Name: Eine Freeze-Tauungsmethode zur Vorbereitung von Chitosan-Poly(Vinylalkohol) Hydrogelen ohne Vernetzungsmittel und Diflunisal Release Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Freeze-Thawing-Methode zur Herstellung biokompatibler Chitosan-Poly(Vinylalkohol)-Hydrogel ohne chemische Vernetzungsmittel. Diese Technik ermöglicht kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen wie Diflunisal.

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Die Autoren sind C. Luzuriaga für die Unterstützung bei den Porosimetriemessungen dankbar. Die Autoren danken auch dem spanischen Ministerio de Economéa y Competitividad für die finanzielle Unterstützung (Projekt MAT2014-59116-C2-2-R) und PIUNA (Ref. 2018-15). Die Autoren möchten auch Dr. Amir Maldonado von Departamento de Fésica-UNISON für Unterstützung und hilfreiche Kommentare und Dr. SE Burruel-Ibarra von DIPM-UNISON für SEM-Bilder und Rubio Pharma y Asociados S. A. de C. V. für finanzielle Unterstützung danken. ME Martinez-Barbosa dankt den CONACyT (México)-Projekten Nr. 104931 und Nr. 256753 neben der finanziellen Unterstützung durch die Rote Temétea de Nanociencias y Nanotecnologa del programa de Redes Teméteticas del CONACyT. Und, auch Projekt USO316001081. MD Figueroa-Pizano möchte CONACyT für die finanzielle Unterstützung (Stipendium 373321) würdigen.

1. Herstellung von Chitosan-PVA-Hydrogelen
<ol><li>Bereiten Sie 2% (w/w) Chitosan und 10% (w/w) PVA-Lösungen vor. 0,2 g Chitosan in 10 ml 0,1 M CH3COOH-Lösung (zuvor gefiltert) bei Raumtemperatur auflösen und über Nacht kontinuierlich mechanisches Rühren aufrecht erhalten. 1 g PVA in 10 ml destilliertem Wasser auflösen und bei 80 °C 1 h rühren.</li>
	<li>Mischen Sie beide Lösungen 1:1 mit einem magnetischen Rührer, bis sie bei Raumtemperatur homogen sind, und gießen Sie die Mischungen auf Petri-Gerichte. Lassen Sie die Proben für 2 h bei atmosphärischem Druck zu entgasen.</li>
	<li>Die Hydrogele bei -4 °C, -20 °C oder -80 °C für 20 h und 4 Zyklen einfrieren (Proben CP4-4, CP4-20 bzw. CP4-80). Einfrieren eines anderen Hydrogels bei -80 °C für 20 h mit 5 oder 6 Gefrierzyklen (Proben CP5-80 und CP6-80). Nach dem dritten Gefrierzyklus die Hydrogele mit entionisiertem Wasser waschen. Am Ende die Hydrogele bei -46 °C für 48 h gefriertrocknen und zur weiteren Charakterisierung lagern (Methode angepasst ab2).</li>
</ol>2. FT-IR-Charakterisierung
<ol><li>Legen Sie ein kleines Stück (1 mm x 2 mm) Hydrogel in das FT-IR-Spektrometer im ATR-Modus. Nehmen Sie die FT-IR Spektren von 4000 bis 600 cm-1 (2 cm-1 Auflösung und durchschnitt 32 Scans).</li>
</ol>3. Schwellungs-Assays
<ol><li>Scheiben (13 mm Durchmesser und 10 mm Höhe) aus dem Hydrogel ausschneiden und wiegen. Inkubieren Sie die Scheiben in 50 ml entionisiertem Wasser mit Schütteln bei 25 °C. Wiederholen Sie dies dreimal.</li>
	<li>Alle 30 min entfernen Sie die Probe aus dem Medium, blotter, um den Überschuss an Wasser zu beseitigen, und wiegen. Berechnen Sie den Quellgrad mit der Gleichung 1 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq1.jpg"> und berechnen Sie den Gleichgewichtszustand der Schwellung, bei 24 h mit der Gleichung 2. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq2.jpg">) Wo <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq3.jpg"> ist das Gewicht des <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq4.jpg"> trockenen Hydrogels und ist das Gewicht des nassen Hydrogels. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq5.jpg">
</li>
</ol>4. Elektronische Mikroskopie
<ol><li>Bedecken Sie ein kleines Stück Hydrogel mit einer dünnen Goldschicht (30 s und 10 mA) in einem Sputterlacker.</li>
	<li>Legen Sie die Probe in ein Rasterelektronenmikroskop (SEM). Analysieren Sie die Proben unter Vakuum bei 20 kV und nehmen Sie die Bilder mit einer 500x und 1500x Vergrößerung auf.</li>
</ol>5. Porosimmetrie
<ol><li>Legen Sie Scheiben mit einem Durchmesser von etwa 0,26 g in das Penetrometer (ein solides Penetrometer mit einem Massenvolumen von 0,3660 ml und 5,7831 ml Stammvolumen). Analysieren Sie die Porosität und Porengröße durch Mercury Intrusion Porosimetrie (MIP).</li>
	<li>Führen Sie das Experiment im Hysteresemodus (Intrusion-Extrusion) durch. Messen Sie das gesamte Eindringvolumen (ml/g), die Gesamtporenfläche (m2/g), den Porendurchmesser (m), die Porosität (%), die Durchlässigkeit (mDarcy) und die Tortuosität. Wiederholen Sie dies zweimal.</li>
</ol>6. Laden und Loslassen von Drogen
<ol><li>Vor dem Beladen 4 L mit 15 mg/L Diflunisallösung vorbereiten und über Nacht umrühren. Bestätigen Sie die Konzentration der Lösung durch UV-Vis-Spektroskopie (Anfangskonzentration). In der Tat, anschwellen 400 mg gefriergetrocknete Proben von Hydrogel in 6 ml destilliertem Wasser für 24 h.</li>
	<li>Zum Beladen einen Kolben mit 50 ml Diflunisallösung füllen und bei 25 °C unter ständigem Rühren pflegen. Tauchen Sie jedes angeschwollene Hydrogel in den Kolben.<ol>
<li>Nehmen Sie Aliquots der verbleibenden Diflunisallösung (2 ml) zu verschiedenen Zeiten, um den Plateaubereich der Kurve zu bestimmen, z. B. 3, 6, 24, 27, 30 und 48 h. Nach 24 h ersetzen Sie die Lösung durch eine frische.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie die Absorption bei 252 nm jedes Aliquot und bestimmen Sie die Konzentration der diflunisalen Diflunisalin, die in der Lösung vorhanden ist, mit Hilfe einer Kalibrierkurve des Diflunisals. Berechnen Sie die im Hydrogel zurückgehaltene Diflunisalmenge bei 24 und 48 h als Differenz der Anfangs- und Endkonzentrationen unter Berücksichtigung des Gesamtvolumens (56 ml).<ol>
<li>Bestimmen Sie die Verkapselungseffizienz (EE) mit der Gleichung 3. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq6.jpg">
</li>
		<li>Die geladenen Hydrogele bei -80 °C einfrieren und bei -50 °C lyophilisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Wirkstofffreisetzung 300 mg gefriergetrocknete diflunisale hydrogele in 50 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 25 °C untertauchen. Halten Sie ständiges Rühren. Entnehmen Sie Aliquots von 2 ml zu verschiedenen Zeiten und ersetzen Sie durch frisches Medium, um ein konstantes Volumen zu halten.<ol>
<li>Bestimmen Sie die diflunisale spektrophotometrisch bei 252 nm freigesetzt, nach einer Kalibrierkurve.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ableiten Sie den vorherrschenden Wirkstofffreisetzungsmechanismus in den Hydrogelen, der die Wirkstofffreisetzungsdaten entsprechend den ersten 60% an das Korsmeyer-Peppas-Modell (Gleichung 4) anpasst, um die kinetischen (k) und die Diffusionskonstanten (n) zu erhalten. Die n Werte geben den Mechanismus der Arzneimittelfreisetzung24,25an. Dann sind n Werte nahe 0,5 mit der fickischen Diffusion verbunden, inzwischen Werte von 0,5-1,0 für den anomalen Transport, bei denen Diffusions- und Entspannungsketten beteiligt sind, und schließlich beziehen sich die Werte von 1,0 auf den Transport von Fall II. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq7.jpg"><ol>
<li>Um die Ergebnisse zu bestätigen, verwenden Sie die mathematischen Modelle Higuchi, First Order und Zero Order (Gleichungen 5 bis 7) und wählen Sie die bessere Passform aus.</li>
		<li>
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq8.jpg"> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq9.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59636/59636eq10.jpg"> wobei t die Freisetzungszeit, Mt die Menge des zu einem bestimmten Zeitpunkt gelieferten Arzneimittels und Mdie Gesamtmenge des am Ende des Prozesses gelieferten Arzneimittels darstellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Gefrier-Auftaumethode ist ein geeignetes Verfahren zur Herstellung biokompatibler Hydrogele, die sich auf biomedizinische, pharmazeutische oder kosmetische Anwendungen konzentrieren34,35,36. Der wichtigste Vorteil dieser Methode, im Vergleich zu anderen bekannten Methoden zur Herstellung von Hydrogelen, ist, dass die Verwendung von Vernetzungsmitteln vermieden wird, was eine Entzündungsreaktion oder nebenwirkungende Wirkunge...

In letzter Zeit haben Hydrogele großes Interesse im biomedizinischen Bereich geweckt, weil sie dreidimensionale Netzwerke mit hohem Wassergehalt sind und weich und flexibel sind, so dass sie natürliches Gewebe leicht imitieren können1. Auch lösen sie sich nicht in wässrigem Medium bei physiologischer Temperatur und pH-Wert auf, sondern stellen eine große Schwellung2dar. Hydrogele können als Gewebebaugerüste, Hygieneprodukte, Kontaktlinsen und Wundverbände fungieren; da sie Wirkstoffe und Medikamente fangen und freisetzen können, werden sie als Arzneimittelabgabesysteme verwendet3. Je nach Anwendung können Hydrogele aus natürlichen oder synthetischen Polymeren oder einer Kombination aus beidem hergestellt werden, um die besten Eigenschaften zu erhalten4.
Die Eigenschaften von Hydrogelen sind eine Folge vieler physikalischer und chemischer Faktoren. Auf der physikalischen Ebene hängen ihre Struktur und Morphologie von ihrer Porosität, Porengröße und Porenverteilungab 5. Auf chemischer und molekularer Ebene sind der Polymertyp, der hydrophile Gruppengehalt in der Polymerkette, der Vernetzungspunkttyp und die Vernetzungsdichte die Faktoren, die die Quellkapazität und die mechanischen Eigenschaften bestimmen6,7.
Je nach Art des Vernetzungsmittels, das zur Bildung des Netzes verwendet wird, werden die Hydrogele als chemische Hydrogele oder physikalische Hydrogele klassifiziert. Chemische Hydrogele werden durch kovalente Wechselwirkungen zwischen ihren Ketten verbunden, die durch UV- und Gammabestrahlung oder mit einem Vernetzungsmittel gebildet werden7,8. Chemische Hydrogele sind in der Regel stark und widerstandsfähig, aber im Allgemeinen ist das Vernetzungsmittel toxisch für die Zellen und seine Entfernung ist schwierig, so dass seine Anwendung begrenzt ist. Andererseits bilden sich physikalische Hydrogele durch die Verbindung der Polymerketten durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, wodurch die Verwendung von Vernetzungsmitteln4,9vermieden wird. Die wichtigsten nicht-kovalenten Wechselwirkungen im Netzwerk sind hydrophobe Wechselwirkungen, elektrostatische Kräfte, Komplementär- und Wasserstoffgrenzen7.
Poly(Vinylalkohol) (PVA, Abbildung 1a) ist ein synthetisches und wasserlösliches Polymer mit hervorragender mechanischer Leistungsfähigkeit und Biokompatibilität, das von vernetzungsmittelfreien Hydrogelen über das Gefrier-Auftauverfahren10,11. Dieses Polymer hat die Fähigkeit, konzentrierte Zonen von Wasserstoffbindungen zwischen -OH-Gruppen ihrer Ketten (kristalline Zonen) zu bilden, wenn sie12einfrieren. Diese kristallinen Zonen fungieren als Vernetzungspunkte im Netzwerk und werden durch zwei Ereignisse gefördert: das Nähern der Polymerketten, wenn sich das Kristallwasser ausdehnt, und die PVA-Konformationsänderungen von isotaktischer zu syndiotaktischer PVA während des Einfrierens13. Durch die Gefriertrocknung werden die Wasserkristalle sublimiert, so dass Hohlräume, die die Poren im Hydrogel14sind. Um Hydrogele mit besseren Eigenschaften zu erhalten, kann PVA einfach mit anderen Polymeren kombiniert werden.
In diesem Sinne stellt Chitosan eine Option dar, da es das einzige Biopolymer aus natürlichen Quellen mit positiven Ladungen ist. Es wird durch die Deacetylierung von Chitin erhalten und es besteht aus zufälligen Kombinationen von -1,4 verknüpften D-Glucosamin (deacetylated Unit) und N-Acetyl-D-Glucosamin (acetylierte Einheit)15,16 (Abbildung 1b). Chitosan ist durch menschliche Enzyme biologisch abbaubar und biokompatibel. Auch durch seine kationische Natur, kann es mit der negativen Ladung der Zelloberfläche interagieren, und diese Eigenschaft wurde mit seiner antimikrobiellen Aktivität17verbunden. Dieses Polymer ist einfach zu verarbeiten; ihre mechanischen Eigenschaften reichen jedoch nicht aus und einige Materialien wurden zu Komplexen mit besseren Eigenschaften hinzugefügt.
Unter Berücksichtigung der spezifischen Eigenschaften von Chitosan und PVA wurde die erfolgreiche Herstellung von Hydrogelen durch das Gefrierauftauverfahren2,18 erreicht, um den Einsatz toxischer Vernetzungsmittel zu vermeiden. In Chitosan-PVA-Hydrogelen werden auch die kristallinen Zonen von PVA gebildet, und Chitosanketten werden durchdrungen und bilden einfache Wasserstoffbindungen mit -NH2 Gruppen und -OH-Gruppen in PVA. Das endgültige Chitosan-PVA-Hydrogel ist mechanisch stabil, mit hohen Schwellungsraten und geringer Toxizität, und mit antibakterieller Wirkung18. Abhängig von den in der Zubereitung verwendeten Gefrierbedingungen (Temperatur, Zeit und Anzahl der Zyklen) können sich die endgültigen Eigenschaften jedoch ändern. Einige Studien berichten, dass die Erhöhung der Anzahl der Gefrierzyklen verringert den Schwellungsgrad und erhöht die Zugfestigkeit19,20. Zur Stärkung des Netzwerks wurden nach der gefriertauten Zubereitung21,22,23zusätzlich weitere Wirkstoffe wie Gamma- und UV-Strahlung sowie chemische Vernetzer eingesetzt. Hydrogele mit einem höheren Chitosan-Anteil haben ein poröseres Netzwerk und eine hohe Quellkapazität, aber weniger Festigkeit und thermische Stabilität. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Vorbereitungsbedingungen zu berücksichtigen, um geeignete Hydrogele für ihre Zielanwendung zu erhalten.
Der Zweck dieser Arbeit ist es, im Detail zu zeigen, wie sich die Gefrierbedingungen (Temperatur des Gefrierens und Anzahl der Zyklen) auf die endgültigen Eigenschaften von CS-PVA-Hydrogelen auswirken. FT-IR-Spektren, morphologische und porosity Eigenschaften und Schwellungsfähigkeit wurden bewertet, sowie Drogen be- und Freisetzungskapazität. In den Freisetzungsstudien wurde diflunisal (Abbildung 1c) aufgrund seiner Größe, die für die Hydrogelstruktur geeignet ist, als Modellmedikament verwendet.

<table><tbody><tr><td><stark>Materialien: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chitosan mittleres Molekulargewicht</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448877</td><td>Mw, bestimmt durch Kapillarviskosimetrie (637.000 Da) und Deacetylierungsgrad von 70 %</td></tr><tr><td>Diflunisal (2'-4'-difluor-4-hydroxy-3-biphenylcarbonsäure)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1005706</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Mw 89.000-98.000, 99+% hydrolysiert</td></tr><tr><td><stark>Ausrüstung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cressington Sputter Coater 108 auto</td><td>TED PELLA INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryodos Lyophilizer</td><td>Telstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhren</td><td>Thermo Fisher Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FT-IR-Spektroskopie</td><td>Nicolet iS50</td><td>im ATR-Modus</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisator</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromeritics Autopore IV 9500</td><td>Micromeritics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Pemtron SS-300LV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-sichtbares Spektralphotometer</td><td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine freeze-tauungsmethode zur vorbereitung von chitosan-poly(vinylalkohol) hydrogelen ohne vernetzungsmittel und diflunisal release studies

A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies

Chitosan-Poly(Vinylalkohol)-Hydrogele können nach dem Gefrier-Auftauverfahren ohne Verwendung toxischer Vernetzungsmittel hergestellt werden. Die Anwendung dieser Systeme ist begrenzt durch ihre Eigenschaften (z. B. Porosität, Flexibilität, Quellkapazität, Lade- und Freisetzungskapazität von Arzneimitteln), die von den Gefrierbedingungen sowie der Art und dem Verhältnis von Polymeren abhängen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Hydrogele aus Chitosan und Poly (Vinylalkohol) bei 50/50 w/w % polymerer Zusammensetzung zubereitet werden und die Gefriertemperatur (-4 °C, -20 °C, -80 °C) und Gefrierzyklen (4, 5, 6 Gefrierzyklen) variieren. ES wurden FT-IR-Spektren, SEM-Mikrographen und Porosimetriedaten von Hydrogelen gewonnen. Auch die Quellkapazität und die Belastung von Medikamenten und die Freisetzung von Diflunisal wurden bewertet. Die Ergebnisse von SEM-Mikrographen und Porosimetrie zeigen, dass die Porengröße abnimmt, während die Porosität bei niedrigeren Temperaturen zunimmt. Der Quellprozentsatz war bei der geringen Gefriertemperatur höher. Die Freisetzung von Diflunisal aus den Hydrogelen wurde untersucht. Alle Netzwerke halten die Wirkstofffreisetzung für 30 h aufrecht und es wurde beobachtet, dass ein einfacher Diffusionsmechanismus die diflunisale Freisetzung nach Korsmeyer-Peppas- und Higuchi-Modellen reguliert.

Hydrogele-Präparation Chitosan-PVA-Hydrogele wurden bei -4 °C, -20 °C und -80 °C mit 4 Gefrierzyklen und bei -80 °C mit 5 und 6 Gefrierzyklen nach der zuvor gemeldeten Gefrier-Auftaumethode2gewonnen. Alle Hydrogele waren homogen, halbtransparent, flexibel und manipulationsbeständig.
FT-IR-Charakterisierung Die FT-IR-Spektren sind in Abbildung 2<...

Die Gefrier-Auftaumethode wird verwendet, um Chitosan-Poly(Vinylalkohol) Hydrogele ohne Vernetzungsmittel herzustellen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Gefrierbedingungen (Temperatur, Anzahl der Zyklen) und das Polymerverhältnis zu berücksichtigen, die die Eigenschaften und Anwendungen der erhaltenen Hydrogele beeinflussen können.

Eine Freeze-Tauungsmethode zur Vorbereitung von Chitosan-Poly(Vinylalkohol) Hydrogelen ohne Vernetzungsmittel und Diflunisal Release Studies

Chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogels can be produced by the freeze-thawing method without using toxic crosslinking agents. The applications of these ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da unsere Gefriermethode ein geeignetes Verfahren zur Herstellung biokompatibler Hydrogele für den Einsatz in biomedizinischen, pharmazeutischen oder kosmetischen Anwendungen ist. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass sie keine chemischen Vernetzungsmittel verwendet, die einen Geburtsfehler verursachen können. Auch die Gefrierbedingung, die bei dieser Methode verwendet wird, steuert die endgültige Eigenschaft von Hydrogelen wie Grad.Diese Methode kann auf Hydrogele mit anderen Anwendungen angewendet werden. Dies wird zur Behandlung der Wasserverschmutzung verwendet. In der Tat könnte es verwendet werden, um Polymerperlen zu produzieren, die als Wasserbehälter für eine neue Kultur verwendet werden.Es ist wichtig, die von ihm misstpolymere Lösung vollständig zu homogenisieren. Andernfalls weisen die Hydrogele Knackpunkte auf. Außerdem müssen Sie mit den Gefrierzeiten in jedem Zyklus vorsichtig sein.Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie 0,2 Gramm Chitosan und 10 Milliliter 0,1 Molessigsäure bei Raumtemperatur und halten Sie kontinuierlichemechanische Rührung über Nacht, um eine 2%Chitosan-Lösung vorzubereiten. Am nächsten Tag ein Gramm PVA

a-freeze-thawing-method-to-prepare-chitosan-poly-vinyl-alcohol

Research

Forschung

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Bioengineering

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Erfahren Sie die Freeze-Thawing-Methode zur Herstellung biokompatibler Chitosan-Poly(Vinylalkohol)-Hydrogel ohne chemische Vernetzungsmittel. Diese Technik ermöglicht kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen wie Diflunisal.

Eine Freeze-Tauungsmethode zur Vorbereitung von Chitosan-Poly(Vinylalkohol) Hydrogelen ohne Vernetzungsmittel und Diflunisal Release Studies (Video) | JoVE Journal

Eine Freeze-Tauungsmethode zur Vorbereitung von Chitosan-Poly(Vinylalkohol) Hydrogelen ohne Vernetzungsmittel und Diflunisal Release Studies

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