Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Diese Methode kann helfen, ein Haupthindernis im Bereich der Single-Neuron-Isolation und -Sequenzierung zu lösen. Wie das Sammeln einer bestimmten Population oder einer Subpopulation von fluoreszierend markierten Neuronen aus dem benutzerdefinierten Hirnbereich. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sicherstellt, dass das einzelne Neuron von Interesse erfasst wird, ohne Denreste zu kontaminieren.

Es ist auch relativ sanft, was für empfindliche Neuronentypen wichtig ist, die schnell sterben, wenn sie den Flüssigkeitsdrücken der konventionellen FACS-Sortierung ausgesetzt sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung gezogener Glasmikrokapillaren mit 10 bis 15 Mikron Austrittsdurchmesser mit einem Kapillarzieher. Verwenden Sie eine feine Schere, um die Spitze der Kapillare zu schneiden, um den gewünschten Plattendurchmesser zu erhalten.

Verwenden Sie dann Schlauchstecker, um einen 120 bis 150 Zentimeter langen flexiblen Silikonschlauch mit 0,8 Millimeter Innendurchmesser an einen 0,2-Mikron-PVDF-Membranspritzenfilter und ein Zwei-Wege-Schlauchventil zu befestigen. Bereiten Sie 500 Milliliter gekühlte künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit oder ACSF vor und sauerstoffhaltigen, indem Sie 5% Kohlendioxid-Ausbader Sauerstoff durch einen Airstone für 15 Minuten oder bis die Lösung vollständig abklarheiten. Bereiten Sie drei 150-Milliliter-Becher mit je 100 Milliliter ACSF vor.

Fügen Sie einen Cocktail von Aktivitätsblockern hinzu. Zu einem anderen, fügen Sie Streptococcus-Fraktion für Protease zu einer endgültigen Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Zum Endbecher, fügen Sie FBS zu einer Endkonzentration von 1% hinzu und sauerstoffhaltigen mit 5% Kohlendioxid-ausbalanciertem Sauerstoff durch einen Airstone.

Schließlich machen Sie drei langstämmige Pasteur Pipetten mit abnehmenden Austrittsdurchmessern, indem Sie sie über eine offene Flamme rollen. Sezieren Sie das Gehirn von einer eingeschläferten Maus, indem Sie den Schädel mit einer kleinen Schere öffnen und das frische Gehirn mit feinen Zangen extrahieren, ohne den Kortex zu beschädigen. Legen Sie das Gehirn in gekühlten und sauerstoffhaltigen ACSF und hinterlassen Sie einen Airstone, der während der gesamten Dauer des Schnitts an 5% Kohlendioxid-ausbalanciertem Sauerstoff gebunden ist.

Positionieren Sie das Gehirn auf dem Vibratomfutter und schneiden Sie koronale oder sagittale Abschnitte bei 300 Mikron Dicke. Sammeln Sie so viele Abschnitte wie nötig, um mindestens 10 bis 50 markierte Zellen zu erhalten. Legen Sie Scheiben auf einen baumwollmaschigen Scheibenhalter, der in einen Becher gelegt wird, damit sie in sauerstoffhaltigem ACSF gebadet werden.

Bewegen Sie die Scheiben in den Becher, der ACSF mit Aktivitätsblockern enthält, und blockieren Sie 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie mit einem Airstone Sauerstoff sprudeln. Bewegen Sie die Scheiben auf den Becher, der ACSF enthält, mit der Protease-Lösung, um eine leichte Verdauung bei Raumtemperatur durchzuführen. Waschen Sie nach der Verdauung die Protease aus, indem Sie die Scheiben bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten lang wieder in den Becher mit ACSF mit Aktivitätsblockerlösung bewegen.

Halten Sie sprudelnden Sauerstoff. Als nächstes bereiten Sie eine 100-Millimeter-Petrischale mit ACSF mit 1%FBS bei Raumtemperatur vor und bewegen Sie einzelne Abschnitte in die Scheibe für die Mikrodissektion. Verwenden Sie unter einem fluoreszierenden Sezieren Bereich ein Paar feiner Zangen, um Bereiche und Interessenschichten mit mindestens 10 bis 50 Zellen mikrosezieren zu können.

Mit einer Pasteur-Pipette bewegen Sie die mikrosezierten Teile in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das etwa 0,8 Milliliter 1%FBS in ACSF-Lösung enthält. Tittieren Sie das sezierte Gewebe im Mikrofugerohr bei Raumtemperatur. Führen Sie ca. 10 Schläge mit jeder der geflammten Pasteur Pipetten aus, beginnend mit der größten und endend mit dem kleinsten Austrittsdurchmesser.

Geben Sie die dissoziierten Zellen in eine 100-Millimeter-Petrischale mit sauerstoffhaltigem ACSF und warten Sie fünf bis sieben Minuten, bis sich die Zellen allmählich absetzen. Beobachten Sie das GFP- und RFP-Signal unter einem Seziermikroskop. Identifizieren Sie Trümmer, indem Sie die Morphologie unter Hellfeldbeleuchtung untersuchen.

Sobald ein Zellbereich mit wenig Schutt identifiziert wurde, verwenden Sie die Kapillare und befestigen Sie an Schläuchen, um Zellen zu pflücken, indem Sie das Ende des Schlauchventils mit der Zunge blockieren. Positionieren Sie dann die Kapillare in der Nähe der Zellen. Lösen Sie den Block auf der Kapillare und blockieren Sie schnell wieder, um die Zelle mit Kapillarwirkung zu erfassen.

Bewegen Sie die Kapillare auf eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem sauerstoffreichem ACSF und blasen Sie sanft in das Rohr, während Sie die Kapillarspitze unter Fluoreszenzoptik beobachten, um die Zellen in die Schale zu geben. Wiederholen Sie den Sammelvorgang, bis 100 bis 150 Zellen gesammelt werden, um sicherzustellen, dass Verunreinigungen wie Schmutz in der Optik für unterschiedliche Störwellen im hellen Feld minimal sind. Schließlich wählen Sie mit einer frischen Mikrokapillarpipetten jedes Mal eine einzelne Zelle aus und vertreiben Sie sie in nicht mehr als 0,5 Mikroliter in ein 0,2-Mikroliter-Mikrofuge-Rohr, das einen Mikroliter Probensammelpuffer mit Primern enthält.

Brechen Sie die Pipettenspitze im Mikrofugerohr, um sicherzustellen, dass die Zelle im Sammelpuffer verbleibt. Einfrieren der Zellen, indem Sie die Rohre auf Trockeneis setzen. In einem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius bis zur Verarbeitung zur RNA-Verstärkung aufbewahren.

GABAerge Neuronen wurden aus dem Cingulet Cortex des Mausgehirns isoliert. Die aus den manuell sortierten Neuronen verstärkten RNA-Verstärkungen lagen zwischen 200 und 4.000 Basenpaaren mit einer Spitzenverteilung von etwas über 500 Basenpaaren. Nach der Perlenreinigung wird die cDNA-Bibliothek durch eine zweite Reinigungsrunde mit Perlen zur Beseitigung von Fragmenten von weniger als 200 Basenpaaren und für den Spitzenwert bei etwa 350 Basenpaaren weiter eingeschränkt.

Die Sequenzierung zeigte 4,8 mal 10 bis 5. Median oder 6,9 mal 10 bis zum 5. durchschnittlich enden den zugeordneten Lesevorgängen pro Zelle. Nach der doppelten RNA-Entfernung mit UMIs hatte jede einzelne Zelle 1,0 mal 10 bis 5. Median oder 1,4 mal 10 bis zum 5. durchschnittlichen eindeutigen Lesewert pro Zelle. In jedem einzelnen externen RNA-Kontrollkonsortium wurde die RNA-Spitze als interne Kontrolle verwendet, um die absolute Anzahl der Moleküle zu berechnen, die der Probe hinzugefügt wurden.

Es gab eine lineare Beziehung der Eingabe zu beobachteten Zählungen mit einer Neigung von 0,92 und einem angepassten R-Quadrat von 0,94. Mit diesem Verfahren wurden durchschnittlich etwa 10.000 Gene pro einzelnem Neuron nachgewiesen, wobei mehr als 95 % der einzelzellen mehr als 6.000 Gene detektieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Molekularbiologen, das Transkriptom von verschiedenen gut charakterisierten Mauskortika-Interneurons zu erforschen, und identifizierte ausgewählte Genkategorien, die für die Kodierung der zellulären Identität verantwortlich sind.