Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, mittels immunomagnetischer Isolierung O4-positive Oligodendrozyten von neugeborenen Mäusen für ihre In-vitro-Kulturanalyse auszuwählen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften im Zusammenhang mit der Erforschung von Krankheiten, die das Myelin und die Myelinisierung betreffen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Vorbereitung einer endgültigen Oligodendrozytenkultur mit einer Reinheit von mehr als 80 % in etwa Stundenstunden ermöglicht.

Beginnen Sie damit, die Haut entlang der Mittellinie der Kopfhaut einer Maus am fünften bis siebten Tag nach der Geburt mit einer kleinen Präparierschere zu schneiden. Ziehe den Hautlappen zurück, um den Schädel freizulegen, und schneide den Schädel vorsichtig entlang der Mittellinie von der Öffnung im Rücken bis zum vorderen Bereich. Schneiden Sie von der Öffnung im hinteren Teil des Schädels in Richtung jeder Augenhöhle entlang der Basis des Knochens und verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Kortikale sanft vom Mittelhirn weg zu ziehen.

Übertragen Sie dann die Kortikale in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale, die sieben Milliliter B-27 Neurobasal A Medium enthält. Wenn alle Gehirne gesammelt wurden, übertragen Sie die Kortikale in eine neue 60-Millimeter-Gewebekulturschale, die fünf Milliliter Dissoziationspuffer enthält, und verwenden Sie eine Skalpellklinge mit der Nummer 15, um die Kortexe in einen Würfelmillimeter zu würfeln. Inkubieren Sie die Gehirnteile 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen 5%CO2-Inkubator.

Fügen Sie dann einen Milliliter Rinderwachstumsserum hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Gewebeaufschlämmung mit einer 10-Milliliter-Serologiepipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und dissoziieren Sie das Hirngewebe vorsichtig sechs- bis achtmal durch Pipettieren. Lassen Sie die dissoziierten Gewebestücke zwei bis drei Minuten lang einwirken.

Übertragen Sie dann den Überstand in ein frisches Röhrchen. Geben Sie anschließend drei Milliliter Neurobasal A Medium, ergänzt mit Rinderwachstumsserum und DNase I, in das Gewebe und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um das Gewebe durch weiteres Pipettieren sanft zu dissoziieren. Sie sehen, die richtige Pipettierkraft ist entscheidend, um eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Zellen zu gewährleisten.

Wenn das Pipettieren zu schwierig ist, kann die Lebensfähigkeit gering sein. Wenn das Pipettieren hingegen zu schonend ist, kann die zelluläre Ausbeute gering sein. Lassen Sie die Gewebestücke weitere zwei bis drei Minuten ruhen.

Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen und fügen Sie dem Gewebe drei Milliliter frisches Neurobasal A Medium, ergänzt mit Rinderwachstumsserum und DNase I, hinzu. Dissoziieren Sie das Hirngewebe vorsichtig mit einer P-1000-Pipettenspitze, bis kein großes Gewebestück mehr übrig ist, und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zelllösung durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu filtrieren, und bringen Sie das endgültige Volumen der Einzelzellsuspension auf 30 Milliliter mit frischem Neurobasal A-Medium, ergänzt mit Rinderwachstumsserum und DNase I. Teilen Sie die Zellsuspension in zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen auf. und pelletieren die Nervenzellen durch Zentrifugation.

Entfernen Sie alle bis auf die letzten fünf bis 10 Mikroliter des trüben Überstands und geben Sie drei Milliliter Neurobasal A Medium, ergänzt mit Rinderwachstumsserum, zu den Zellen. Suspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig wieder und erhöhen Sie das endgültige Volumen auf 15 Milliliter mit frischem Neurobasal A Medium mit 10% Rinderwachstumsserum. Filtrieren Sie die Zelllösung durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen und erhöhen Sie das Endvolumen auf 30 Milliliter mit frischem Neurobasal A Medium mit 10% Rinderwachstumsserum.

Teilen Sie dann die gefilterte Zellsuspension für die Zentrifugation auf zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen auf und suspendieren Sie die Pellets erneut in 2,5 Millilitern eiskaltem magnetischem Zellsortierpuffer, bevor Sie die Zellen poolen. Zentrifugieren Sie die Zellen nach dem Zählen erneut und suspendieren Sie das Pellet in 90 Mikrolitern frischem magnetischem Zellsortierpuffer pro einmal 10 in die sieben Zellen.

Fügen Sie als nächstes 10 Mikroliter Anti-04-Kügelchen pro einmal 10 zu den sieben Zellen hinzu und mischen Sie die Zelllösung mit leichtem Schnippen. Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit einem sanften Streichen alle fünf Minuten geben Sie vorsichtig zwei Milliliter magnetischen Zellsortierpuffer pro einmal 10 zu den sieben Zellen für eine Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand durch vorsichtige Vakuumaspiration. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 500 Mikrolitern frischem magnetischem Zellsortierpuffer für jeweils 10 bis sieben Zellen und setzen Sie eine Sortiersäule für magnetische Kügelchen geeigneter Größe in den entsprechenden Magnetabscheider ein.

Legen Sie ein 40-Mikron-Sieb auf die Säule und spülen Sie das Sieb mit drei Millilitern magnetischem Zellsortierpuffer vor, wobei Sie den Puffer durch die Säule laufen lassen, ohne die Säule trocknen zu lassen. Geben Sie die Zellen in das Sieb, gefolgt von einer Milliliter-Wäsche mit Magnetic Cell Sorting Buffer. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern magnetischem Zellsortierpuffer pro Waschgang und einmal mit Oligodendrozytenproliferationsmedium.

Übertragen Sie dann die Säule in ein 15-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie mit dem Kolben sofort fünf Milliliter frisches Oligodendrozyten-Proliferationsmedium durch die Säule. Verdünnen Sie die Zellen nach der Zählung auf eine geeignete Beschichtungsdichte und ersetzen Sie das Laminin von vorbeschichteten Deckgläsern in einer 24-Well-Platte durch 100 Mikroliter Oligodendrozyten-Proliferationsmedium. Inkubieren Sie die Oligodendrozyten bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für nicht länger als 45 Minuten, um die Adhäsion der Oligodendrozyten an den Deckgläsern zu fördern.

Fluten Sie dann jede Vertiefung der 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern Oligodendrozyten-Proliferationsmedium für eine 24-stündige Inkubation. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Überstände durch Oligodendrozyten-Differenzierungsmedium und stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator, bis sie zur Fixierung bereit sind. 24 Stunden nach der Beschichtung erscheinen die Zellen unter Phasenkontrastmikroskopie bi- oder tripolar, ein charakteristisches Merkmal für proliferierende Oligodendrozyten im Frühstadium.

Die Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass 24 Stunden nach der Beschichtung die Mehrheit dieser Prä-Oligodendrozyten auch eine NG2- und O4-Markierung aufweist, während die Markierung mit GFAP- und Anti-01-Antikörpern viel seltener ist, was darauf hindeutet, dass die Mehrheit der Zellen in diesem Stadium Prä-Oligodendrozyten mit wenigen unreifen oder reifen Oligodendrozyten aufweist. Nach 72 Stunden scheint die Morphologie der Oligodendrozyten komplexer zu sein als nach 24 Stunden, und es gibt eine viel geringere Häufigkeit von Zellen, die positiv für den frühen Oligodendrozytenmarker NG2 sind. Außerdem zeigen die meisten Zellen eine O4-Markierung, und fast die Hälfte der Zellen färbte in diesem Stadium mit 01-Antikörpern, was darauf hindeutet, dass sich die Zellen zu einem reiferen Phänotyp differenzieren.

Bemerkenswert ist, dass das Vorhandensein von Astrozyten nach wie vor extrem gering ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass immunomagnetisch isolierte Oligodendrozyten im Laufe der Zeit in der Lage sind, sich in vitro in das dritte Reifungsstadium zu differenzieren, wobei andere Zelltypen, wie z. B. Astrozyten, nur sehr wenig kontaminiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Oligodendrozyten aus neugeborenen Mauswelpen mithilfe der immunomagnetischen Isolierung isoliert werden können.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.