beispiel wurden die Proben bereits für spektrale Überlappungen kompensiert und dann so gegated, dass Aggregate, tote Zellen und sehr kleine Ereignisse ausgeschlossen wurden. Wir verwenden die FMO-Probe, die alle Farben mit Ausnahme des linienpositiven Fitzy-Farbstoffs enthält, um ein Fitzy-Histogramm zu erstellen und das Lineage-Negative-Cell-Gate zu definieren. Als nächstes wenden wir dieses Gate auf die fetale Leberzellprobe an, die mit ZI-konjugierten Lineage-Markern gefärbt wurde.

Abstammungsnegative Zellen werden ausgewählt und mit CD 71 auf der Y-Achse und TER 19 dargestellt. Auf der A-Achse können die Zellen nun in die Teilmengen S null bis S fünf unterteilt werden. Die Lin-depletierte S-Null-Untergruppe enthält größtenteils Zellen mit CFUE-Potenzial vor dem Einsetzen der EPO-Abhängigkeit.

Die Untergruppe S 1 enthält EPO-abhängige CFUE-Zellen, die sich größtenteils in der S-Phase des Zellzyklus befinden. S, zwei Zellen der Untergruppe, haben ihr Koloniebildungspotenzial verloren und beginnen, Hämoglobin zu exprimieren, Zellen der S3-Untergruppe sind weitgehend basophile Erythroblasten, die Untergruppen S vier und S fünf enthalten späte Erythroblasten. Hier ist die Analysestrategie nach der Datenerfassung von Milzzellen, die mit Antikörpern gegen CD 71 und TER 19 verarbeitet und markiert wurden, sowie das Todesrezeptor-Fast-Histogramm dargestellt.

Eine zeigt alle erfassten Ereignisse, bei denen das diagonale Gatter Ereignisse darstellt, bei denen es sich wahrscheinlich um einzelne Zellen handelt, mit Ausnahme von Dubletten oder größeren Aggregaten. Die Zellen in diesem Gate werden im zweiten Histogramm weiter analysiert. Sehr kleine Ereignisse, wahrscheinlich Kerne oder Trümmer, sind ausgeschlossen.

Die Gated Cells sind im dritten Histogramm dargestellt, wobei DAPI-positive Zellen, die wahrscheinlich membranpermeable apoptotische Zellen sind, von der weiteren Analyse ausgeschlossen sind. Histogramm vier zeigt die resultierende Population lebensfähiger Milzzellen. Das pro eGate enthält CD 71 hohe TER eins 19 Intermediäre Zellen tur R one 19 hohe Zellen werden im Histogramm fünf weiter analysiert.

Hier werden die hohen Zellen der CD 71 in weniger reife große Bereiche, a Erythroblasten und kleinere, reifere AB Erythroblasten unterteilt. Die reifste Untergruppe von Erythroblast ist ARI C. Die Expression von Zelloberflächenproteinen kann für jede dieser Untergruppen gleichzeitig gemessen werden, indem die relevanten Antikörper gleichzeitig mit TER R 19 und CD 71 hinzugefügt werden. Das Färbehistogramm sechs zeigt eine schnelle Expression des Todesrezeptors auf der Zelloberfläche, spezifisch in dem Bereich, A-Untergruppe bei Mäusen im basalen Zustand und Mäusen, denen eine Einzeldosis E ppo injiziert wurde.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass EPO die schnelle Expression in diesem Bereich unterdrückt. Die In-vivo-Expression intrazellulärer Proteine oder der Zellzyklusstatus einer Population kann auch für Zellen in jeder Untergruppe gemessen werden. In dieser repräsentativen Zellzyklusanalyse wurde Mäusen intraperitoneal BRDU injiziert und 30 bis 60 Minuten später Knochenmark entnommen.

Zusätzlich zu den Zellen, die für CD 71 und TER 19 gefärbt wurden, wurden die Zellen für den BRDU-Einbau in ihre replizierenden D-N-A-B-R-D-U-positiven Zellen gefärbt, die sich in der S-Phase des Zyklus befinden. Grenzflächenzellen sind BRDU-negativ und können in G eins oder G zwei M Phasen aufgelöst werden. Mit Hilfe der DNAD können sieben A, A, D-Zellen aus jedem der PRO-E-Bereiche, A, A, B und A, EC-Untergruppen sortiert werden.

Hier werden sie in Cytosinpräparaten gezeigt, die eine sequentielle Reifung mit abnehmender Zellgröße, Kernkondensation und zunehmender Braunfärbung zeigen, die die Hämoglobinexpression widerspiegelt. Abschließend wird hier eine repräsentative Zellzyklusanalyse der S3-Untergruppe in der fetalen Leber von E 13.5 gezeigt. Trächtigen Mäusen wurde BRDU injiziert.

Die Lebern des Fötus wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet, fixiert und mit Antikörpern gegen CD 71, TER 19 und BRDU gefärbt. Der Zellzyklusstatus von S3-Zellen wird dort analysiert, wo sich S-Phasen-Zellen befinden. Der BRDU-positive und der DNA-Gehalt wird durch Färbung für den DNA-Farbstoff sieben A a a d quantifiziert.

Der von uns beschriebene zytometrische Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung zellulärer Funktionen wie die Expression von Zelloberflächenmarkern und anderen Proteinen, das Überleben der Zellen mit Hilfe von fosso-spezifischen Antikörpern und den Zellzyklusstatus. Es ermöglicht uns daher, die molekularen Reaktionen von Erythroblasten, ein anderes Reifungsstadium auf eine Vielzahl von Reizen oder die Wirkung genetischer Mutationen zu untersuchen. Es ist zu beachten, dass die untergruppen der durchflusszytometrischen Reifung in Bezug auf die Expression von Zelloberflächenmarkern und die Vorwärtsstreuung definiert sind.

Wir fanden heraus, dass die Zellen in jeder Untergruppe in einer Vielzahl von Mausmodellen im Allgemeinen einem ähnlichen morphologischen Erythroblastenstadium entsprechen. Es wird jedoch empfohlen, dies zu überprüfen, wenn Sie ein neues Mausmodell untersuchen. Durch das Sortieren von Zellen aus jeder Untergruppe und die Untersuchung ihrer Morphologie Zellen aus jeder Untergruppe können auch für die RNA- oder Transkriptomanalyse sortiert werden. Sortierexperimente verwenden einen niedrigen Sortierdruck und breite Nasen, um die schiere Belastung der Zellen zu minimieren.

Wir empfehlen auch, die Reinheit und Viabilität der Zellen nach jedem Sortierexperiment zu überprüfen. Schließlich ist es beim Erkennen einer Änderung der Häufigkeit einer bestimmten Teilmenge wichtig zu bestimmen, ob dies auf eine echte Änderung der Anzahl der Zellen in dieser Teilmenge oder auf Änderungen in anderen Teilmengen zurückzuführen ist. Daher ist es immer notwendig, neben der Messung der Teilmengenhäufigkeiten auch die absolute Anzahl der Zellen in jeder Teilmenge zu messen.