Name: Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die DIVA-Seq-Methode zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung von Mausneuronen mit manueller Sortierung. Dieses Protokoll ermöglicht die präzise Isolierung fluorescenzmarkierter Neuronen aus definierten Hirnregionen für hochauflösende Genexpressionsanalysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (5R01MH094705 / 04 und R01MH109665-01, Z.J.H.), CSHL Robertson Neurowissenschaften Fonds (Z.J.H.) und ein NARSAD Postdoc-Stipendium (für A.P.) unterstützt.

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

Autoren erklären, dass es keine finanzielle Interessenkonflikte gibt.

Das manuelle Sortieren Protokoll eignet sich für eine betreute RNA Sequenzierung des Neurons Populationen, die entweder dünn mit der Bezeichnung im Gehirn von Mäusen oder repräsentieren eine seltene Zellpopulation, die sonst nicht möglich ist, mit aktuellen Hochdurchsatz-Zelle zu studieren Sortierung und Verstärkung Methoden. Zellen ausgesetzt FACS in der Regel durchlaufen Mantel und Probe Linie Drücke im Bereich von ~ 9 – 14 Psi, je nach Düsengröße und Ereignisraten gewünscht. Darüber hinaus können die Zellen auf aus de...

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) verwandelte transkriptomischen Studien. Während große einzellige RNAseq ausgeführt werden kann, mit einer Vielzahl von Techniken, wie Tropfen1,2, Mikrofluidik3, Nanogrids4und Mikrovertiefungen5, können nicht die meisten Methoden definierte Zelltypen sortieren. genetisch codierte Fluorophore ausdrücken. Um eine wählen Sie die Zellenbevölkerung zu isolieren, wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) häufig verwendet, um markierte Zellen in eine einzelne Zelle Modus zu sortieren. Allerdings FACS hat einige Einschränkungen und erfordert sorgfältige Verarbeitung Beispielschritte. Erstens eine große Anzahl von Eingabezellen sind in der Regel benötigt (oft mehrere Millionen Zellen pro mL), mit einem signifikanten Anteil (> 15 – 20 %) mit der beschrifteten Bevölkerung. Zweitens können Zelle Vorbereitungen erfordern mehrfache Umläufe der Dichte Gradienten Zentrifugation Schritte zum Entfernen von Gliazellen Bruchteil, Schmutz und Zelle-Klumpen, die sonst die Düse oder Flow Zelle verstopfen könnte. Drittens: FACS beschäftigt in der Regel färben und Entfärben Schritte für die lebenden/Toten Färbung (z. B. 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Propidium Jodid (PI) und Cytotracker Farbstoffe), die zusätzliche Zeit in Anspruch nehmen. Viertens: als Faustregel für Zweifarben-Sortierung (z. B. DAPI und grün/rot fluoreszierenden Proteins (GFP/RFP)), in der Regel zwei Proben und ein Steuerelement benötigt werden, erfordern eine unbeschriftete Probe neben die gewünschte Maus Belastung verarbeitet werden. Fünftens ist Filterung oft mehrmals vor und während der Probe zu sortieren, um proaktiv verhindert verstopfte Querprofillinien in ein FACS-Maschine durchgeführt. Sechstens muss Zeit zugeteilt werden, in am häufigsten verwendeten FACS-Setups zu initialisieren und stabilisieren den Fluidstrom und Tröpfchen Kalibrierung durchführen. Siebte, Kontrolle, die Proben in der Regel in der Reihenfolge vor der eigentlichen Probenentnahme Entschädigung Matrizen, Wams Ablehnung einzurichten laufen, Tore, etc. Benutzer entweder führen Sie die Schritte 6 bis 7 sich vorzeitig oder erfordern die Hilfe eines Technikers parallel. Zu guter Letzt Post-FACS, oft gibt es Maßnahmen, um sicherzustellen, dass nur einzelne beschriftet Zellen sind in jede Vertiefung; zum Beispiel durch Überprüfung Proben in einem High-Content-Screening-Setup wie eine schnelle Platte-Imager.
Um die oben beschriebenen Schritte zu umgehen und erleichtern eine relativ schnelle, gezielte Sequenzierung von eine kleine Population von einzelnen Eindringmittel beschrifteten Neuronen, beschreiben wir eine manuelle Sortieren gefolgt von zwei Runden von einem hochsensiblen in-vitro- Verfahren Verstärkung-Protokoll, genannt double in-vitro-Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq). Die RNA-Verstärkung und cDNA-Bibliothek-Generation sind von Eberwine Et al. 6 und Hashimshony Et al. 7, mit bestimmten Modifikationen entsprechend Maus Interneuronen, die kleinere zelluläre Volumen haben; Darüber hinaus haben wir auch gefunden, dass es ebenso nützlich für exzitatorischen pyramidale Neuronen.

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Fragmentierungspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# E6105S</td><td></td></tr><tr><td>RNA MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>Cat# 74204</td><td></td></tr><tr><td>Antarktische Phosphatase</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0289</td><td></td></tr><tr><td>Polynukleotidkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase2, trunkiert</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp magnetische Kügelchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIgrößenauswahl magnetische Kügelchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Cat# 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1078</td><td></td></tr><tr><td>Protease from Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P5147</td><td></td></tr><tr><td>Message Amp II Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA kit</td><td>Illumina</td><td>Cat# RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalysator RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer High Sensitvity DNA-Chip</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop mit Fluoreszenz- und Hellfeldbeleuchtung mit DIC-Optik. (Leica Modell MZ-16F).</td><td>Leica</td><td>Modell MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapillare aus Glas: Borosilikat-Kapillarrohre 500/pk. OD= 1 mm, ID=0,58 mm, Wand= 0,21 mm, Länge= 150 mm.</td><td>Warner instruments</td><td>Modell GC100-15, Bestell# 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarpipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Gewebekühlgerät</td><td>Thermo Microm</td><td>CU 65</td><td></td></tr></tbody></table>

einzellige rna sequenzierung von eindringmittel beschrifteten maus neuronen mit handsortierung und doppelte in vitro transkription mit absoluten zählt sequenzierung (diva-seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) ist jetzt ein weit implementierten Werkzeug für die Untersuchung der Genexpression. Handelsübliche einzellige RNA-Sequenzierung Plattformen verarbeiten alle Eingabezellen wahllos. Manchmal wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) stromaufwärts verwendet, um einen speziell gekennzeichneten Bevölkerung von Interesse zu isolieren. Eine Einschränkung des FACS ist die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Eingabezellen mit deutlich beschrifteten Brüche, unpraktisch zum sammeln und Profilerstellung seltene oder spärlich beschrifteten Neuron Populationen aus dem Gehirn der Maus. Hier beschreiben wir eine Methode für manuell sammeln spärlich Eindringmittel mit der Bezeichnung einzelner Neuronen aus frisch Maus Hirngewebe dissoziiert. Dieser Prozess ermöglicht es für die Erfassung mit der Bezeichnung der einzelnen Neuronen mit hoher Reinheit und anschließende Integration mit einer in-vitro- Transkription-basierte Verstärkung Protokoll, die endogene Transkript Verhältnisse bewahrt. Wir beschreiben eine doppelte lineare Verstärkung-Methode, die einzigartige Molekül Bezeichner (UMIs) verwendet, um einzelne mRNA zählt zu generieren. Zwei Runden der Verstärkung ergibt ein hohes Maß an gen-Erkennung pro Einzelzelle.

Mit der oben beschriebenen Protokoll, GABAergen Neuronen manuell wurden sortiert (Abbildung 1) und RNA wurde verstärkt, dann in eine cDNA-Bibliothek (Abbildung 2) und bei großer Tiefe8sequenziert. Die verstärkte RNA (aRNA) Produkte lagen zwischen 200 – 4.000 bp in der Größe, mit einer Spitze Verteilung leicht über 500 bp (Abb. 3A). Die Perle-gereinigte cDNA-Bibliothek wurde we...

Dieses Protokoll beschreibt das manuelle Sortieren Verfahren, um einzelne Eindringmittel beschrifteten Neuronen, gefolgt von in-vitro- Transkription-basierte mRNA Verstärkung für die hoch-Tiefe einzellige RNA Sequenzierung zu isolieren.

Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Diese Methode kann helfen, ein Haupthindernis im Bereich der Single-Neuron-Isolation und -Sequenzierung zu lösen. Wie das Sammeln einer bestimmten Population oder einer Subpopulation von fluoreszierend markierten Neuronen aus dem benutzerdefinierten Hirnbereich. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sicherstellt, dass das einzelne Neuron von Interesse erfasst wird, ohne Denreste zu kontaminieren.Es ist auch relativ sanft, was für empfindliche Neuronentypen wichtig ist, die schnell sterben, wenn sie den Flüssigkeitsdrücken der konventionellen FACS-Sortierung ausgesetzt sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung gezogener Glasmikrokapillaren mit 10 bis 15 Mikron Austrittsdurchmesser mit einem Kapillarzieher. Verwenden Sie eine feine Schere, um die Spitze der Kapillare zu schneiden, um den gewünschten Plattendurchmesser zu erhalten.Verwenden Sie dann Schlauchstecker, um einen 120 bis 150 Zentimeter langen flexiblen Silikonschlauch mit 0,8 Millimeter Innendurchmesser an einen 0,2-Mikron-PVDF-Membranspritzenfilter und ein Zwei-Wege-Schlauchventil zu befestigen. Bereiten Sie 500 Milliliter gekühlte künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit oder ACSF vor und sauerstoffhaltigen, indem Sie 5% Kohlendioxid-Ausbader Sauerstoff durch einen Airstone für 15 Minuten oder bis die Lösung vollständig abklarheiten. Bereiten Sie drei 150-Milliliter-Becher mit je 100 Milliliter ACSF vor.Fügen Sie einen Cocktail von Aktivitätsblockern hinzu. Zu einem anderen, fügen Sie Streptococcus-Fraktion für Protease zu einer endgültigen Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Zum Endbecher, fügen Sie FBS zu einer Endkonzentration von 1% hinzu und sauerstoffhaltigen mit 5% Kohlendioxid-ausbalanciertem Sauerstoff durch einen Airstone.Schließlich machen Sie drei langstämmige Pasteur Pipetten mit abnehmenden Austrittsdurchmessern, indem Sie sie über eine offene Flamme rollen. Sezieren Sie das Gehirn von einer eingeschläferten Maus, indem Sie den Schädel mit einer kleinen Schere öffnen und das frische Gehirn mit feinen Zangen extrahieren, ohne den Kortex zu beschädigen. Legen Sie das Gehirn in gekühlten und sauerstoffhaltigen ACSF und hinterlassen Sie einen Airstone, der während der gesamten Dauer des Schnitts an 5% Kohlendioxid-ausbalanciertem Sauerstoff gebunden ist.Positionieren Sie das Gehirn auf dem Vibratomfutter und schneiden Sie koronale oder sagittale Abschnitte bei 300 Mikron Dicke. Sammeln Sie so viele Abschnitte wie nötig, um mindestens 10 bis 50 markierte Zellen zu erhalten. Legen Sie Scheiben auf einen baumwollmaschigen Scheibenhalter, der in einen Becher gelegt wird, damit sie in sauerstoffhaltigem ACSF gebadet werden.Bewegen Sie die Scheiben in den Becher, der ACSF mit Aktivitätsblockern enthält, und blockieren Sie 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie mit einem Airstone Sauerstoff sprudeln. Bewegen Sie die Scheiben auf den Becher, der ACSF enthält, mit der Protease-Lösung, um eine leichte Verdauung bei Raumtemperatur durchzuführen. Waschen Sie nach der Verdauung die Protease aus, indem Sie die Scheiben bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten lang wieder in den Becher mit ACSF mit Aktivitätsblockerlösung bewegen.Halten Sie sprudelnden Sauerstoff. Als nächstes bereiten Sie eine 100-Millimeter-Petrischale mit ACSF mit 1%FBS bei Raumtemperatur vor und bewegen Sie einzelne Abschnitte in die Scheibe für die Mikrodissektion. Verwenden Sie unter einem fluoreszierenden Sezieren Bereich ein Paar feiner Zangen, um Bereiche und Interessenschichten mit mindestens 10 bis 50 Zellen mikrosezieren zu können.Mit einer Pasteur-Pipette bewegen Sie die mikrosezierten Teile in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das etwa 0,8 Milliliter 1%FBS in ACSF-Lösung enthält. Tittieren Sie das sezierte Gewebe im Mikrofugerohr bei Raumtemperatur. Führen Sie ca. 10 Schläge mit jeder der geflammten Pasteur Pipetten aus, beginnend mit der größten und endend mit dem kleinsten Austrittsdurchmesser.Geben Sie die dissoziierten Zellen in eine 100-Millimeter-Petrischale mit sauerstoffhaltigem ACSF und warten Sie fünf bis sieben Minuten, bis sich die Zellen allmählich absetzen. Beobachten Sie das GFP- und RFP-Signal unter einem Seziermikroskop. Identifizieren Sie Trümmer, indem Sie die Morphologie unter Hellfeldbeleuchtung untersuchen.Sobald ein Zellbereich mit wenig Schutt identifiziert wurde, verwenden Sie die Kapillare und befestigen Sie an Schläuchen, um Zellen zu pflücken, indem Sie das Ende des Schlauchventils mit der Zunge blockieren. Positionieren Sie dann die Kapillare in der Nähe der Zellen. Lösen Sie den Block auf der Kapillare und blockieren Sie schnell wieder, um die Zelle mit Kapillarwirkung zu erfassen.Bewegen Sie die Kapillare auf eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem sauerstoffreichem ACSF und blasen Sie sanft in das Rohr, während Sie die Kapillarspitze unter Fluoreszenzoptik beobachten, um die Zellen in die Schale zu geben. Wiederholen Sie den Sammelvorgang, bis 100 bis 150 Zellen gesammelt werden, um sicherzustellen, dass Verunreinigungen wie Schmutz in der Optik für unterschiedliche Störwellen im hellen Feld minimal sind. Schließlich wählen Sie mit einer frischen Mikrokapillarpipetten jedes Mal eine einzelne Zelle aus und vertreiben Sie sie in nicht mehr als 0,5 Mikroliter in ein 0,2-Mikroliter-Mikrofuge-Rohr, das einen Mikroliter Probensammelpuffer mit Primern enthält.Brechen Sie die Pipettenspitze im Mikrofugerohr, um sicherzustellen, dass die Zelle im Sammelpuffer verbleibt. Einfrieren der Zellen, indem Sie die Rohre auf Trockeneis setzen. In einem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius bis zur Verarbeitung zur RNA-Verstärkung aufbewahren.GABAerge Neuronen wurden aus dem Cingulet Cortex des Mausgehirns isoliert. Die aus den manuell sortierten Neuronen verstärkten RNA-Verstärkungen lagen zwischen 200 und 4.000 Basenpaaren mit einer Spitzenverteilung von etwas über 500 Basenpaaren. Nach der Perlenreinigung wird die cDNA-Bibliothek durch eine zweite Reinigungsrunde mit Perlen zur Beseitigung von Fragmenten von weniger als 200 Basenpaaren und für den Spitzenwert bei etwa 350 Basenpaaren weiter eingeschränkt.Die Sequenzierung zeigte 4,8 mal 10 bis 5. Median oder 6,9 mal 10 bis zum 5. durchschnittlich enden den zugeordneten Lesevorgängen pro Zelle. Nach der doppelten RNA-Entfernung mit UMIs hatte jede einzelne Zelle 1,0 mal 10 bis 5. Median oder 1,4 mal 10 bis zum 5. durchschnittlichen eindeutigen Lesewert pro Zelle. In jedem einzelnen externen RNA-Kontrollkonsortium wurde die RNA-Spitze als interne Kontrolle verwendet, um die absolute Anzahl der Moleküle zu berechnen, die der Probe hinzugefügt wurden.Es gab eine lineare Beziehung der Eingabe zu beobachteten Zählungen mit einer Neigung von 0,92 und einem angepassten R-Quadrat von 0,94. Mit diesem Verfahren wurden durchschnittlich etwa 10.000 Gene pro einzelnem Neuron nachgewiesen, wobei mehr als 95 % der einzelzellen mehr als 6.000 Gene detektieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Molekularbiologen, das Transkriptom von verschiedenen gut charakterisierten Mauskortika-Interneurons zu erforschen, und identifizierte ausgewählte Genkategorien, die für die Kodierung der zellulären Identität verantwortlich sind.

single-cell-rna-sequencing-fluorescently-labeled-mouse-neurons-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung fluoreszenzmarkierter Neuronen aus einem Mäusegehirn.

Isolierung fluoreszenzmarkierter Neuronen aus einem Gehirn von Mäusen

Hochwertige Gesamt-RNA wurde aus Zellkörpern von Maus-Spinalmark-Motorneuronen mittels Lasercapture-Mikrodissektion hergestellt, nachdem Rückenmarksabschnitte mit Azure B in 70% Ethanol gefärbt wurden. Ausreichende RNA (ca. 40-60 ng) wird aus 3.000-4.000 motorischen Neuronen zurückgewonnen, um eine nachgeschaltete RNA-Analyse durch RNA-seq und qRT-PCR zu ermöglichen.

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Wir berichten über eine auf Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) basierende Methode, um neurale Stammzellen (NSCs) und ihre Nachkommen aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mäusegehirns zu isolieren. Angewendet auf FUCCI-transgene Mäuse (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) ermöglicht es die Untersuchung des Zellzyklusverlaufs durch Live-Bildgebung.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

Hier wird eine Methode zur Sequenzierung einzelner Kerne, die aus dem Gyrus dentatus der Maus isoliert wurden, vorgestellt, die die meisten Neuronen durch Fluoreszenz-aktivierte Kerne (FAN)-Sortierung ausschließt. Dieser Ansatz generiert qualitativ hochwertige Expressionsprofile und erleichtert die Untersuchung der meisten anderen Zelltypen, die in der Nische vertreten sind, einschließlich seltener Populationen wie neuraler Stammzellen.

Fluoreszenzaktivierte Kerne negative Sortierung von Neuronen kombiniert mit Einzelkern-RNA-Sequenzierung zur Untersuchung der neurogenen Hippocampus-Nische

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Dieses Protokoll kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um Mikrogliazellzustände im Kleinhirn von frühen postnatalen Mäusegehirnen zu isolieren und zu charakterisieren. Es verwendet enzymatische Dissoziation, Percoll-Zentrifugation und Immunfärbung, um die Heterogenität der Mikroglia aufzudecken und das Verständnis ihrer Rolle bei der Kleinhirnentwicklung und -erkrankung zu verbessern.

Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

Erfahren Sie die DIVA-Seq-Methode zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung von Mausneuronen mit manueller Sortierung. Dieses Protokoll ermöglicht die präzise Isolierung fluorescenzmarkierter Neuronen aus definierten Hirnregionen für hochauflösende Genexpressionsanalysen.

Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq) (Video) | JoVE Journal

Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Weitere Videos entdecken