Name: Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Lernen Sie ein kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität als Biomarker für Krankheiten mit flexiblen Nukleinsäuresonden. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht Forschern die Identifizierung bekannter und unbekannter Nuklease-Aktivitäten.

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Die Autoren würdigen Luiza I. Hernandez (Linköping University) für ihre sorgfältige Überarbeitung des Manuskripts und wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde von der Knut and Alice Wallenberg Foundation und dem Strategic Research Area in Materials Science on Advanced Functional Materials der Universität Linköping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971) unterstützt.

1. Oligonukleotid Bibliothek Design und Vorbereitung
<ol><li>Bibliotheksdesign<ol>
<li>Basierend auf den folgenden Kriterien entwerfen Sie eine Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden zwischen 8 und 12-mer lang, um sekundäre Strukturbildung zu vermeiden, mit gleicher Länge für alle Sonden.<ol>
<li>Schließen Sie mindestens eine DNA- und eine RNA-Zufallssequenz ein, die eine Kombination aus Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T)/Uracil (U) enthält (DNA- und RNA-Sonden in Tabelle 1). HINWEIS: Die in Tabelle 1 beschriebenen DNA- und RNA-Sequenzen waren als Anfangssubstrate für die Klassifizierung einer unbekannten Art von Nukleaseaktivität, entweder DNase oder RNase, nützlich. Diese beiden Sequenzen werden als Ausgangspunkt für jedes Screening empfohlen, da sie eine breite Fähigkeit gezeigt haben, Nuklease-Aktivitätsprofile in Bakterien und Gewebeproben zu erkennen. Wenn die Nukleaseaktivität mit diesen DNA- und RNA-Sequenzen nicht beobachtet wird, ist die Entwicklung zusätzlicher Oligonukleotide erforderlich.</li>
			<li>Umfassen Sie Polynukleotidsequenzen, die aus einem einzigen Nukleotidtyp bestehen, um die Sequenzabhängigkeit für eine gegebene Nukleaseaktivität zu bestimmen (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C und RNA-Poly G in Tabelle 1).</li>
			<li>Unter Verwendung der gleichen Sequenz von Nukleotid-Rückständen wie die ursprünglichen DNA- und RNA-Sequenzen umfassen Sequenzen, die Nukleosidanaloge enthalten, die chemische Modifikationen an der 2'-Position des Ribosezuckers, wie 2'-Fluoro und 2'-O-Methyl, als einen strengen Schritt enthalten. zur Erhöhung der Selektivität der Nukleasen.<ol>
<li>Vollständige modifizierte Sequenzen, die vollständig aus 2'-Fluorosid-Analogen oder 2'-O-Methyl-Nukleosid-Analogen bestehen (Alle 2'-F und Alle 2'-OMe, Tabelle 1)</li>
				<li>Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Purinen und 2'-Fluoropyrimidin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pyr-2'F, Tabelle 1).</li>
				<li>Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Purinen und 2'-O-Methylpyrimidin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pyr-2'OMe, Tabelle 1).</li>
				<li>Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Pyrimiden und 2'-Fluor-Purin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pur-2'F, Tabelle 1).</li>
				<li>Schließen Sie chimäre Sequenzen ein, die aus unveränderten natürlichen Pyrimiden und 2'-O-Methyl-Purin-Nukleosid-Analogen bestehen (RNA Pur-2'OMe, Tabelle 1).</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oligonukleotid-Sonde Vorbereitung und Lagerung HINWEIS: Oligonukleotide werden mit der Phosphoramidit-Methode synthetisiert. Nach der Synthese werden die Oligonukleotide mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt und die Masse mittels Massenspektrometrie gemessen.<ol>
<li>Drehen Sie die lyophilisierten Oligonukleotid-Sonden mit einer Zentrifuge herunter und verdünnen Sie sie im Tris-EDTA (TE)-Puffer, um einen Nukleaseabbau zu verhindern. Bestimmen Sie das Verdünnungsvolumen entsprechend der Ausbeute jeder Sonde, um eine Lagerlösung mit einer Konzentration von 500 pmol/l zu rendern.</li>
		<li>Lyophilisierte Oligonukleotide bei 4 °C oder raumtemperatur kurzfristig lagern. Für die Langzeitlagerung (Monate bis Jahre) lyophilisierte Oligonukleotide bei -20 °C lagern. Bei Resuspension lyophilisierter Oligonukleotide in TE die Lagerlösungen bei -20 °C oder vorzugsweise bei -80 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bakterielle Kultur
<ol><li>Nehmen Sie eine poröse Glasperle aus der kryogenen Durchstechflasche unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Um einzelne Bakterienkolonien (Salmonellen und E. coli)zu isolieren, verwenden Sie die Quadrantenmethode24, indem Sie die Perle direkt auf eine Petrischale mit Tryptic Soy Agar (TSA) Medium stutzen, das mit defibrinierten Schafen ergänzt wird. blut.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C für 24 h.</li>
</ol>3. Supernatante Vorbereitung
<ol><li>Übertragen Sie eine einzelne Kolonie von festen Medien auf 50 ml Tryptic Soy Broth (TSB) und brüten bei 37 °C für 24 h bei 200 Rpm.</li>
	<li>Die Kultur (1:500) in TSB (Subkultur) verdünnen und bei 37 °C für 24 h bei 200 U/min in einem Schüttelinkubator brüten. HINWEIS: Es wird erwartet, dass sich die Bakterienkulturen nach 24 h Inkubation in einer stationären Phase befinden und Werte über 109 KBE/ml erreichen.</li>
	<li>Nach der Inkubationszeit die Kulturen 30 min auf gekapselte sterile Schläuche und Zentrifugen bei 4.500 x g übertragen.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn sofort. Alternativ können Sie die Überräube bei 4 °C oder -20 °C lagern.</li>
</ol>4. Nuklease Aktivität Assay
<ol><li>Vorbereitung von Arbeitslösungen<ol>
<li>Bereiten Sie für jede Sonde in 1,5 ml Nuklease-freien Mikrozentrifugenrohren eine 20-L-Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung (500 pmol/l) für eine Endarbeitskonzentration von 50 pmol/l verdünnen (1:10 Verhältnis). Zu diesem Zweck mischen Sie 18 l Phosphatpuffer-Saline (PBS), die MgCl2 und CaCl2 enthalten, mit 2 l Sondenlagerlösung. HINWEIS: Beachten Sie, dass in der Arbeitslösung die Oligonukleotide anfälliger für Nukleaseabbau sind, daher wird empfohlen, die Arbeitslösungen kurz vor der Einrichtung der Reaktion vorzubereiten.</li>
		<li>Vermeiden Sie direkten Lichtkontakt während der Vorbereitung und halten Sie im Dunkeln (in Folie gewickelt), wenn Sie mit Fluorophoren umgehen.</li>
	</ol></li>
	<li>Reaktion eingerichtet<ol>
<li>Das Fluorometer (z.B. Cytation 1) auf 37 °C vorwärmen.</li>
		<li>Bereiten Sie für jede Probe (TSB, E. coli und Salmonella ) ein Set (ein Rohr/Sonde) von 1,5 ml Nuklease-freien Mikrozentrifugenröhrchen vor und etikettierenSie entsprechend.</li>
		<li>Fügen Sie vorsichtig 96 L TSB sterile Kulturmedien, Salmonellen-Überstand oder E. coli Überstand hinzu (ab Schritt 3.4.). Anschließend fügen Sie die Sondenarbeitslösung 4 l/L/Rohr entsprechend hinzu. Führen Sie diesen Schritt bei Raumtemperatur aus. HINWEIS: 10 Sonden wurden für die erste Runde des Screenings und 6 Sonden für die zweite Runde verwendet.</li>
		<li>Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten, um eine homogene Lösung zu erhalten. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen in die Proben während des Mischens.</li>
		<li>Laden Sie 95 l jeder Lösung (Sonde + Überstand oder Kulturmedien) in einen separaten Brunnen einer schwarzen, nicht behandelten 96-Wellplatte. Minimieren Sie die Bildung von Blasen in den Brunnen beim Beladen, indem Sie sorgfältig mit der Spitze in der Nähe der Wand des Brunnens verzichten.</li>
		<li>Bedecken Sie die Platte mit ihrem Deckel. Überprüfen Sie den Deckel visuell und prüfen Sie, ob Stiftmarkierungen oder Staubpartikelansammlungen, die Messartefakte einführen können, überprüft werden. Ersetzen Sie den Deckel gegen einen neuen, wenn dies der Fall ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Messeinrichtung<ol>
<li>Öffnen Sie die Erfassungssoftware (Gen5 3.05), indem Sie auf das Symbol für die Softwareverknüpfung klicken (Abbildung S1A).</li>
		<li>Wählen Sie Jetzt lesen aus dem Aufgaben-Manager-Fenster und wählen Sie Neu... um das kinetische Messprotokoll zu erstellen (Abbildung S1B).</li>
		<li>Klicken Sie im Dialogfenster prozedural auf Temperatur festlegen und wählen Sie 37 °C aus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S1C).</li>
		<li>Klicken Sie im Dialogfenster mit dem Titel Procedureauf Kinetics starten. Wählen Sie dann im Popup-Dialogfenster mit dem Titel Kinetic Step2 h im Eingabefeld Laufzeit und 2 min im Intervalleingabefeld aus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S1D).</li>
		<li>Klicken Sie im Dialogfenster mit dem Titel Prozedurauf Lesen . Wählen Sie dann im Popup-Dialogfenster mit dem Titel Lesemethode Fluoreszenzintensität als Erkennungsmethode, Endpunkt/Kinetik als Lesetyp und Filter als Optiktyp aus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S1E).</li>
		<li>Wählen Sie im Popup-Dialogfenster Leseschritt (Kinetisch) Grün aus dem Filtersatzaus. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OK drücken (Abbildung S2A).</li>
		<li>Wählen Sie im Dialogfeld prozedural den Deckel aus, und klicken Sie auf Überprüfen, um sicherzustellen, dass das erstellte Protokoll gültig ist. Dies wird durch ein Popup-Dialogfenster bestätigt (Abbildung S2B).</li>
		<li>Wählen Sie Protokoll in der Menüleiste und wählen Sie Prozedur (Abbildung S2C).</li>
		<li>Definieren Sie im Dialogfenster prozedurierenSie die zu messenden Brunnen (Abbildung S2D).</li>
		<li>Geben Sie den Namen des Experiments in das Eingabefeld Dateiname ein (Abbildung S2E).</li>
		<li>Laden Sie die Platte mit dem Deckel in den Plattenleser. Stellen Sie sicher, dass sich die Platte in der richtigen Ausrichtung befindet.</li>
		<li>Starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche "Neue Taste lesen" in der Symbolleiste klicken (Abbildung S2F).</li>
	</ol></li>
	<li>Datenanalyse<ol>
<li>Klicken Sie auf eine der gemessenen Brunnen im Dialogfenster mit dem Titel Platte 1 (Abbildung S3A).</li>
		<li>Klicken Sie auf Brunnen auswählen und alle gemessenen Brunnen in das Dialogfenster Brunnenauswahl ein. Bestätigen und speichern Sie die Einstellungen, indem Sie OKdrücken. (Abbildung S3B).</li>
		<li>Wählen Sie Daten im Dialogfeld mit dem Titel Platte 1 aus, um die tabellarischen Ergebnisse zu visualisieren (Abbildung S3C).</li>
		<li>Exportieren Sie die Daten in ein Spreadsheet, indem Sie den Schnellexport aus dem Kontextmenü auswählen (Abbildung S3C).</li>
		<li>Beschriften Sie im Spreadsheet die Datenspalten für jede Probe und jeden Prüfpunkt entsprechend.</li>
		<li>Generieren Sie kinetische Diagramme unter Verwendung des Linienstils mit Markern, indem Sie relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) im Vergleich zur Zeit (x-Achse: Zeitachse der Reaktion und y-Achse: RFUs) darstellen. HINWEIS: Die Beschreibung der Erstellung eines Diagramms ist anwendbar, wenn Tabellenkalkulationsprogramme (z. B. Excel) verwendet werden. Alle anderen Programme können jedoch verwendet werden, um Diagramme aus den erhaltenen Rohdaten zu generieren, indem RFU im Vergleich zur Zeit dargestellt wird.</li>
		<li>Berechnen Sie die Rate der enzymatischen Reaktion für jedes gemessene <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq1.jpg"> Intervall nach der folgenden Formel25: rate= , wobei If is RFU beim maximalen Intervallzeitpunkt und Ii RFU beim minimalen Intervallzeitpunkt ist, Und Tf und Ti sind die maximalen bzw. minimalen Intervallzeitpunkte.</li>
		<li>Wählen Sie die Rate mit dem höchsten Wert (Rmax) für jede Kurve aus. Wenn pro Probe mehr als ein Rmax vorhanden ist, wählen Sie den Wert aus, der am frühesten Messzeitpunkt auftritt.</li>
		<li>Berechnen Sie das Verhältnis zwischen Rmax und dem Durchschnittswert des Zeitintervalls, in dem Rmax auftritt: Ratenkoeffizient =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq2.jpg">
</li>
		<li>Berechnen Sie die Faltendifferenz (FD) zwischen dem Ratenkoeffizienten von Salmonellen und E. coli für jede Sonde.</li>
		<li>Betrachten Sie einen Faltendifferenzwert, der höher als 3 ist, als signifikant.</li>
		<li>Betrachten Sie die signifikanten Sonden mit den höchsten Falzdifferenzwerten (FD) als Kandidatensonden und als Grundlage für das Bibliotheksdesign in der nächsten Screening-Runde.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Auswahlkriterien der Screening-Runden (Abbildung 1)
<ol><li>Erste Runde des Screenings<ol>
<li>Führen Sie den Nukleaseaktivitätstest (wie in Abschnitt 4 beschrieben) mit DNA-, RNA- und Polynukleotid-Sonden durch.</li>
		<li>Bewerten Sie die Präferenz für DNA-Chemie oder RNA-Chemie, indem Sie die Anzahl und Leistung (FD-Wert) von DNA- und RNA-Kandidatensonden vergleichen.</li>
		<li>Wählen Sie die Art der Nukleinsäurechemie aus, die die größte Anzahl von Kandidatensonden ausgibt, wie in Abbildung 1dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zweite Runde des Screenings<ol>
<li>Führen Sie den Nukleaseaktivitätstest (wie in Abschnitt 4 beschrieben) mit vollständig modifizierten Sonden und chimären Sonden durch, die auf dem in der ersten Screening-Runde ausgewählten Nukleinsäuresubstrat basieren.</li>
		<li>Bewerten Sie die Präferenz für Sequenzen, die 2'-Fluoro- und 2'-O-Methyl-Nukleosid-Analoge enthalten, indem Sie die Ergebnisse für 2'-Fluor- und 2'-O-Methylmodifizierte Kandidatensonden vergleichen.</li>
		<li>Wählen Sie den Typ der analogen Nukleosidmodifikation aus, wodurch die größte Anzahl von Kandidatensonden dargestellt wird, wie in Abbildung 1dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Veränderungen der Nuklease-Aktivität wurden mit einer Vielzahl von Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht, einschließlich verschiedener Krebsarten und bakterieller Infektionen. Diese Veränderungen werden als Erreger einer Erkrankung14vorgeschlagen, während sie in anderen Fällen die Folge eines schädlichen physiologischen Ereignisses20 oder des Pathogens16,26sind. Es überrascht nicht, dass Versuche, Nuklease nuk...

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die in der Lage sind, die Phosphodiesterbindungen zu spalten, die die Rückgratstruktur von Nukleinsäuremolekülen bilden. Die große Vielfalt der Nukleasen macht ihre Klassifizierung ziemlich schwierig. Es gibt jedoch einige gängige Kriterien, die zur Beschreibung von Nukleasen verwendet werden, wie substratpräferenzium (Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA)), Spaltungsstelle (Endonukleasen oder Exonukleasen) oder Metallionenabhängigkeit, unter anderem1. Nukleasen sind hochkonservierte katalytische Enzyme, die sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen eine grundlegendeRolle spielen und als Genbearbeitungswerkzeuge verwendet wurden und weiterhin verwendet werden 2 . Sie sind auch grundlegende Akteure in der DNA-Wartung und -Replikation, helfen, die Genomstabilität zu erhalten und nehmen an Korrekturverfahren teil3. Bei Bakterien wurden beispielsweise Nukleasen als wichtige Virulenzfaktoren identifiziert, die das überleben der Bakterien fördern können, indem sie die Wirksamkeit desImmunsystemsdes Wirts 4,5,6,7 ,8. Bei Säugetieren, Nukleasen wurden vorgeschlagen, in Apoptose9verwickelt werden , mitochondriale Biogenese und Wartung10 und Vermittlung von antibakteriellen und antiviralen angeborenen Immunantworten11. Es überrascht nicht, dass Nuklease-Aktivitätsänderungen, ob Verbesserung oder Fehlen von, in eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten verwickelt sind. Diese Krankheiten reichen von einer Vielzahl von Krebsarten12,13 bis zu Herzhypertrophie10 oder Autoimmunerkrankungen14. Daher sind Nukleasen zu interessanten Kandidaten als Biomarker für eine heterogene Gruppe menschlicher Bedingungen geworden. Tatsächlich haben Nukleasen bereits ihr Potenzial als erfolgreiche diagnostische Instrumente zum Nachweis von Infektionen gezeigt, die durch bestimmte bakterielle Wirkstoffe wie Staphylococcus aureus oder Escherichia coli15 verursacht werden. 16. Bei vielen Krebsarten ist die Expression von Staphylokokkennuklease-Domänen-haltigem Protein 1 (SND1) Ribonuklease ein Hinweis auf eine schlechte Prognose17. Bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden erhöhte Ribonuklease-I-Serumspiegel18 berichtet und vorgeschlagen, mit Krebszellphänotypen in Verbindung gebracht zu werden19. Bei ischämischen Herzerkrankungen, wie Myokardinfarkt oder instabiler Angina pectoris, desoxyribonuklease I (DNase I) Serumspiegel haben sich als ein gültiger diagnostischer Marker20,21.
Es wurde vermutet, dass die globale Blaupause der Nuklease-Aktivität in gesunden und Krankheitszuständen unterschiedlich sein kann. Tatsächlich haben jüngste Berichte Unterschiede in der Nukleaseaktivität verwendet, um zwischen gesunden und krebsernen Phänotypen22 zu unterscheiden oder pathogene bakterielle Infektionen artspezifisch zu identifizieren15,23. Diese Erkenntnisse haben einen neuen Weg für den Einsatz von Nukleasen als Biomarker von Krankheiten eröffnet. Daher besteht die Notwendigkeit für die Entwicklung einer umfassenden Screening-Methode, die in der Lage ist, krankheitsassoziierte Unterschiede in der Nukleaseaktivität systematisch zu identifizieren, die bei der Entwicklung neuer diagnostischer Instrumente von entscheidender Bedeutung sein können.
Hierin führen wir einen neuen In-vitro-Screening-Ansatz ein (Abbildung 1), um empfindliche und spezifische Sonden zu identifizieren, die in der Lage sind, zwischen Nukleaseaktivität bei gesunder und ungesundem Oder einer spezifischen Aktivität einer Zell- oder Bakterienart zu unterscheiden. Unter Ausnutzung der Modularität von Nukleinsäuren haben wir eine erste Bibliothek von abgeschreckten fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden entwickelt, die aus einem umfassenden Satz verschiedener Sequenzen und Chemikalien bestehen, die beide wichtige Parameter für die Bibliotheksgestaltung sind. Diese Oligonukleotid-Sonden werden von einem Fluorophor (Fluorescein-Amidit, FAM) und einem Quencher (Tide Quencher 2, TQ2) an den 5' bzw. 3' Enden(Tabelle 1) flankiert. Durch die Verwendung dieses fluoreszierenden Resonanzenergietransfers (FRET) basierenden fluormetrischen Assays zur Messung der Kinetik des enzymatischen Abbaus konnten wir Kandidatensonden mit dem Potenzial identifizieren, differentiale Muster der Nukleaseaktivität zu unterscheiden. mit gesunden oder Krankheitszuständen verbunden sind. Wir haben einen iterativen Prozess entwickelt, bei dem neue Bibliotheken auf der Grundlage der besten Kandidatensonden erstellt werden, der es ermöglicht, immer spezifischere Kandidatensonden in nachfolgenden Screening-Schritten zu identifizieren. Darüber hinaus nutzt dieser Ansatz die katalytische Natur von Nukleasen, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem die aktivierbare Natur der Reportersonden und die Fähigkeit von Nukleasen genutzt werden, Substratmoleküle kontinuierlich zu verarbeiten, die beide wichtige Vorteile gegenüber alternativen Antikörpern oder kleinen molekülbasierten Screening-Methoden darstellen.
Dieser Ansatz bietet ein hochmodulares, flexibles und einfach zu implementierendes Screening-Tool zur Identifizierung spezifischer Nukleinsäuresonden, die in der Lage sind, gesunde und krankheitsfördernde Erkrankungen zu unterscheiden, und eine hervorragende Plattform für die Entwicklung neuer diagnostische Nagenzwerkzeuge, die für zukünftige klinische Anwendungen angepasst werden können. Als solcher wurde dieser Ansatz verwendet, um die Nuklease-Aktivität von Salmonella Typhimurium (hier als Salmonellabezeichnet ) für die spezifische Identifizierung dieser Bakterien abgeleitet zu identifizieren. Im folgenden Protokoll berichten wir über eine Methode zum Abschirmen auf bakterielle Nukleaseaktivität mittels kinetischer Analyse.

<table><tbody><tr><td>Unbehandelte 96-Well-Platte mit schwarzem Boden Fisher</td><td>Scientific</td><td>10000631</td><td></td></tr><tr><td>Cytation1</td><td>BioTek</td><td>CYT1FAV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf-Röhrchen</td><td>Thermofisher</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobank Kryo-Aufbewahrungsfläschchen mit Kügelchen</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>22-286-155</td><td></td></tr><tr><td>Nukleinsäuresonden</td><td>Biomers.net</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung mit MgCl2 und CaCl2</td><td>Gibco&trade;</td><td></td><td></td>14040117</tr><tr><td>Salmonella enterica subs. Enterica</td><td>ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647633</td><td></td></tr><tr><td>Trypton Soya Agar with defibrinated sheep</td><td>blood Thermo Fisher Scientific</td><td>10362223</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soja Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetisches screening der nuklease-aktivität mit nukleinsäuresonden

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die Nukleinsäuren abbauen, indem sie die Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen katalysieren, die die Ribosezucker verbinden. Nukleasen weisen eine Vielzahl lebenswichtiger physiologischer Rollen in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen auf, die von der Aufrechterhaltung der Genomstabilität bis hin zum Schutz vor Krankheitserregern reichen. Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit mehreren pathologischen Bedingungen verbunden, einschließlich bakterieller Infektionen und Krebs. Zu diesem Zweck hat die Nukleaseaktivität ein großes Potenzial gezeigt, als spezifischer Biomarker genutzt zu werden. Ein robustes und reproduzierbares Screening-Verfahren auf der Grundlage dieser Aktivität ist jedoch nach wie vor sehr wünschenswert.
Hierin führen wir ein Verfahren ein, das das Screening auf Nukleaseaktivität mit Nukleinsäuresonden als Substraten ermöglicht, mit dem Umfang der Unterscheidung zwischen pathologischen und gesunden Bedingungen. Diese Methode bietet die Möglichkeit, neue Sondenbibliotheken mit zunehmender Spezifität iterativ zu gestalten. Daher sind mehrere Screening-Runden notwendig, um das Design der Sonden mit verbesserten Eigenschaften zu verfeinern und dabei die Verfügbarkeit chemisch modifizierter Nukleinsäuren zu nutzen. Das beträchtliche Potenzial der vorgeschlagenen Technologie liegt in ihrer Flexibilität, hohen Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit für das Screening von Nukleaseaktivitäten im Zusammenhang mit Krankheitszuständen. Es wird erwartet, dass diese Technologie die Entwicklung vielversprechender diagnostischer Werkzeuge mit großem Potenzial in der Klinik ermöglichen wird.

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf dieser Methode, die in zwei Screening-Runden unterteilt ist. In der ersten Runde des Screenings verwendeten wir 5 DNA-Sonden (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C und DNA Poly G) sowie 5 RNA-Sonden (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C und RNA Poly G). Die Rohdaten dieser Screening-Runde sind in der Ergänzenden Tabelle 1 zu finden. In der zweiten Runde wurden chemisch modifizierte Sonden synthetisiert, indem die RNA-Sequenz durch chem...

Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit verschiedenen menschlichen Bedingungen verbunden, die ihr Potenzial als Biomarker zugrunde liegen. Die modulare und einfach zu implementierende Screening-Methodik, die in diesem Papier vorgestellt wird, ermöglicht die Auswahl spezifischer Nukleinsäuresonden zur Nutzung der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke Alternative zum Screening der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten, mit einer einfach umzusetzenden Methodik auch für Forscher, die sich nicht so sehr auf Nukleinsäuresonden spezialisiert haben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Nukleinsäuresonden auszuwählen, die sowohl bekannte als auch unbekannte Nukleaseaktivitäten identifizieren können, wobei die dynamische Interaktion zwischen Sonde und Nuklease genutzt wird. Weitere Vorteile dieser Methode sind flexibilitätsmöglich, hohe Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit.Die Demonstration wird von Khadija, einem Master-Studenten, und Baris, einem Postdoc aus unserem Labor, durchgeführt. Bei der Entwicklung einer Oligonukleotid-Bibliothek, enthalten Mindestens eine DNA und eine RNA Zufallssequenz enthält eine Kombination von Adenin, Guanin, Cytosin und Thiamin oder Uracil. Zur Vorbereitung der Oligonukleotid-Sonden die lyophilisierten Oligonukleotid-Sonden herunterdrehen und jede Sonde im Tris-EDTA-Puffer mit einer Konzentration von 500 Picomolar pro Mikroliter verdünnen, um einen Nukleaseabbau zu verhindern.Für die Bakterienkultur auf festem Medium, rollen Sie eine einzelne poröse Glasperle aus kryogener Lagerung direkt auf eine Kulturschale mit TSA, ergänzt mit abgezäuntem Schafblut, um einzelne Bakterienkolonien auszustreichen. Dann legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Für bakterienkultur im flüssigen Medium, übertragen Sie eine einzelne Kolonie von einer festen mittleren Kultur auf 50 Milliliter TSB für die Inkubation bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute.Am nächsten Tag verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis eins bis 500 in frischem TSB und bebrüten die Bakterien zusätzlich 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute in einem Schüttelinkubator. Um einen Nuklease-Aktivitätstest einzurichten, sollte zunächst ein Fluorometer auf 37 Grad Celsius vorwärmen und 96 Mikroliter steriles TSB oder Überstand aus einer Salmonellen- oder E.Coli-Flüssigkeitsmediumkultur vorsichtig zu einer 1,5-Milliliter-Nuklease-freien Mikrozentrifugenröhre pro Sonde hinzufügen. Fügen Sie vier Mikroliter Sondenarbeitslösung zu jedem Rohr hinzu und verwenden Sie eine Pipette, um jeden Rohrinhalt gründlich zu mischen, bis homogene Lösungen erreicht sind, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden.Als nächstes, sorgfältig laden 95 Mikroliter jeder Lösung in der Nähe der Wand der einzelnen Brunnen einer schwarzen Boden, unbehandelt 96 Brunnenplatte, sorgfältig darauf achten, Blasen zu vermeiden. Wenn alle Lösungen hinzugefügt wurden, bedecken Sie die Platte und überprüfen Sie den Deckel visuell auf Stiftmarkierungen oder Staub, der Messartefakte einführen kann. Um die Software für die Nukleaseaktivitätsmessung einzurichten, öffnen Sie ein geeignetes Erfassungssoftwareprogramm.Wählen Sie Jetzt lesen aus dem Task-Manager-Fenster aus, und wählen Sie Neu aus, um das kinetische Messprotokoll zu erstellen. Klicken Sie auf Temperatur festlegen, um 37 Grad Celsius auszuwählen und die Einstellungen zu bestätigen und zu speichern, indem Sie auf OK klicken. Klicken Sie auf Kinetik starten. Wählen Sie im Popupfenster zwei Stunden im Eingabefeld Laufzeit und zwei Minuten im Intervalleingabefeld aus, bevor Sie auf OK klicken, um die Einstellungen zu bestätigen und zu speichern.Klicken Sie auf Lesen. Wählen Sie im Popupfenster Fluoreszenzintensität als Erkennungsmethode, Endpunktkinkinetik als Lesetyp und Filter als Optiktyp aus. Klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie im Popup-Fenster aus dem Filtersatz Grün aus, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie im Fenster Prozedur die Option Deckel verwenden aus, und klicken Sie auf Überprüfen.Es wird ein Popupfenster angezeigt, das bestätigt, dass das erstellte Protokoll gültig ist. Wählen Sie im Menü Protokoll prozeduraz. Definieren Sie im Fenster Prozedur die zu messenden Bohrungen, und geben Sie den Namen des Experiments in das Eingabefeld Dateiname ein.Dann laden Sie die Platte in den Plattenleser, wobei Sie darauf achten, dass sich die Platte in der richtigen Ausrichtung befindet, und klicken Sie auf die Schaltfläche Neu lesen, um mit der Erfassung zu beginnen. Öffnen Sie für die Datenanalyse die Daten in der entsprechenden Analysesoftware, und wählen Sie eine der gemessenen Bohrungen in einem Fenster auf der Platte aus. Klicken Sie auf Brunnen auswählen und schließen Sie alle gemessenen Brunnen in das Fenster Brunnenauswahldialog ein, bevor Sie auf OK klicken. Wählen Sie dann Daten in einem Fenster auf der Platte aus, um die tabellarischen Ergebnisse zu visualisieren, und klicken Sie auf QuickExport, um die Daten in eine Kalkulationstabelle zu exportieren.Beschriften Sie in einer Kalkulationstabelle die Datenspalten als für jede Probe und Sonde geeignet, und zeichnen Sie die relativen Fluoreszenzeinheiten im Vergleich zur Zeit für die Daten zum Generieren kinetischer Diagramme. In diesem repräsentativen Experiment berichteten die Salmonella-Kulturüberfälle nach der ersten Screening-Runde von einer klaren Präferenz für RNA-Sonden gegenüber den DNA-Sonden. Basierend auf der Identifizierung von RNA als bevorzugtem Nukleinsäuretyp durch Salmonella-Nukleasen soll eine neue RNA-Bibliothek in der zweiten Screening-Runde verwendet werden.Im Gegensatz dazu zeigten E.Coli in Kulturmedium-Kontrollen eine sehr begrenzte Fähigkeit, RNA-Sonden zu degradieren. Nach einer zweiten Screening-Runde mit chemisch modifizierten Nukleotiden zur Erhöhung der Spezifität der RNA-Sonden konnten RNA pyrimidin 2'O-Methyl und RNA Purin 2'O-methyl anhand ihrer chemischen Modifikationen als das leistungsstärkste kinetische Verhalten im Vergleich zu den RNA Pyrimidin 2'fluoro bzw. RNA Purin 2'fluoro identifiziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Salmonellen eine wichtige RNAse-Aktivität mit Differentialsubstratchemie bevorzugt haben, die für die Auswahl von Sonden verwendet werden kann, die diese Bakterien spezifisch erkennen können.Dieses Verfahren ermöglicht die Auswahl von Sonden, die nuklease-Aktivitäten im Zusammenhang mit Krankheitszuständen wie Krebs oder bakteriellen Infektionen identifizieren können, was die Entwicklung neuer klinischer Diagnoseinstrumente ermöglicht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Bestimmung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins, um das Biotin-markierte dsRNA-Substrat abzuwickeln. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Analyse der elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung identifiziert, gefolgt von einem Chemilumineszenz-Assay mit chemilumineszierendem Enzym-konjugiertem Streptavidin.

Messung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins mit Hilfe von Biotin-markierten RNA-Duplexen

Exonukleasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genomstabilität. Der Verlust der WRN-Exonuklease-Funktion führt zu vorzeitiger Alterung. Die Untersuchung von Substraten und anderen Anforderungen an die Nuklease in vitro kann helfen, ihre Rolle in vivo aufzuklären. Hier demonstrieren wir einen schnellen und reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Messung seiner Nukleaseaktivität.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

Wir beschreiben sensitive, gelbasierte diskontinuierliche Assays, um die Kinetik der Verzögerungsstranginitiierung mit den Replikationsproteinen des Bakteriophagen T7 zu untersuchen.

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

NMR-basierte Aktivitätsassays wurden entwickelt, um Inhibitoren von zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen zu identifizieren und zu charakterisieren. Es werden Protokolle für anfängliche zusammengesetzte Assays mit 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen bereitgestellt.

NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

In dieser Studie wird ein einfacher, benutzerfreundlicher ratiometrischer FRET-Assay für den Nachweis und die quantitative Beurteilung der DNase-Aktivität vorgestellt und seine Anwendung bei der Analyse einer schwachen Nuklease demonstriert.

Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

Dieses Protokoll beschreibt einen biochemischen Gel-Shift-Assay zur Messung der FEN1-Aktivität (Flap-Endonuklease 1) und der Inhibitorentwicklung.

Fluoreszenzbasierter Nachweis der FEN1-Nukleaseaktivität und Screening von niedermolekularen Inhibitoren

Lernen Sie ein kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität als Biomarker für Krankheiten mit flexiblen Nukleinsäuresonden. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht Forschern die Identifizierung bekannter und unbekannter Nuklease-Aktivitäten.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

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