Name: Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Elastin-Like-Protein-Hydrogelen für die 3D-Zellkapselung und Immunfärbung. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zu Zell-ECM-Interaktionen in der regenerativen Medizin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken T. Palmer und H. Babu (Stanford Neurochirurgie) für die Bereitstellung von murinen NPCs. Vektorgrafiken in Abbildung 4 wurde eingesetzt und angepasst von Servier Medical Art unter Creative Commons Attribution 3.0 Unported Lizenz (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Teil dieser Arbeit wurde an der Stanford Nano geteilt Einrichtungen (SNF), unterstützt von der National Science Foundation unter Award ECCS-1542152 durchgeführt. N.A.S erkennt Unterstützung aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. würdigt Unterstützung durch ein NIH NRSA Pre Promotionsstipendium (F31 EB020502) und Siebel Scholars Program. S.C.H. räumt Unterstützung von den National Institutes of Health (U19-AI116484 und R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006) und am California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Diese Forschung finanziell unterstützt von der Allianz für Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), die von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und menschlichen Entwicklung (NICHD), National Institute of unterstützt wird Neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) von den National Institutes of Health unter Nummer P2CHD086843 Award. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die Ansichten von den National Institutes of Health.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+%283D%29+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expression+of+differentiated+functions+in+hepatocytes+cultured+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+opens+new+dimensions+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays.</a> Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).</li>
<li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Madl, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+neural+progenitor+cell+stemness+in+3D+hydrogels+requires+matrix+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling.</a> Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+Regulates+Fate+Decisions+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells.</a> PLoS ONE. 7 (5), e37178(2012).</li>
<li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+Role+of+Matrix+Stiffness+in+3D+Cell+Migration+and+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling.</a> Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).</li>
<li>Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+osteogenic+and+myogenic+differentiation+of+MSCs%3A+interplay+of+stiffness+and+adhesive+ligand+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).</li>
<li>Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+three-dimensional+engineered+protein+hydrogels+for+tailored+control+of+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth.</a> Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).</li>
<li>Kilian, K. A., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+Stem+Cell+Fate+by+Controlling+the+Affinity+and+Density+of+Ligand-Receptor+Interactions+at+the+Biomaterials+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Materials+through+Modular+Protein+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering.</a> Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+characterization+of+elastin-like+polypeptides+%28ELPs%29+with+variable+guest+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues.</a> Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).</li>
<li>McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma991119z">High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels.</a> Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).</li>
<li>McMillan, R. A., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma9921091">Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor.</a> Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).</li>
<li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrakis%28hydroxymethyl%29+Phosphonium+Chloride+as+a+Covalent+Cross-Linking+Agent+for+Cell+Encapsulation+within+Protein-Based+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).</li>
<li>Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+RGD+ligand+density+and+L1CAM-mediated+Schwann+cell+interactions+synergistically+enhance+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth.</a> Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).</li>
<li>Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li>
<li>Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine-Selective+Functionalization+for+Bio-Orthogonal+Cross-Linking+of+Engineered+Protein+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).</li>
<li>Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+protein-hyaluronic+acid+%28ELP-HA%29+hydrogels+with+decoupled+mechanical+and+biochemical+cues+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration.</a> Biomaterials. , 132-140 (2017).</li>
<li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Orthogonally+Crosslinked%2C+Engineered+Protein+Hydrogels+with+Tunable+Mechanics+and+Biochemistry+for+Cell+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation.</a> Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).</li>
<li>Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+synthesis+of+elastin-like+polypeptide+hydrogels+with+grafted+VEGF-mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides.</a> Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).</li>
<li>Straley, K. S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2009/sm/b808504h#!divAbstract">Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering.</a> Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).</li>
<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10508629">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
<li>Graumann, K., Premstaller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+recombinant+therapeutic+proteins+in+microbial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems.</a> Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).</li>
<li>Tashiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthetic+Peptide+Containing+the+IKVAV+Sequence+from+the+A+Chain+of+Laminin+Mediates+Cell+Attachment%2C+Migration%2C+and+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Rekombinante Proteinexpression und Reinigung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Biomaterialien mit hoher Reproduzierbarkeit zu synthetisieren. Aufgrund weitgehend das Aufkommen der kommerzialisierten molekularen Klonen, können benutzerdefinierte rekombinante Plasmide von mehreren Lieferanten gekauft werden die reduziert die Zeit zum Arbeiten mit Materialien wie ELPs. In ähnlicher Weise können Plasmide direkt aus dem ursprünglichen Labor angefordert werden, wenn das ursprüngliche Werk durch einen Bundesvertrag unterstützt...

Im vergangenen Jahrhundert entwickelte zweidimensionale (2D) Gewebekultur zu einer integralen Toolset für die grundlegende Zelle Biologie in-vitro-Untersuchung. Darüber hinaus haben die relativ kostengünstige und einfache Protokolle für 2D Zellkultur zu ihrem Erlass in vielen biologischen und medizinischen Disziplinen geführt. Jedoch hat Forschung gezeigt, dass traditionelle 2D Plattformen zu Ergebnissen führen können, dass deutlich von diesen gesammelten in Vivoabweichen, wodurch wertvolle Zeit und Mittel für klinisch orientierte Forschung1,2verschwendet, 3. Wir und andere stellen die Hypothese auf, dass diese Diskrepanz zugeschrieben werden kann, auf den Mangel an einheimischen biochemischen und biophysikalischen Hinweise bereitgestellt, um die Zellen kultiviert auf 2D Oberflächen, die für optimale Vermehrung und Reifung der verschiedenen Zelltypen erforderlich sein können.
Um diese Einschränkungen und Hilfe Brücke die Lücke zwischen 2D anzugehen haben in Vitro und in Vivo Studien, Forscher entwickelten dreidimensionalen (3D) Hydrogel Plattformen für Zelle-Kapselung1,4,5 ,6. Hydrogele sind ideale Materialien zu rekapitulieren die endogenen Mikroumgebung von der extrazellulären Matrix (ECM) in Vivo aufgrund ihrer Gewebe-ähnliche mechanische Eigenschaften und Wasser geschwollen Struktur, schnellen Transport von Nährstoffen und Signalisierung Faktoren7,8. Darüber hinaus können 3D Hydrogele sollen unabhängige Kontrolle der mechanischen und biochemischen Eigenschaften des Gerüstes zu haben. Matrix Mechanik9,10,11,12 und Zelle-Klebstoff Liganden13,14,15 sind bekannte Zelle beeinflussen Verhalten in Vitro und in-vivo. So bieten 3D Hydrogele mit einstellbaren Eigenschaften eine Plattform, um kausale Zusammenhänge zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung zu studieren. Kriterien für eine ideale 3D hydrogelmatrix sind einfache, nicht-zytotoxische Zelle-Kapselung sowie unabhängige Einstellbarkeit der physiologisch relevanten mechanischen Eigenschaften und Mimik native Zelle-Klebstoff-Motive.
Beide synthetischen (zB., Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Poly (glykolische Säure)) und natürlich gewonnen (zB., Alginat, Kollagen, Matrigel) Hydrogele haben Vorteile gegenüber 2D in-vitro- Kultur-Plattformen; Sie haben jedoch auch erhebliche Mängel, die ihre Anwendbarkeit zu begrenzen. Erstens viele synthetische und natürlich gewonnenen Plattformen erfordern harte Vernetzung Bedingungen, die für Säugerzellen potenziell giftig sein können, führt zu verringerte Zelle Lebensfähigkeit7. Darüber hinaus viele synthetische Plattformen fehlt native Bioaktivität und müssen durch chemische Nebenreaktionen funktionalisiert werden die erhöhten Kosten und Komplexität16hinzufügen können. Schließlich, während natürlich gewonnenen Materialien in der Regel innere bioaktive Domänen enthalten, sie sind oft durch hohe Variabilität von Charge zu Charge geplagt und beschränken sich oft auf Bildung relativ schwachen Gele7,17.
Rekombinantes Protein-Engineering präsentiert eine einzigartige Toolset für Materialien Design durch explizite Kontrolle über Proteinreihenfolge und, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der endgültige Hydrogel Gerüst18. Darüber hinaus können durch die Nutzung der bekannten biologischen Maschinen von Escherichia coli (E. Coli), Proteine zu äußern, Materialien kostengünstig und konsequent mit begrenzten inter - und Intra-Batch Variabilität produziert werden. Das Elastin-wie Protein (ELP) hier vorgestellten hat drei technische Bereiche: (1) ein T7 und His6 Tag, das ermöglicht eine Kennzeichnung über Gewebekulturen Antikörper markiert, (2) ein "Elastin-Like"-Region, das verleiht elastische mechanische Eigenschaften und chemische ermöglicht Vernetzung, und (3) eine "Bio-aktiv"-Region, die für Zelle-Klebstoff Motive kodiert.
Elastin-ähnliche Region basiert auf der kanonischen (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 Elastin Sequenz, wo vier 'Xaa' Aminosäure-Websites sind Isoleucin (Ile), aber könnte so konzipiert, dass jede Aminosäure außer Prolin. Diese Sequenz stiftet rekombinante ELPs mit untere kritische Temperatur (LCST) lösungsverhalten, die für einfache Reinigung nach dem Ausdruck über thermische Radfahren19,20ausgenutzt werden können. Diese LCST Eigenschaft kann bei unterschiedlichen Temperaturen durch Ändern der Gast 'Xaa' Rückstand21,22, thermisch Aggregat abgestimmt werden.
Hier wurde mit Amin-präsentierenden Lysin (Lys) Aminosäure, die "Xaa" Position auf einem der fünf Elastin-artigen Wiederholungen ersetzt, die Hydrogel Vernetzung genutzt wird. Unsere bisherige Arbeit hat nicht zytotoxisch und robuste Vernetzung durch Reaktion mit der Amin-reaktive Vernetzer Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC)23gezeigt. Durch unterschiedliche allgemeine Inhalte und Vernetzer Proteinkonzentration können wir Hydrogele zu produzieren, die optimiert werden können, um eine physiologisch relevanten Steifigkeit Palette (~0.5-50 kPa)9,23,24zu überspannen. Neben der Optimierung der mechanischer Eigenschaften, Zelle Adhäsion innerhalb der Hydrogel-Ergebnisse aus der Integration der kanonischen Zelle-Klebstoff-Domänen innerhalb das Rückgrat des ELP-Proteins. Beispielsweise ermöglicht die Einbeziehung der erweiterten Fibronektin abgeleitet "RGDS" Aminosäure-Sequenz Zelladhäsion und Konformationsänderungen Flexibilität, während das Rührei, unverbindliche "RDGS" Variante schränkt Zellmatrix Haftung24. Durch die Modulation des Verhältnis der Zelle-Klebstoff nichtklebenden Proteine sowie die Gesamt-Protein-Konzentration, können wir effektiv Hydrogele zu produzieren, die eine Vielzahl von Liganden-Konzentration zu überspannen. Resultantly, entwickelten wir eine Hydrogel-Plattform mit entkoppelten biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften, die unabhängig für optimale 3D Culture von verschiedenen Zelltypen abgestimmt werden können.
Neben Matrix Steifigkeit und Klebstoff Liganden Einstellbarkeit bieten rekombinante Hydrogele die Möglichkeit, bestimmte Materialabbau designprofile, die notwendig ist für die Zelle verbreiten, Proliferation und Migration innerhalb einer 3D Rahmen4 , 9. dieser Abbau wird durch Zelle Sekretion von Proteasen, die gezielt die erweiterte "RGDS"9 oder Elastin-Sequenz25gewährt. ELP Hydrogele haben auch gezeigt, dass die nachfolgenden biochemischen Assays zu unterstützen, die notwendig sind für das Studium Zellviabilität und Immunocytochemistry, sowie DNA/RNA/Proteingewinnung für quantitative Reverse-Funktion Transkription-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western blot9. ELP-Varianten wurden auch in einer Reihe von in Vivo Modellen verwendet und sind dafür bekannt, die vom Immunsystem26gut vertragen werden.
Zusammengenommen, ELP als eine wesentliche Plattform für Zelle-Kapselung Studien verfügt über eine Vielzahl von Vorteilen im Vergleich zu synthetischen oder natürlich gewonnenen Material Plattformen, die oft nicht über den gleichen Grad an biochemischen und biophysikalischen Einstellbarkeit und Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ELP einfach und nicht zytotoxischen Einsatz mit einer Vielzahl von Zelltypen (zB., Küken Dorsal Root Ganglien14,24, murine neuronalen Vorläuferzellen Zellen9, menschlichen mesenchymalen Stammzellen27, bovine neonatale Chondrozyten28, Human endothelial Zellen29,30) ermöglicht eine mehr physiologisch relevanten Modell des endogenen 3D ECM im Vergleich zu 2D Zellkultur. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für den Ausdruck von rekombinant abgeleitet, ELPs für den Einsatz als Durchstimmbare Hydrogel Plattform für 3D Handy Kapselung. Weiter stellen wir die Methodik für die Downstream-fluoreszierende Kennzeichnung und konfokalen Mikroskopie von verkapselten Zellen.

<table><tbody><tr><td>Elastin-like Protein Expression and Purification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petrischalen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>RICCA Chemical</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-18-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Kompetente Zellen</td><td>Invitrogen</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz, Dihydrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bouillon</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195381</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatz-Filtereinheit (0,22 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels0,22</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&mu; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm dicke Silikonplatte</td><td>Elektronenmikroskopie Science</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatten&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Einmal-Biopsie-Stanze (2 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Biopsie-Stanze (4 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Biopsie-Stanze (5 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 1 12 mm Glas-Deckgläser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(hydroxymethyl)phosphoniumchlorid (THPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tryspin/EDTA</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Immunzytochemie von Zellen in 3D-ELP-Hydrogelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% (w/v) Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>D1306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eselserum</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (AF488)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (AF546)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Maus Nestin Primärer Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>Maus Sox2 Primärer Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>23064S</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Hardset Einbettmedium &</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

produktion von elastin-like protein hydrogele für kapselung und immunostaining zellen in 3d

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Zweidimensionale (2D) Gewebekultur Techniken sind wichtig für unser Verständnis der grundlegenden Zelle Biologie gewesen. Jedoch sammelte traditionelle 2D Gewebekultur Systeme fehlen eine dreidimensionale (3D) Matrix, wodurch eine deutliche Trennung zwischen Ergebnisse in Vitro und in Vivo. Um diese Einschränkung zu beheben, haben Forscher 3D Hydrogel Gewebekultur Plattformen entwickelt, die die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften der in Vivo Zelle Mikroumgebung nachahmen kann. Diese Forschung hat die Notwendigkeit, Material Plattformen entwickeln, die 3D Zelle Kapselung und nachgelagerten biochemischen Assays unterstützen motiviert. Rekombinantes Protein-Engineering bietet eine einzigartige Toolset für 3D Hydrogel-Material-Design und Entwicklung, indem Sie für die spezifische Steuerung der Proteinreihenfolge und daher, durch Verlängerung, die möglichen mechanischen und biochemischen Eigenschaften der resultierenden Matrix. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Expression von rekombinant abgeleitet Elastin-Like Protein (ELP), die Form Hydrogele mit unabhängig einstellbaren mechanischen Eigenschaften und Zelle-Klebstoff-Liganden-Konzentration genutzt werden können. Weiter präsentieren wir eine Methodik für die Zelle Kapselung in ELP Hydrogele und anschließende immunofluorescent Färbung der Zellen für nachgelagerte Analyse und Quantifizierung eingebettet.

Die in diesem Protokoll verwendeten ELPs bestehen aus fünf Regionen: ein T7-Tag, His6 Tag spaltstelle Enterokinase (EK), einer Bio-aktiven Region und ein Elastin-ähnliche Region (Abbildung 1). Die T7 und His6 Tags ermöglichen einfache Identifizierung durch standard-Western-Blot-Techniken. Einführung der EK-spaltstelle ermöglicht für den enzymatischen Abbau des Rayons Tag bei Bedarf. Die Bio-aktiven Region kodiert für die erweiterte, Fibronektin-abgeleitete Ze...

Rekombinantes Protein-Engineering Hydrogele sind für 3D Zellkultur von Vorteil, da sie für komplette Einstellbarkeit der Polymer-Rückgrat und sich somit die Zelle Mikroumgebung ermöglichen. Hier beschreiben wir den Prozess der rekombinante Elastin-wie Proteinreinigung und ihre Anwendung in 3D Hydrogel Zelle Kapselung.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, rekombinant abgeleitete Elastin-ähnliche Proteine zu exprimieren und zu reinigen, um sie als abstimmbares Hydrogel für die 3D-Zellverkapselung zu verwenden. Darüber hinaus stellt dieses Protokoll die Methodik für die nachgeschaltete Fluoreszenzmarkierung in der konfokalen Mikroskopie von verkapselten Zellen vor. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biomaterialien, regenerative Medizin und Zellbiologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis der Rolle von Zell-extrazellulären Matrix-Wechselwirkungen in 3D.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine reproduzierbare, abstimmbare und modulare Materialplattform bietet, die für die Untersuchung mehrerer Zelltypen geeignet ist. Insgesamt kann die Implementierung dieser Technik unser Verständnis der kritischen zellulären EZM-Signalparameter verbessern, die den Erfolg zukünftiger zellbasierter regenerativer Therapien bestimmen könnten. Streichen Sie eine Ampicillin- und Chloramphenicol-Agarplatte mit einem vorgefertigten Bakterienstamm, der einen Vektor enthält, der für das interessierende ELP kodiert.Inkubieren Sie die gestreifte Platte dann über Nacht kopfüber bei 37 Grad Celsius, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen. Am nächsten Tag eine einzelne Kolonie vom Teller nehmen und die vorgewärmte Starterkultur beimpfen. Inkubieren Sie die Kultur in einem Shaker bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden.Nach der Inkubationszeit werden mit einer serologischen Pipette 20 Milliliter der Starterkultur in jeden Expressionskolben überführt. Lassen Sie den Ausdruckskolben eine Stunde lang schütteln. Nach einer Stunde wird die optische Dichte bei 600 Nanometern eines Aliquots aus dem Expressionskolben gemessen.Sobald der Messwert 0,6 erreicht, reduzieren Sie die Temperatur des Schüttlers auf 32 Grad Celsius. Wenn der Messwert 0,8 erreicht, wird ein Milliliter eines molaren steril filtrierten IPTG zugegeben, um die ELP-Expression im Expressionskolben zu induzieren. Lassen Sie die Kultur sieben Stunden lang zum Ausdruck kommen.Nach sieben Stunden zentrifugieren Sie das Expressionsmedium bei 12.000 x g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Bodenzentrifuge. Nach der Zentrifugation das Küvettenpellet mit einem Spatel aus dem Zentrifugenbehälter auffangen und in einen vorgewogenen Ziploc-Beutel geben. Als nächstes lösen Sie das Zellpellet in steril gefiltertem TEN-Puffer auf.Massieren Sie das Zellpellet, um eine homogene Lösung zu bilden. Frieren Sie den Ziploc-Beutel mit resuspendiertem Zellpellet in einem Sekundärbehälter bei 80 Grad Celsius ein. Zu dem aufgetauten Zellpellet fügen Sie etwa 30 bis 40 Milligramm Desoxyribonuklease und einen Milliliter 100 Millimolar PMSF pro 100 Milliliter Zelllysat hinzu.Inkubieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Shaker. Nach dem dritten Gefrier-Auftau-Zyklus zentrifugieren Sie die Proben eine Stunde lang bei mindestens 15.000 x g bei vier Grad Celsius. Gießen Sie nach der Zentrifugation den Überstand aus dem Zentrifugenbehälter ab und geben Sie die Lösung in einen neuen Zentrifugenbehälter.Zu je 100 Millilitern Überstand werden 5,84 g Natriumchlorid in drei Teilen zu einer endgültigen molaren Konzentration hinzugefügt. Inkubieren Sie die Suspension in einem Schüttelbrutator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben eine Stunde lang bei mindestens 15.000 x g bei 37 Grad Celsius.Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand aus dem Zentrifugenbehälter und massen Sie das Pellet. Fügen Sie anschließend 10 Milliliter autoklaviertes Reinstwasser pro Gramm Pellet hinzu, das nach der Zentrifugation erhalten wurde. Um sicherzustellen, dass sich das Protein vollständig auflöst, verwenden Sie einen Metallspatel, um das Pellet zu zerdrücken und wieder zu suspendieren.Inkubieren Sie das resuspendierte Pellet über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler. Wiederholen Sie die Kalt- und Heißzentrifugationsschritte für insgesamt drei Zyklen, um das ELP weiter zu reinigen. Anschließend wird der Restüberstand in einer 3,5-Kilodalton-Dialysemembran drei Tage lang gegen vier Liter vorgekühltes Reinstwasser bei vier Grad Celsius dialisiert, um die Proteinlösung zu entsalzen.Die enddialysierte Lösung wird in einer vorgekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird bei 80 Grad Celsius in einem vorgewogenen konischen Röhrchen eingefroren. Schließlich wird die gefrorene Lösung drei Tage lang lyophilisiert und dann das endgültige lyophilisierte Produkt gewogen, um die Proteinausbeute zu bestimmen.Mit Hilfe eines Biopsiestanzers werden Löcher in eine 0,5 Millimeter dicke Silikonfolie gebohrt. Schneide dann um jedes Loch ein Quadrat aus. Als nächstes entfernst du mit einer Pinzette die Plastikfolie auf jeder Seite der einzelnen Formen.Nachdem Sie die Plastikfolie entfernt haben, positionieren Sie mit der Pinzette die gleiche Anzahl an blanken Silikonformen und Glasabdeckfolien in abwechselnden Reihen auf dem Deckel einer 48-Well-Platte für die anschließende Plasmaverklebung. Nachdem alle Zellkulturmaterialien hergestellt wurden, kann mit der Vorbereitung des interessierenden Zelltyps für die nachgeschaltete Hydrogel-Verkapselung begonnen werden. Nach der Dissoziation der Zellen in eine Einzelzellsuspension aliquotiert die gewünschte Anzahl von Zellen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei etwa 200 x g für drei Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und das Pellet auf Eis lagern. Resuspendieren Sie das Zellpellet in der ELP-Stammlösung auf 80 % des Endvolumens.Mischen Sie dann die Lösung mit einer Pipette zu einer homogenen Zellsuspension in ELP. Für die verbleibenden 20 % des Endvolumens geben Sie THPC-Stammlösung in die ELP-Suspension der Zellen. Pipettieren Sie mehrmals, um die Bildung einer homogenen Mischung zu gewährleisten und gleichzeitig die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.Pipettieren Sie anschließend in kreisenden Bewegungen die ELP THPC-Mischung der Zelle in jede Form in einer 24-Well-Platte. Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 15 Minuten werden die Proben weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert.Sobald die Inkubation beendet ist, geben Sie vorsichtig 750 Mikroliter warmes Zellkulturmedium in eine 24-Well-Platte in jede Vertiefung. Lassen Sie das Hydrogel für die gewünschte Kulturdauer bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie zuerst das Medium aus jeder Vertiefung an.Waschen Sie dann die Vertiefungen mit einem Milliliter warmem DPBS. Geben Sie nach Abschluss des Waschvorgangs 750 Mikroliter Fixierlösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie dann die 24-Well-Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation aspirieren Sie die Fixierlösung aus jeder der Vertiefungen und entsorgen Sie das Fixiermittel in einem Behälter für Sondermüll. Geben Sie anschließend einen Milliliter DPBS in die Probe und entsorgen Sie das DPBS sofort in einem Behälter für gefährliche Abfälle. Als nächstes fügen Sie 750 Mikroliter Permeabilisierungslösung hinzu, um die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf der Wippe bei 15 Umdrehungen pro Minute zu permeabilisieren.Nach einer Stunde aspirieren Sie die Permeabilisierungslösung und geben Sie 750 Mikroliter Blockierungslösung in die Probe. Lassen Sie die Probe drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf der Wippe. Verdünnen Sie dann die gewünschten Primärantikörper mit der Antikörperverdünnungslösung.Geben Sie anschließend 500 Mikroliter der Antikörperlösung in jede Probe. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung und waschen die Proben dann dreimal eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 15 Umdrehungen pro Minute mit PBST.Als nächstes verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper in fünf Milligramm pro Milliliter DAPI-Stammlösung, um eine Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Geben Sie dann 500 Mikroliter der Lösung zu jeder Probe. Als nächstes verwenden Sie Aluminiumfolie, um die 24-Well-Platte abzudecken und die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius zu inkubieren.Am nächsten Tag wird die Sekundärantikörperlösung aspiriert und die Proben dreimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einer Wippe mit PBST gewaschen. Positionieren Sie als Nächstes einen Tropfen des festsitzenden Einbettmediums auf der Oberfläche eines Objektträgers und platzieren Sie die Probe auf dem Einbettmedium. Verwenden Sie abschließend Nagellack, um die Proben auf dem Glasdeckel zu versiegeln, um eine Kontamination oder Bewegung der Probe zu verhindern.Hier wird die Expression des Zielproteins mit dem ELP in voller Länge unter kontrollierten Bedingungen durch das Vorhandensein von Banden bei 37 Kilodalton sowohl in der SDS-PAGE- als auch in der Western-Blot-Analyse validiert. Unter unkontrollierten Bedingungen sind jedoch auch mehrere Banden mit niedrigem Molekulargewicht mittels Western Blot sichtbar. Die unteren Molekulargewichtsbanden entsprechen Proteinen mit weniger als vier Elastin-ähnlichen Domänenwiederholungen, was darauf hindeutet, dass das Protein während der Expression nicht vollständig translatiert wird.Dieses Ergebnis tritt häufig auf, wenn die Expression über 32 Grad Celsius durchgeführt wird. Um die Konzentration des zelladhäsiven Liganden zu variieren und gleichzeitig die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels konstant zu halten, wird das Verhältnis der ELP-Variante, die den Fibronektin-abgeleiteten Zellklebstoff enthält, und der nicht-zellgebundenen Adhäsivsequenzen abgestimmt. Darüber hinaus sind murine neurale Vorläuferzellen auch über einen Zeitraum von sieben Tagen lebensfähig, wenn sie in einem 3%igen ELP-Hydrogel verkapselt sind.Die lebenden Zellen sind aufgrund der Calcein-AM-Färbung grün gekennzeichnet, während das rote Ethidium-Homodimer bevorzugt von den toten Zellen aufgenommen wird. Um den Stammzellphänotyp von neuralen Vorläuferzellen zu validieren, wird die Expression von kanonischen Markern wie Sox2 und Nestin auch durch Immunfärbung sichtbar gemacht, wenn die Zellen in den 3D-ELP-Hydrogelen eingekapselt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Elastin-ähnliches Protein für die nachgelagerte Verkapselung verschiedener Zelltypen exprimiert und reinigt, und darüber hinaus die Rolle der 3D-Mikroumgebung bei der Modulation des zellulären Phänotyps untersuchen.

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Immunfärbung von Zellen, die in einem 3D-Hydrogel eingekapselt sind. Die Hydrogelkultur, die neurale Vorläuferzellen enthält, wird fixiert, permeabilisiert und mit einer Blockierungslösung behandelt, um eine unspezifische Immunfärbung zu verhindern. Ein primärer Antikörpercocktail wird zugegeben, um spezifische Proteine zu binden, gefolgt von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern und einer Kernfärbung. Die Probe wird dann auf einen Objektträger...

Immunfärbung von Zellen, die in einem 3D-Hydrogel-System verkapselt sind

Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Wir beschreiben einen sequentiellen Prozess zur lichtvermittelten Bildung und anschließenden biochemischen Strukturierung von synthetischen Hydrogelmatrizen für dreidimensionale Zellkulturanwendungen. Die Konstruktion und Modifikation von Hydrogelen mit zytokompatibler Photoclick-Chemie wird demonstriert. Darüber hinaus werden einfache Techniken zur Quantifizierung und Beobachtung von Mustern und zur Bestimmung der Zellviabilität innerhalb dieser Hydrogele vorgestellt.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Verschiedene Methoden zu manipulieren, dreidimensionalen Architektur in Protein-basierte Hydrogele werden hier in Bezug auf die Materialeigenschaften ausgewertet. Die makroporöse Netze sind mit einer Zelle-Klebstoff-Peptid funktionalisiert und deren Umsetzbarkeit in der Zellkultur wird ausgewertet, mit zwei verschiedenen Modell-Zelllinien.

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von elastischen 3D makroporöse Microcryogels durch die Integration von Microfabrication mit Cryogelation Technologie. Beim Laden mit Zellen, entstehen 3D Microtissues, die kann leicht injizierte in Vivo , regenerative Therapie zu erleichtern oder zu Arrays für in-vitro- Hochdurchsatz-Drogen-Screening montiert.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

Hier beschreiben wir eine einfache Zubereitung von Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie. Methoden der Hydrogel mechanische Festigkeit und seine Anwendung in 3D Zellkultur anpassen werden vorgestellt.

Vorbereitung der Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele und deren Anwendung in 3D Zellkultur

Die Scherverarbeitung während der Hydrogelbildung führt zur Herstellung von Mikrogelsuspensionen, die scherdünn sind, sich aber nach Beseitigung der Scherkräfte schnell restrukturieren. Solche Materialien wurden als Stützmatrix für das Bioprinting komplexer, zellbeladener Strukturen verwendet. Hier werden Verfahren zur Herstellung des Stützbettes und kompatibler Biotinten beschrieben.

Agarose-Flüssiggele, die durch Scherverarbeitung während der Gelierung für suspendierten 3D-Biodruck gebildet werden

In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.

3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

Lernen Sie die Herstellung von Elastin-Like-Protein-Hydrogelen für die 3D-Zellkapselung und Immunfärbung. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zu Zell-ECM-Interaktionen in der regenerativen Medizin.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Weitere Videos entdecken