Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Abschnitten des Dünndarms zu isolieren, die anschließend für die Durchflusszytometrie oder eine alternative Charakterisierungsmethode verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Schleimhautimmunologie zu beantworten, beispielsweise wie die Mikrobiota die Entwicklung des intestinalen Immunsystems beeinflusst. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind ihre Schnelligkeit, Reproduzierbarkeit und die Tatsache, dass sie keine zeitaufwendigen Percoll-Gradienten erfordert.

Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die Maus mit der dorsalen Seite nach unten und besprühen Sie den Bauchbereich mit 70 Prozent Ethanol. Führen Sie eine Laparotomie durch, indem Sie nacheinander die Haut und dann die peritoneale Faszie entlang der ventralen Mittellinie vom Schambein bis zum Xiphoid fortsetzen, wodurch die Bauchhöhle freigelegt wird. Trennen Sie anschließend den Dünndarm vom Magen, indem Sie den Pylorusschließmuskel durchtrennen. Entfernen Sie den Dünndarm vorsichtig vom Peritoneum und lösen Sie das mesenteriale Fett ab.

Um den Dünndarm vollständig zu entfernen, führen Sie einen zweiten Schnitt an der Ileozäkalklappe durch. Legen Sie den isolierten Dünndarm in RPMI-Medium mit vier Grad Celsius, das 10 Prozent FBS enthält, um die Zellviabilität zu maximieren. Entfernen Sie vorsichtig große Fettstücke mit einer gebogenen Pinzette und achten Sie darauf, das Darmgewebe während des Vorgangs nicht zu beschädigen.

Um den Darminhalt zu entfernen, kannulieren Sie das proximale Ende des Dünndarms mit einer 18-Gauge-Fütterungsnadel, die an einer Spritze befestigt ist, und spülen Sie den Darm vorsichtig mit 15 bis 20 Milliliter kaltem PBS aus. Schneiden Sie mit einer Schere die Peyer-Plaques aus, die sich an der antimesenterialen Seite des Dünndarms befinden und als mehrfach gelappte weiße Masse erscheinen. Anschließend geben Sie sie in kaltes RPMI-Medium, das fünf Prozent FBS enthält.

Schneiden Sie danach den Dünndarm in drei bis vier Zoll lange Segmente und entfernen Sie das restliche Fett, indem Sie jedes Dünndarmsegment auf einem mit RPMI angefeuchteten Papierhandtuch abrollen. Verwenden Sie ein stumpfes Skalpell, um das Fett vorsichtig vom Gewebe zu lösen. Es ist entscheidend, streng darauf zu achten, dass das mesenteriale Fett vollständig entfernt wird, um die Vitalität der Lymphozyten sicherzustellen, da bereits kleinste Fettrückstände zum Absterben der Zellen führen können. Danach stülpen Sie das Gewebe um, indem Sie die Darmsegmente mit einer gebogenen Pinzette kanülieren und das distale Ende des Gewebes festhalten. Anschließend ziehen Sie das Gewebestück vorsichtig mit einer geraden Pinzette vom proximalen Ende ab, wodurch das Gewebe nach innen gestülpt wird.

Legen Sie die Gewebestücke in einen Becher, der 30 Milliliter Extraktionsmedium und einen Rührstab enthält. Verschließen Sie den Becher mit einem Deckel und rühren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Das Rühren sollte kräftig, aber nicht turbulent sein.

Nach 15 Minuten das Gewebestücke mithilfe eines Stahlsiebs vom überstehenden Epithel enthaltenden Überstand trennen, der trüb erscheinen sollte. Die Gewebestücke manuell in RPMI-Medium schwenken, um das restliche Extraktionsmedium abzuwaschen. Anschließend das Gewebe auf ein trockenes Papiertuch legen und mehrmals umdrehen, um die Entfernung von restlichem Schleim zu erleichtern, der durch das Extraktionsmedium nicht gelöst wurde.

Anschließend die Gewebefragmente in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 600 µL Verdauungsmedium geben. Das Gewebe zerkleinern, bis die Stücke nicht mehr an der Schere haften und die Lösung homogen erscheint. Dieser Schritt ist entscheidend, um einen vollständigen enzymatischen Gewebeverdau zu gewährleisten.

Das Zerkleinern des Gewebes, bis die Stücke nicht mehr an der Schere haften und die Lösung homogen erscheint, ist entscheidend, um eine hohe Zellausbeute sowie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Geben Sie den zerkleinerten Dünndarm in einen Becher mit 25 Milliliter Verdauungsmedium und rühren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Zur Hälfte der Verdauungszeit pipettieren Sie die Probe mehrmals mit einer serologischen Pipette auf und ab, um die Zerkleinerung größerer Gewebestücke zu unterstützen.

Als Nächstes filtrieren Sie das Verdauungsgewebe durch einen Zellfilter mit 100 Mikrometer Porengröße in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie den Filter mit 20 Millilitern RPMI-Medium, das 10 Prozent FBS enthält. Anschließend zentrifugieren Sie die filtrierte Lösung 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Den Überstand vorsichtig abgießen und das Pellet in einem Milliliter RPMI-Medium mit 10 Prozent FBS erneut suspendieren. Die resuspendierten Zellen durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 15-Milliliter-Röhrchen filtrieren. Den Sieb mit 20 Millilitern RPMI, das 10 Prozent FBS enthält, ausspülen.

Anschließend die filtrierte Lösung 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Das Überstand sorgfältig abgießen und das Pellet in einem Milliliter RPMI-Medium mit zwei Prozent FBS erneut suspendieren. In diesem Verfahren die entfernten Peyer-Plaques in einen Becher mit 25 Milliliter Digestionsmedium und einem Rührfisch überführen.

Deckel schließen und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius zentrifugieren. Danach das verdauten Peyer-Plaques durch einen 40 µm-Zellfilter in ein 15 mL-Röhrchen filtrieren. Falls noch Klumpen vorhanden sind, diese mit dem flachen Ende des Kolbens einer 1 mL-Spritze durch den Filter drücken.

Anschließend spülen Sie das Sieb mit 10 Milliliter RPMI-Medium, das 10 Prozent FBS enthält. Zentrifugieren Sie die filtrierte Lösung 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Danach entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter RPMI-Medium, das zwei Prozent FBS enthält.

Die Durchflusszytometrie von Einzelzell-Suspensionen aus Dünndarm-Lymphozyten sollte eine deutliche Zellpopulation ergeben, die ähnliche Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften wie Milzzellen aufweist. Die Lymphozyten können absterben, wenn das Gewebe in den Anfangsphasen der Isolierung nicht bei vier Grad Celsius gehalten wird, was dazu führt, dass die Lymphozytenpopulation eine geringere Vorwärtsstreuung zeigt und sich schwieriger von anderen epithelialen und toten Zellen abtrennen lässt. Außerdem kommt es nahezu vollständig zum Verlust der Lymphozyten, wenn das mesenteriale Fett nicht vollständig aus dem Dünndarmgewebe entfernt wird.

In der Regel wird eine 80-prozentige Vitalität der lymphatischen Zellen aus der Lamina propria des Dünndarms erzielt. Nach Beherrschung der Technik können vier Mäuse verarbeitet und Einzelzell-Suspensionen innerhalb von weniger als vier Stunden zur Färbung bereitgestellt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, das gesamte mesenteriale Fett vollständig zu entfernen und das Gewebe gut zu zerkleinern, um eine vollständige Verdauung sicherzustellen.

Nach diesem Verfahren können Einzelzell-Suspensionen für andere Zwecke als die Durchflusszytometrie verwendet werden, beispielsweise für In-vitro-Experimente, die Analyse der Genexpression oder die adoptive Übertragung, um die Funktion dieser Zellen weiter zu charakterisieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Schleimhautimmunologie den Weg, um die Ontogenese und funktionellen Bedeutungen des intestinalen Immunsystems bei Mäusen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelzell-Suspensionen aus verschiedenen Abschnitten des Dünndarms isoliert, indem man das mesenteriale Fett entfernt, die epitheliale Schicht extrahiert und das Gewebe mit Kollagenase verdaut.