Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, rekombinant abgeleitete Elastin-ähnliche Proteine zu exprimieren und zu reinigen, um sie als abstimmbares Hydrogel für die 3D-Zellverkapselung zu verwenden. Darüber hinaus stellt dieses Protokoll die Methodik für die nachgeschaltete Fluoreszenzmarkierung in der konfokalen Mikroskopie von verkapselten Zellen vor. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biomaterialien, regenerative Medizin und Zellbiologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis der Rolle von Zell-extrazellulären Matrix-Wechselwirkungen in 3D.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine reproduzierbare, abstimmbare und modulare Materialplattform bietet, die für die Untersuchung mehrerer Zelltypen geeignet ist. Insgesamt kann die Implementierung dieser Technik unser Verständnis der kritischen zellulären EZM-Signalparameter verbessern, die den Erfolg zukünftiger zellbasierter regenerativer Therapien bestimmen könnten. Streichen Sie eine Ampicillin- und Chloramphenicol-Agarplatte mit einem vorgefertigten Bakterienstamm, der einen Vektor enthält, der für das interessierende ELP kodiert.

Inkubieren Sie die gestreifte Platte dann über Nacht kopfüber bei 37 Grad Celsius, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen. Am nächsten Tag eine einzelne Kolonie vom Teller nehmen und die vorgewärmte Starterkultur beimpfen. Inkubieren Sie die Kultur in einem Shaker bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden.

Nach der Inkubationszeit werden mit einer serologischen Pipette 20 Milliliter der Starterkultur in jeden Expressionskolben überführt. Lassen Sie den Ausdruckskolben eine Stunde lang schütteln. Nach einer Stunde wird die optische Dichte bei 600 Nanometern eines Aliquots aus dem Expressionskolben gemessen.

Sobald der Messwert 0,6 erreicht, reduzieren Sie die Temperatur des Schüttlers auf 32 Grad Celsius. Wenn der Messwert 0,8 erreicht, wird ein Milliliter eines molaren steril filtrierten IPTG zugegeben, um die ELP-Expression im Expressionskolben zu induzieren. Lassen Sie die Kultur sieben Stunden lang zum Ausdruck kommen.

Nach sieben Stunden zentrifugieren Sie das Expressionsmedium bei 12.000 x g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Bodenzentrifuge. Nach der Zentrifugation das Küvettenpellet mit einem Spatel aus dem Zentrifugenbehälter auffangen und in einen vorgewogenen Ziploc-Beutel geben. Als nächstes lösen Sie das Zellpellet in steril gefiltertem TEN-Puffer auf.

Massieren Sie das Zellpellet, um eine homogene Lösung zu bilden. Frieren Sie den Ziploc-Beutel mit resuspendiertem Zellpellet in einem Sekundärbehälter bei 80 Grad Celsius ein. Zu dem aufgetauten Zellpellet fügen Sie etwa 30 bis 40 Milligramm Desoxyribonuklease und einen Milliliter 100 Millimolar PMSF pro 100 Milliliter Zelllysat hinzu.

Inkubieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Shaker. Nach dem dritten Gefrier-Auftau-Zyklus zentrifugieren Sie die Proben eine Stunde lang bei mindestens 15.000 x g bei vier Grad Celsius. Gießen Sie nach der Zentrifugation den Überstand aus dem Zentrifugenbehälter ab und geben Sie die Lösung in einen neuen Zentrifugenbehälter.

Zu je 100 Millilitern Überstand werden 5,84 g Natriumchlorid in drei Teilen zu einer endgültigen molaren Konzentration hinzugefügt. Inkubieren Sie die Suspension in einem Schüttelbrutator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben eine Stunde lang bei mindestens 15.000 x g bei 37 Grad Celsius.

Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand aus dem Zentrifugenbehälter und massen Sie das Pellet. Fügen Sie anschließend 10 Milliliter autoklaviertes Reinstwasser pro Gramm Pellet hinzu, das nach der Zentrifugation erhalten wurde. Um sicherzustellen, dass sich das Protein vollständig auflöst, verwenden Sie einen Metallspatel, um das Pellet zu zerdrücken und wieder zu suspendieren.

Inkubieren Sie das resuspendierte Pellet über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler. Wiederholen Sie die Kalt- und Heißzentrifugationsschritte für insgesamt drei Zyklen, um das ELP weiter zu reinigen. Anschließend wird der Restüberstand in einer 3,5-Kilodalton-Dialysemembran drei Tage lang gegen vier Liter vorgekühltes Reinstwasser bei vier Grad Celsius dialisiert, um die Proteinlösung zu entsalzen.

Die enddialysierte Lösung wird in einer vorgekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird bei 80 Grad Celsius in einem vorgewogenen konischen Röhrchen eingefroren. Schließlich wird die gefrorene Lösung drei Tage lang lyophilisiert und dann das endgültige lyophilisierte Produkt gewogen, um die Proteinausbeute zu bestimmen.

Mit Hilfe eines Biopsiestanzers werden Löcher in eine 0,5 Millimeter dicke Silikonfolie gebohrt. Schneide dann um jedes Loch ein Quadrat aus. Als nächstes entfernst du mit einer Pinzette die Plastikfolie auf jeder Seite der einzelnen Formen.

Nachdem Sie die Plastikfolie entfernt haben, positionieren Sie mit der Pinzette die gleiche Anzahl an blanken Silikonformen und Glasabdeckfolien in abwechselnden Reihen auf dem Deckel einer 48-Well-Platte für die anschließende Plasmaverklebung. Nachdem alle Zellkulturmaterialien hergestellt wurden, kann mit der Vorbereitung des interessierenden Zelltyps für die nachgeschaltete Hydrogel-Verkapselung begonnen werden. Nach der Dissoziation der Zellen in eine Einzelzellsuspension aliquotiert die gewünschte Anzahl von Zellen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei etwa 200 x g für drei Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und das Pellet auf Eis lagern. Resuspendieren Sie das Zellpellet in der ELP-Stammlösung auf 80 % des Endvolumens.

Mischen Sie dann die Lösung mit einer Pipette zu einer homogenen Zellsuspension in ELP. Für die verbleibenden 20 % des Endvolumens geben Sie THPC-Stammlösung in die ELP-Suspension der Zellen. Pipettieren Sie mehrmals, um die Bildung einer homogenen Mischung zu gewährleisten und gleichzeitig die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.

Pipettieren Sie anschließend in kreisenden Bewegungen die ELP THPC-Mischung der Zelle in jede Form in einer 24-Well-Platte. Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 15 Minuten werden die Proben weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Sobald die Inkubation beendet ist, geben Sie vorsichtig 750 Mikroliter warmes Zellkulturmedium in eine 24-Well-Platte in jede Vertiefung. Lassen Sie das Hydrogel für die gewünschte Kulturdauer bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie zuerst das Medium aus jeder Vertiefung an.

Waschen Sie dann die Vertiefungen mit einem Milliliter warmem DPBS. Geben Sie nach Abschluss des Waschvorgangs 750 Mikroliter Fixierlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie dann die 24-Well-Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation aspirieren Sie die Fixierlösung aus jeder der Vertiefungen und entsorgen Sie das Fixiermittel in einem Behälter für Sondermüll. Geben Sie anschließend einen Milliliter DPBS in die Probe und entsorgen Sie das DPBS sofort in einem Behälter für gefährliche Abfälle. Als nächstes fügen Sie 750 Mikroliter Permeabilisierungslösung hinzu, um die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf der Wippe bei 15 Umdrehungen pro Minute zu permeabilisieren.

Nach einer Stunde aspirieren Sie die Permeabilisierungslösung und geben Sie 750 Mikroliter Blockierungslösung in die Probe. Lassen Sie die Probe drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf der Wippe. Verdünnen Sie dann die gewünschten Primärantikörper mit der Antikörperverdünnungslösung.

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter der Antikörperlösung in jede Probe. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung und waschen die Proben dann dreimal eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 15 Umdrehungen pro Minute mit PBST.

Als nächstes verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper in fünf Milligramm pro Milliliter DAPI-Stammlösung, um eine Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Geben Sie dann 500 Mikroliter der Lösung zu jeder Probe. Als nächstes verwenden Sie Aluminiumfolie, um die 24-Well-Platte abzudecken und die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren.

Am nächsten Tag wird die Sekundärantikörperlösung aspiriert und die Proben dreimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einer Wippe mit PBST gewaschen. Positionieren Sie als Nächstes einen Tropfen des festsitzenden Einbettmediums auf der Oberfläche eines Objektträgers und platzieren Sie die Probe auf dem Einbettmedium. Verwenden Sie abschließend Nagellack, um die Proben auf dem Glasdeckel zu versiegeln, um eine Kontamination oder Bewegung der Probe zu verhindern.

Hier wird die Expression des Zielproteins mit dem ELP in voller Länge unter kontrollierten Bedingungen durch das Vorhandensein von Banden bei 37 Kilodalton sowohl in der SDS-PAGE- als auch in der Western-Blot-Analyse validiert. Unter unkontrollierten Bedingungen sind jedoch auch mehrere Banden mit niedrigem Molekulargewicht mittels Western Blot sichtbar. Die unteren Molekulargewichtsbanden entsprechen Proteinen mit weniger als vier Elastin-ähnlichen Domänenwiederholungen, was darauf hindeutet, dass das Protein während der Expression nicht vollständig translatiert wird.

Dieses Ergebnis tritt häufig auf, wenn die Expression über 32 Grad Celsius durchgeführt wird. Um die Konzentration des zelladhäsiven Liganden zu variieren und gleichzeitig die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels konstant zu halten, wird das Verhältnis der ELP-Variante, die den Fibronektin-abgeleiteten Zellklebstoff enthält, und der nicht-zellgebundenen Adhäsivsequenzen abgestimmt. Darüber hinaus sind murine neurale Vorläuferzellen auch über einen Zeitraum von sieben Tagen lebensfähig, wenn sie in einem 3%igen ELP-Hydrogel verkapselt sind.

Die lebenden Zellen sind aufgrund der Calcein-AM-Färbung grün gekennzeichnet, während das rote Ethidium-Homodimer bevorzugt von den toten Zellen aufgenommen wird. Um den Stammzellphänotyp von neuralen Vorläuferzellen zu validieren, wird die Expression von kanonischen Markern wie Sox2 und Nestin auch durch Immunfärbung sichtbar gemacht, wenn die Zellen in den 3D-ELP-Hydrogelen eingekapselt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Elastin-ähnliches Protein für die nachgelagerte Verkapselung verschiedener Zelltypen exprimiert und reinigt, und darüber hinaus die Rolle der 3D-Mikroumgebung bei der Modulation des zellulären Phänotyps untersuchen.