Isolierung fluoreszenzmarkierter Neuronen aus einem Gehirn von Mäusen

Nehmen wir eine transgene Mausrinde, die fluoreszierende Protein-exprimierende Neuronen enthält.

Befestigen Sie es auf einem Probenhalter.

Montieren Sie den Halter auf der Vibratomus-Schale mit sauerstoffhaltigem aCSF, um die physiologischen Bedingungen des Gewebes zu erhalten.

Mit den eingestellten Parametern erhalten Sie koronale Schnitte.

Legen Sie die Scheiben in einen Netzhalter, der sauerstoffhaltiges aCSF und Aktivitätsblocker enthält, um sie zu stabilisieren.

Behandeln Sie die Scheiben mit Proteasen, um die extrazelluläre Matrix zu verdauen und die Zellen zu lockern.

Mit Liquor waschen, um die Proteasen zu entfernen.

Übertragen Sie die Scheiben auf eine Kulturplatte mit aCSF und Serum.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop werden Schnittbereiche mit fluoreszierenden Neuronen präpariert.

Übertragen Sie die präparierten Fragmente in ein Röhrchen, das Liquor und Serum enthält.

Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, um eine einzellige Suspension zu bilden. Übertragen Sie die Zellen auf eine Kulturplatte, die aCSF enthält.

Verwenden Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop eine Kapillarpipette, um fluoreszierende Neuronen zu sammeln.

Geben Sie diese Neuronen zur weiteren Analyse in eine Kulturplatte, die aCSF enthält.

Sezieren Sie das Gehirn einer eingeschläferten Maus, indem Sie den Schädel mit einer kleinen Schere öffnen und das frische Gehirn mit einer feinen Pinzette herausziehen, ohne die Rinde zu beschädigen. Legen Sie das Gehirn in gekühlten und sauerstoffhaltigen aCSF und lassen Sie während der gesamten Dauer des Schnitts einen Ausströmerstein mit 5 % Kohlendioxid-ausgeglichenem Sauerstoff haften.

Positionieren Sie das Gehirn auf dem Vibratom-Futter und schneiden Sie koronale oder sagittale Schnitte mit einer Dicke von 300 Mikrometern. Sammeln Sie so viele Abschnitte wie nötig, um mindestens 10 bis 50 markierte Zellen zu erhalten. Legen Sie die Scheiben auf einen Scheibenhalter aus Baumwollnetz, der in einem Becherglas platziert ist, so dass sie in sauerstoffreichem aCSF gebadet werden.

Schieben Sie die Scheiben in das Becherglas, das aCSF mit Aktivitätsblockern enthält, und blockieren Sie sie 15 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, während Sie Sauerstoff mit einem Ausströmerstein sprudeln lassen. Die Scheiben werden in das aCSF-Becherglas mit der Proteaselösung gegeben, um einen milden Aufschluss bei Raumtemperatur durchzuführen. Nach dem Aufschluss waschen Sie die Protease aus, indem Sie die Scheiben zurück in das Becherglas mit aCSF mit einer Aktivitätsblockerlösung für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur bewegen. Lassen Sie weiterhin Sauerstoff sprudeln.

Bereiten Sie anschließend eine 100-Millimeter-Petrischale, die aCSF mit 1 % FBS enthält, bei Raumtemperatur vor und bringen Sie einzelne Abschnitte zur Mikrodissektion in die Schale. Verwenden Sie bei einer Fluoreszenzdissektion eine feine Pinzette, um Bereiche und Schichten von Interesse mit mindestens 10 bis 50 Zellen zu mikropräparieren.

Bewegen Sie die mikropräparierten Stücke mit einer Pasteurpipette in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das etwa 0,8 Milliliter 1 % FBS in aCSF-Lösung enthält. Zerreiben Sie das präparierte Gewebe im Mikrofuge-Röhrchen bei Raumtemperatur.

Führen Sie mit jeder der geflammten Pasteurpipetten etwa 10 Hübe aus, beginnend mit dem größten und endend mit dem kleinsten Austrittsdurchmesser. Geben Sie die dissoziierten Zellen in eine 100-Milliliter-Petrischale, die sauerstoffhaltiges aCSF enthält, und warten Sie 5 bis 7 Minuten, bis sich die Zellen allmählich beruhigt haben.

Beobachten Sie das GFP- und RFP-Signal unter einem Präpariermikroskop. Identifizieren Sie Trümmer, indem Sie die Morphologie unter Hellfeldbeleuchtung untersuchen. Sobald ein Bereich mit Zellen mit wenig Schmutz identifiziert wurde, verwenden Sie die Kapillare und den angeschlossenen Schlauch, um Zellen zu entnehmen, indem Sie das Ende des Schlauchventils mit der Zunge blockieren. Positionieren Sie dann die Kapillare in der Nähe der Zellen. Lösen Sie den Block an der Kapillare und blockieren Sie ihn schnell wieder, um die Zelle mit Kapillarwirkung einzufangen.

Bewegen Sie die Kapillare in eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem sauerstoffhaltigem aCSF und blasen Sie vorsichtig in das Röhrchen, während Sie die Kapillarspitze unter Fluoreszenzoptik beobachten, um die Zellen in die Schale zu geben. Wiederholen Sie den Sammelvorgang, bis 100 bis 150 Zellen gesammelt sind, und stellen Sie sicher, dass Verunreinigungen wie Schmutz in Hellfeld-Differenzinterferenzkontrastoptiken minimal sind.