Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Kynurenine werden mit der Regulierung der Immunantwort bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Zuverlässige und validierte Methoden zur Identifizierung mehrerer Kynurenine helfen bei der Entwicklung wirksamerer Therapien. Unser Protokoll verwendet Flüssigchromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie, um die verschiedenen Tryptophan-Metaboliten zu identifizieren, die durch den Kynurenin-Signalweg in Medien aus Krebszellkulturen erzeugt werden.

Unerfahrene Benutzer können Schwierigkeiten bei der Probenvorbereitung oder bei der Datenerfassung und -interpretation haben. Wenn man unser Protokoll und unsere Empfehlungen befolgt, kann man Fehler vermeiden und zuverlässige Daten erhalten. Zur Herstellung von Stammlösungen der Reagenzien wiegen Sie 0,3 Milligramm jedes Reagenzes in einem Fläschchen mit höchster Genauigkeit ab und lösen Sie jedes Reagenz in 300 Mikrolitern des entsprechenden Lösungsmittels auf, um ein Gramm pro Liter Stammlösungen jedes Reagenzes zu erhalten.

Zur Herstellung von mit Holzkohle behandeltem Nährmedium werden 280 mg Aktivkohle in einem konischen Röhrchen abgewogen und fünf Milliliter des flüssigen Mediums hinzugefügt, das für die Kultivierung der interessierenden Zellen vorbereitet wurde. Schütteln Sie das Rohr mit dem Medium und der Holzkohle auf einer Wippe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und 50 Schwingungen pro Minute. Am Ende der Inkubation wird die Holzkohle durch Zentrifugation sedimentiert und der Überstand vorsichtig aufgefangen, ohne die Holzkohle zu stören, und dann das Medium mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter filtriert.

Zur Herstellung der Kalibrierlösung wird das mit Holzkohle behandelte Kulturmedium mit 0,75 Mikrolitern 0,1 Gramm pro Liter 3NT-Lösung aufgespießt und 3-H-Kynurenin, 3-HAA-Kynurenin und Xanthurensäure in mindestens sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt, um alle Kalibrierbereiche bis zu einem Endvolumen von 150 Mikrolitern pro Probe abzudecken. Nach dem Vortexen geben Sie 150 Mikroliter kaltes Methanol mit minus 20 Grad Celsius, ergänzt mit 1 %iger Ameisensäure, in jedes Röhrchen für die Probendeproteinisierung, verschließen Sie die Röhrchen fest und wirbeln Sie sie erneut vortexen. Nach einer 40-minütigen Inkubation bei minus 20 Grad Celsius zentrifugieren Sie die Proben und überführen mit einer automatischen Pipette 270 Mikroliter jedes Überstands in einzelne Glasfläschchen mit flachem Boden.

Stellen Sie die Fläschchen in einen Verdampfer und verwenden Sie das entsprechende Programm für Wasser-Methanol-Fraktionen, um die flüchtigen Bestandteile etwa 30 Minuten lang sanft zu verdampfen. Wenn die Röhrchen trocken sind, rekonstituieren Sie jede Probe in 60 Mikrolitern 0,1 %iger Ameisensäure in Wasser und wirbeln Sie die Proben, bevor Sie jede Lösung zur Zentrifugation in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Ohne das Sediment zu stören, die Überstände in chromatographische Fläschchen mit konischen Glaseinsätzen überführen und die Fläschchen in einen LC-MS-Autosampler geben.

Bevor Sie die Proben durchführen, spülen Sie das LC-System mit der mobilen Phase, um Blasen zu entfernen und alle Lösungsmittelkanäle zu entlüften. Als nächstes spülen Sie den Wächter und die Analysesäule etwa 30 Minuten lang mit 100 % Acetonitril, bevor Sie das System mit 100 % Lösungsmittel A spülen, bis ein stabiler Druck in der Säule beobachtet wird, stellen Sie dann die entsprechenden LC-Parameter in der Datenerfassungssoftware ein und erstellen Sie eine Arbeitsliste für die Ausführung der Proben auf dem LC-System. Um die Kalibrierkurve zu erstellen, fügen Sie in der Datenerfassungssoftware die Kalibrierstandards in die Arbeitsliste ein und führen Sie die Standards in dreifacher Ausführung aus, integrieren und messen Sie dann den Peakbereich, der 3-Hydroxykynurenin, Kynurenin, 3-Hydroxyanthranilsäure, 3-Nitrotyrosin und Xanthurensäure entspricht, bei einer Retentionszeit von etwa 4,4, 10, 16, 21 bzw. 30 Minuten.

Um Überstandsproben aus einer In-vitro-Zellkultur zu entnehmen, werden nach 48 Stunden Standard-Zellkultur der interessierenden Zellen 500 Mikroliter Überstand aus jeder Vertiefung in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt, dann die Mediumüberstände in neue Röhrchen für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius bis zur Analyse überführt und die Zellpellets bis zur Proteinschätzungsanalyse bei minus 20 Grad Celsius gehalten. Um Proben für die LC-MS-Analyse vorzubereiten, geben Sie 149,25 Mikroliter jeder aufgetauten Kulturmediumprobe in ein neues 1,5-Mikroliter-Röhrchen und geben Sie 0,75 Mikroliter 0,1 Gramm 3NT-Lösung pro Liter in jedes Röhrchen. Nach der Vorbereitung der Proben wie demonstriert werden 150 Mikroliter Methanol mit minus 20 Grad Celsius, zugesetzt mit 1 %iger Ameisensäure, in jedes Röhrchen gegeben und die Probe wie gezeigt für die LC-MS-Analyse vorbereitet.

Wenn die Arbeitsliste vollständig ist, messen Sie die Peakfläche jedes Analyten und verwenden Sie eine individuelle lineare Kalibrierungsgleichung, die für jeden Analyten bestimmt ist, um die Konzentrationen der in jeder experimentellen Probe vorhandenen Analyten zu berechnen. Um den zellulären Proteingehalt entsprechend der Probe des Kulturmediums zu bestimmen, resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 100 Mikrolitern PBS und frieren Sie die Proben eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius ein, bevor Sie sie auf Eis auftauen. Nach dreimaligem Gefrierauftauen der Proben werden die Zelllysate durch Zentrifugation aufgefangen und die Überstände in neue Röhrchen überführt, ohne die Pellets zu stören.

Die Probe wird 10-mal mit frischem PBS verdünnt und die entsprechenden Volumina Rinderserumalbumin-Standardlösung in zweifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte gegeben. Laden Sie 10 bis 15 Mikroliter jeder überstehenden Zelllysatprobe in die entsprechenden Vertiefungen der 96-Well-Platte und füllen Sie sowohl die Standard- als auch die Probenvertiefung bis zu einem Endvolumen von 50 Mikrolitern PBS pro Well. Geben Sie dann 200 Mikroliter eines Bradford-Reagenzes, das fünfmal mit ultrareinem Wasser verdünnt wurde, in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation laden Sie die Platte auf einen Mikroplatten-Reader und messen die Extinktion bei 595 Nanometern, erstellen Sie dann eine Kalibrierungskurve, um die Berechnung der Proteinmenge in jeder Probe zu ermöglichen, und dividieren Sie die Konzentration jedes Kynurenins durch den Gesamtproteingehalt, um die Kynureninmenge in jeder Probe pro Mikrogramm Protein zu normalisieren. Hier sind die Ergebnisse der Einzelquadrupol-Massenspektrometrie, die bei der Analyse von Medien mit 4,5 Gramm D-Glukose pro Liter und 10 % fötalem Rinderserum erhalten wurden. Beachten Sie den kleinen Peak, der auf das Vorhandensein von Kynurenin in der Probe hinweist.

Führen Sie eine Qualitätskontrollprobe durch, bevor Sie die tatsächlichen Probendaten anfordern, um die entsprechenden Retentionszeiten der Analyten zu bestätigen, da eine Verschiebung der LC-Signale oder Fehlanpassungen beobachtet werden können. Koeluierende Matrixkomponenten können Ionen mit dem für die Zielanalyten gewählten Hauptladungsverhältnis erzeugen. Zum Beispiel trat in dieser Analyse der Peak der unbekannten Verbindung in der Scan-Periode auf, während der das Ion des Hauptladungsverhältnisses 206 überwacht wurde.

Aufgrund der Inkompatibilität der Retentionszeit entsprach das Signal nicht dem Analyten. Obwohl das Tryptophan-Isotop das gleiche Ion wie das Master-Ladungsverhältnis 206 aufwies, zeigte die chromatographische Analyse, dass das Tryptophan-Signal gut vom Xanthurensäure-Signal getrennt war, was darauf hindeutet, dass der im getesteten Krebszellmedium vorhandene Tryptophan-Gehalt keinen Einfluss auf die Xanthurensäure-Quantifizierung hatte. Diese Analyse des Nährmediums von zwei Arten von Krebszelllinien zeigt, dass die untersuchten humanen epithelialen Brustkrebszellen unterschiedliche Mengen an Tryptophan-Metaboliten freisetzten, während die getesteten humanen Eierstockkrebszellen signifikant höhere Kynureninspiegel produzierten.

Die Verwendung eines internen Standards während der Probenvorbereitung hilft bei der zuverlässigen Datenerfassung. Die Normalisierung der Daten auf den Proteingehalt korrigiert die Variabilitäten der Zellzahl innerhalb der einzelnen Wells. Unser Protokoll kann weiter erweitert werden, um zusätzliche Analyten zu bestimmen, kann sich aber unter anderen experimentellen Bedingungen im Kulturmedium anreichern.