Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten zu isolieren, die anschließend für die durchflusszytometrische Analyse oder ein alternatives Mittel zur Charakterisierung verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Schleimhautimmunologie zu beantworten, z. B. wie sich die Mikrobiota auf die Entwicklung des intestinalen Immunsystems auswirkt. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie schnell und reproduzierbar sind und keine aufwendigen Percoll-Gradienten erfordern.

Um diesen Eingriff zu beginnen, legen Sie die Rückenseite der Maus nach unten und besprühen Sie den Bauch mit 70 Prozent Ethanol, führen Sie eine Laparotomie durch, indem Sie nacheinander die Haut und dann die Peritonealfaszie entlang der ventralen Mittellinie von der Schamsymphyse bis zum Xiphoid-Prozess schneiden, wodurch die Peritonealhöhle freigelegt wird. Trennen Sie als Nächstes den Dünndarm vom Magen, indem Sie den Pylorusschließmuskel durchtrennen. Entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm aus dem Bauchfell und ziehen Sie das mesenteriale Fett heraus.

Um den Dünndarm vollständig zu entfernen, machen Sie einen zweiten Schnitt am Ileozökalübergang. Platzieren Sie den isolierten Dünndarm in ein vier Grad Celsius heißes RPMI-Medium, das 10 Prozent FBS enthält, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Entfernen Sie vorsichtig große Fettstücke mit einer gebogenen Pinzette und seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass das Darmgewebe selbst während des Prozesses zerreißt.

Um den Darminhalt zu entfernen, kanülieren Sie das proximale Ende des Dünndarms mit einer 18-Gauge-Ernährungsnadel, die auf einer Spritze befestigt ist, und spülen Sie den Darm vorsichtig mit 15 bis 20 Millilitern kaltem PBS aus. Verwenden Sie eine Schere, um Peyer-Pflaster zu entfernen, die sich auf der antimesenterialen Seite des Dünndarms befinden und als mehrlapulierte weiße Masse erscheinen. Legen Sie sie dann in kaltes RPMI-Medium, das fünf Prozent FBS enthält.

Schneiden Sie als Nächstes den Dünndarm in drei bis vier Zoll große Segmente, entfernen Sie das restliche Fett, indem Sie jedes Dünndarmsegment auf ein mit RPMI angefeuchtetes Papiertuch rollen, und verwenden Sie ein stumpfes Skalpell, um das Fett vom Gewebe wegzukitzeln. Die strikte Beachtung der vollständigen Entfernung von mesenterialem Fett ist entscheidend, um die Lebensfähigkeit der Lymphozyten zu gewährleisten, da selbst kleinste Fettstücke zum Absterben von Zellen führen können. Drehen Sie danach das Gewebe auf links, indem Sie die Darmsegmente mit einer gebogenen Pinzette kanülieren und das distale Ende des Gewebes greifen, dann verwenden Sie eine gerade Pinzette, um das Gewebesegment vorsichtig vom proximalen Ende zu entfernen, was dazu führt, dass das Gewebe invertiert wird.

Legen Sie die Gewebesegmente in einen Becher mit 30 Millilitern Extraktionsmedium und einem Rührstab. Den Deckel auf den Deckel setzen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius rühren. Das Rühren sollte kräftig, aber nicht turbulent sein.

Trennen Sie nach 15 Minuten mit einem Stahlsieb die Gewebestücke von dem Epithel, das den Überstand enthält, der trüb erscheinen sollte. Rühren Sie die Gewebestücke manuell in RPMI-Medium, um das restliche Extraktionsmedium wegzuspülen. Legen Sie dann das Taschentuch auf ein trockenes Papiertuch und drehen Sie es mehrmals um, um die Entfernung von Schleimresten zu erleichtern, die nicht durch das Extraktionsmedium freigesetzt wurden.

Anschließend werden die Gewebefragmente in ein Ein-Punkt-Fünf-Liter-Röhrchen mit 600 Mikrolitern Verdauungsmedium gegeben. Das Gewebe so lange fein hacken, bis die Stücke nicht mehr an der Schere kleben und die Lösung homogen erscheint. Dieser Schritt ist entscheidend, um eine vollständige enzymatische Verdauung des Gewebes zu gewährleisten.

Das Zerkleinern des Gewebes, bis die Stücke nicht mehr an der Schere haften und die Lösung homogen erscheint, ist entscheidend, um die zelluläre Ausbeute zu gewährleisten und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Den gehackten Dünndarm in eine Tasse mit 25 Millilitern Verdauungsmedium geben und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius rühren. Nach der Hälfte der Verdauung spritzen Sie es mit einer serologischen Pipette auf und ab, um große Gewebebrocken aufzuspalten.

Als nächstes filtrieren Sie das Verdauungsgewebe durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie das Sieb mit 20 Millilitern RPMI-Medium mit 10 Prozent FBS. Anschließend zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI-Medium mit 10 Prozent FBS. Filtern Sie die resuspendierten Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie das Sieb mit 20 Millilitern RPMI, die 10 Prozent FBS enthalten.

Anschließend zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI-Medium, das zwei Prozent FBS enthält. Bei diesem Verfahren werden die exzidierten Peyer-Pflaster in einen Becher mit 25 Millilitern Aufschlussmedium und einem Rührstab gegeben.

Den Deckel zuklappen und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius schleudern. Filtrieren Sie anschließend die verdauten Peyer's Patches durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn noch Klumpen übrig sind, drücken Sie sie mit dem flachen Ende des Kolbens aus einer Ein-Milliliter-Spritze durch das Sieb.

Spülen Sie dann das Sieb mit 10 Millilitern RPMI-Medium aus, das 10 Prozent FBS enthält. Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie dann den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter RPMI-Medium, das zwei Prozent FBS enthält.

Die durchflusszytometrische Analyse von Einzelzellsuspensionen von Dünndarmlymphozyten sollte eine diskrete Population von Zellen ergeben, die ähnliche Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften wie Splenozyten aufweisen. Die Lymphozyten können zu sterben beginnen, wenn das Gewebe in den Anfangsstadien der Isolierung nicht bei vier Grad Celsius gehalten wird, was dazu führt, dass die Lymphozytenpopulation eine geringere Vorwärtsstreuung aufweist und schwieriger von anderen epithelialen und toten Zellen zu trennen ist. Wird das Mesenterialfett nicht vollständig aus dem Dünndarmgewebe entfernt, kommt es zudem zu einem nahezu vollständigen Verlust der Lymphozyten.

In der Regel wird eine 80-prozentige Lebensfähigkeit für dünnintestinale LP-Lymphozyten erreicht. Einmal gemeistert, kann man vier Mäuse verarbeiten und hat Einzelzellsuspensionen in weniger als vier Stunden zum Färben bereit. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, das gesamte Mesenterialfett vollständig zu entfernen und das Gewebe gut zu zerkleinern, um eine vollständige Verdauung zu gewährleisten.

Nach diesem Verfahren können Einzelzellsuspensionen für andere Zwecke als die Durchflusszytometrie verwendet werden, wie z. B. En-vitro-Experimente, Genexpressionsanalysen oder Adoptionstransfer, um die Funktion dieser Zellen weiter zu charakterisieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in der Schleimhautimmunologie, um die Ontogenese und die funktionellen Implikationen des intestinalen Immunsystems bei Mäusen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelzellsuspensionen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten isoliert, indem man das Mesenterialfett reinigt, die Epithelschicht extrahiert und das Gewebe mit Kollagenase verdaut.