T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments ist es, die Gesamtform von Proteinkomplexen zu bestimmen. Dies wird durch die Erfassung von massenspektrometrischen Eisenmobilitätsdaten für Proteinkomplexionen und die Messung der Driftzeitwerte jedes Ladungszustands erreicht. In einem zweiten Schritt werden die experimentellen Bedingungen validiert, um Mobilitätsmessungen von nativen Proteinstrukturen zu gewährleisten.

Anschließend werden die gemessenen Driftzeitwerte mit den Querschnittsflächen korreliert. Die Ergebnisse bestimmen die Kollisionsquerschnittswerte von Proteinen oder Proteinkomplexen mit unbekannten dreidimensionalen Strukturen. Diese Informationen geben Aufschluss über die Gesamtform, die Packung von Untereinheiten und die Topologie.

Hallo, ich bin Isaac Leski aus dem Labor von Mic, Abteilung für Biologische Chemie am Wiseman Institute of Sciences, und ich bin Naam Kirschenbaum, ebenfalls aus dem Labor von mi. Heute zeigen wir ein Verfahren zur Messung von Kollisionsquerschnittsproteinkomplexen mit Hilfe von Hybrid-Massenspektrometrie und Instrumenten zur Eisenmobilität. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Gesamtform und Organisation von Proteinkomplexen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Im Fokus dieses Verfahrens stehen die Eisenmobilität, die Massenspektrometrie oder die IMM MS-Analyse von Proteinkomplexen. Die Schritte der Probenvorbereitung, die Instrumentenkalibrierung und die MS- und Tandem-MS-Optimierungsverfahren werden in einem zugehörigen JO-Protokoll demonstriert.

Im Allgemeinen beinhaltet dieses Protokoll niedrige mikromolare Konzentrationen des Komplexes in einem flüchtigen Puffer wie Ammoniumacetat. Angesichts der Tatsache, dass ein bis zwei Mikroliter pro Nanofluss verbraucht werden, bereiten die Kapillaren mindestens 10 bis 20 Mikroliter vor, um eine Optimierung der MS-Bedingungen zu ermöglichen. Um dieses Verfahren zu starten, stellen Sie das Wanderwellen- oder T-Wellen-Synap IMMS auf die folgenden Betriebsmodi ein: Mobilität tof, in dem die Triwelle und die Drücke automatisch sowohl für IM als auch für die Flugzeittrennung von Ionen eingestellt werden, positive Ionenerfassung und V-Modus, Einstellen des Weges der Ionen durch das Flugrohr und Reflexion, Einschalten aller Gase hier.

Stickstoff wird für die IM-Trennung und Argon für den Fallen- und Transferbereich verwendet. Empfohlene Anfangswerte sind ein Gasfluss von 24 Millilitern pro Minute für das IMS-Gerät und 1,5 Milliliter pro Minute für den Fallenbereich. Legen Sie als Nächstes den Erfassungsbereich des Mastladungsverhältnisses für einen unbekannten Proteinkomplex fest.

Verwenden Sie zunächst einen weiten Massenbereich, der dann auf die gewünschten Werte reduziert werden kann, passen Sie das MS-Profil entsprechend an. Für eine maximale Übertragungseffizienz für große Komplexe sollte der Erfassungsmassenbereich von 1030 bis 2000 MA Ladeverhältnis und das MS-Profil auf auto eingestellt werden. Andernfalls kann das Profil gemäß dem gezeigten Diagramm eingestellt werden.

Überprüfen Sie die HF-Einstellung und stellen Sie gegebenenfalls die Werte ein, die für große Proteinkomplexe geeignet sind, wie gezeigt. Laden Sie als Nächstes die Probe, legen Sie eine Kapillarspannung und einen niedrigen Nano-Durchflussdruck an. Versuchen Sie nach Beginn des Sprühens, den Nano-Strömungsdruck auf einen minimalen Wert zu reduzieren.

Passen Sie außerdem die Position der Kapillare in Bezug auf den Kegel an, passen Sie die MS-Erfassungsparameter an, um ein gut aufgelöstes MS-Spektrum zu erfassen. Optimieren Sie den Druckgradienten entlang des Instruments und des Probenahmekegels sowie die möglichen Einstellungen der Extraktionskegel-Bias-Falle und des Transfers, wie im zugehörigen JoVE-Protokoll beschrieben. Obwohl diese Parameter probenabhängig sind, sind hier die Bedingungen aufgeführt, die für die Aufnahme von MS-Spektren verschiedener Eisenmassen von Peptid- bis Proteinkomplexen verwendet werden.

Große Ionen erfordern höhere Kollisionsenergien und Vorspannungen. Es wird auch empfohlen, den Gegendruck für die Analyse großer Proteinkomplexe zu erhöhen, um die Aktivierung des Komplexes zu minimieren. Versuchen Sie, die Spannungen für die Probenzapfenextraktion, die Konusfalle und die Vorspannung schrittweise in Schritten von etwa 10 Volt zu reduzieren, ohne die Position des Peaks zu ändern.

Sobald ein optimales Massenspektrum erreicht ist, sollte die Driftzeit oder das IM-Profil bei der Analyse von Proteinanordnungen angepasst werden. Optimale Bedingungen sowohl für Massen- als auch für Mobilitätsmessungen sind oft nicht kompatibel. Daher ist es wichtig, das richtige Gleichgewicht zwischen den beiden zu finden.

Insgesamt sollte das Diagramm der Eisenmobilität so optimiert werden, dass die Peaks über den gesamten Driftzeitraum verteilt sind und das Peakprofil glatt ist. Bei Annäherung an eine gianische Verteilung kann eine signifikante Peak-Asymmetrie mit einer schlechten Trennung mehrerer Konformationen in Verbindung gebracht werden: Die T-Wellengeschwindigkeit, die T-Wellenhöhe und die IMS-Gasdurchflussrate können abgestimmt werden, um die Mobilitätstrennung zu optimieren. Durch Erhöhen der T-Wellengeschwindigkeit wird das Driftzeitverteilungsprofil erweitert.

Während erhöhte T-Wellen-Höhenwerte es verengen, verschiebt eine Erhöhung des IMS-Gasflusses ab einem Minimum von 10 Millilitern pro Minute das Driftzeitprofil in Richtung höherer Werte, was zur Optimierung des Eisenmobilitätsspektrums beiträgt. Indem Sie zwei der drei Variablen festlegen und die dritte optimieren, stellen Sie die T-Wellengeschwindigkeit auf 250 Meter pro Sekunde und den Gasfluss auf 24 Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie dann als Ausgangspunkt die Höhe auf drei Volt ein und erhöhen Sie sie schrittweise in Schritten von einem Volt.

Bei der Verwendung von hohen Vorspannungen empfiehlt es sich, den IMS-Gasdruck zu reduzieren und auf diese Weise die Abnahme der Vorspannung zu ermöglichen. In der Folge werden komplexe Aktivierungen und Dissoziationen reduziert. Ein Rollover-Effekt kann auftreten, wenn die Bedingungen nicht optimiert sind, was sich als identischer Peak im ersten Teil des Drift-Zeit-Spektrums und der Tailing-Kante bemerkbar macht.

Wenn die Ionen das IAM-Gerät nicht durchlaufen, kann ihre Reise länger dauern als die Zeit, die benötigt wird, bis das nächste Eisenpaket in die Mobilitätszelle freigesetzt wird. Infolgedessen wird ein neues Ionenbündel aus der Fallenregion freigesetzt, bevor das vorherige Paket an die Pusher-Region geliefert wurde. Um dieses Artefakt zu beseitigen, erhöhen Sie die T-Wellenhöhe und verringern Sie die T-Wellengeschwindigkeit und den IMS-Druck.

Zusätzlich kann die Auslösezeit der Falle eingestellt werden. Darüber hinaus ist es wichtig zu überprüfen, ob die Übertragungs-T-Wellenhöhe auf mindestens fünf Volt eingestellt ist. Auch um das Austreten von Ionen in Richtung der IMS-Zelle zu verhindern.

Die Höhe der Mobilitätsfalle sollte auf einem maximalen Niveau gehalten werden. Niedrige Geschwindigkeit und hohe Amplitude der T-Transferwellen können zu einer Kräuselung des Driftzeitverteilungsprofils führen. Dieses Artefakt tritt auf, wenn der Mobilitätsabstand der Ionen aufgrund der teilweisen Synchronisation zwischen der Pusha-Frequenz und der T-Wellengeschwindigkeit des Transfers durch die Transfer- und Zählbereiche nicht aufrechterhalten wird.

Um diesen Effekt zu eliminieren, sollte entweder die Pusher-Zeit oder die Übertragungsgeschwindigkeit der T-Welle eingestellt werden. Da die Pusha-Frequenz mit dem Massenbereich zusammenhängt, kann dieses Artefakt wieder auftreten. Wenn dieser Parameter geändert wird.

Die Höhe der T-Welle hat einen geringen Effekt. Seine Reduzierung kann jedoch auch dazu beitragen, Wellen zu beseitigen. Sobald die oben genannten Parameter optimiert sind, können die IMMS-Daten erfasst werden, um eine hohe Auflösung zu erreichen.

Frau. Peaks-Proteinkomplexe werden oft im Massenspektrometer aktiviert, um das Entfernen von Restwasser und Pufferkomponenten zu fördern. Wird die Aktivierungsenergie jedoch über einen Schwellenwert hinaus erhöht, kann es zu einer partiellen Entfaltung kommen, bei der mehrere Zwischenzustände gebildet werden, die wahrscheinlich nicht der nativen Lösungszustandsstruktur entsprechen. Infolgedessen kann der Driftzeit-Peak verschoben und verbreitert werden, was die wasserstoffhaltige Population der ungefalteten Strukturen widerspiegelt.

Um Driftzeitdaten zu erhalten, die mit Lösungsphasenstrukturen konsistent sind, ist es wichtig, die Spannungen, die zur Beschleunigung von Ionen vor der IM-Trennung verwendet werden, sorgfältig zu kontrollieren, daher die Kapillar- und Kegelspannung schrittweise zu erhöhen und gleichzeitig die Auswirkungen auf das Driftzeitspektrum zu überwachen. Darüber hinaus ist es für eine hohe MS-Auflösung vorzuziehen, die Übertragungsspannung anstelle der Trap-Spannung zu erhöhen. Das IM-Gerät wird zuerst positioniert, gefolgt von der Transferregion und dem TOF-Analysator.

Da die Aktivierung auf die IM-Messung folgt, bleiben sie für IM unbeeinflusst, während die MS-Genauigkeit erhöht werden kann, um sicherzustellen, dass die Datenerfassung unter Bedingungen durchgeführt wird, die die native Struktur des Komplexes beibehalten, ist es wichtig, Daten über eine Reihe von Versuchs- und Lösungsbedingungen zu sammeln, anstatt sich an einen einzigen optimierten Satz von Parametern zu halten. Erhöhen Sie daher die Trap-Kollisionsspannung schrittweise und erfassen Sie Daten in 10-Volt-Intervallen, während Sie die Auswirkungen auf das Mobilitätsprofil des Eisens überwachen. Um schließlich die entfalteten Bestätigungen zu identifizieren und die erfassten Daten manuell zu bewerten, die Dissoziation des Proteinkomplexes durch Titration der Probe mit Essigsäure über einen pH-Bereich von zwei bis sieben zu induzieren und die Daten aufzuzeichnen, fahren Sie mit der Analyse der Daten im T-Wellen-IMS-System fort, wobei die Querschnittsbereiche durch einen Driftzeit-Kalibrierungsansatz definiert sind, unter Verwendung von Cain-Proteinen mit bekannten Querschnittswerten.

Bereiten Sie zunächst denaturierte Proteinlösungen mit je 10 Mikromolaren vor. Verwenden Sie Pferde-Cytochrom C-Pferd, Herz-Myoglobin und Rinder-Ubiquitin in 49, 49 0,2 Volumenverhältnis Wasser-Methanol-Essigsäure. Erfassen Sie als Nächstes IMMS-Daten für die Kaliberproteine unter genau den gleichen Gerätebedingungen, die für das Zielprotein oder den Proteinkomplex verwendet werden, und halten Sie alle Spannungen und Druckwerte identisch, um die IM-Trennungseinstellungen beizubehalten.

Extrahieren Sie nach dem Erfassen der Daten den Wert der experimentellen Driftzeit für jede Ladung. Der Zustand der Cain-Proteine korrigiert jedes der Kaliberdrift mal T prim D mit der folgenden Gleichung, wobei MOVZ das Hauptladungsverhältnis des beobachteten Ions und C der erhöhte EDC-Verzögerungskoeffizient des Tastverhältnisses ist. Sein Wert, typischerweise zwischen 1,4 und 1,6, ist instrumentenabhängig.

Der EDC-Wert wird in den Erfassungseinstellungen des Systems angezeigt, eine Registerkarte für die Erfassungseinrichtung, um jeden Kaliberquerschnitt sowohl für den Eisenladungszustand als auch für die reduzierte Masse zu korrigieren. Dabei ist Omega C der korrigierte Querschnitt, Omega der Literaturquerschnitt Z die Eisenladung. Zustand M ist das Molekulargewicht des Cain-Ions und MG ist das Molekulargewicht des Eisens.

Hintergrundgas, das typischerweise Stickstoff ist, ploppt Thelan von T prim D gegen Thelan von Omega C. Die resultierende Kurve entspricht der folgenden Gleichung. Die Parameter X und A können extrahiert werden, indem das Diagramm an eine lineare Beziehung angepasst wird. Die Steigung X entspricht dem exponentiellen Proportionsfaktor, und A stellt die Konstante für die ermittelte Anpassung dar.

Berechnen Sie den Anpassungskorrelationskoeffizienten R zum Quadrat. Zulässige Werte für R zum Quadrat sind größer als 0,95. Ein niedrigerer Korrelationskoeffizientenwert kann auf eine unvollständige Entfaltung des Proteins und die Alterung der Probe zurückzuführen sein.

Unterschiedliche experimentelle Bedingungen für die Proteine unterschiedlicher Kaliber, verrauschtes Spektrum und unvollständige Verarbeitung der Daten oder Berechnungsfehler. Korrigieren Sie die ca-Driftzeit mit dem ermittelten Exponentialfaktor X und validieren Sie Ihre Berechnungen, indem Sie Omega C gegen T Primzahl D aufteilen.Definieren Sie erneut den Korrelationskoeffizienten. Höhere Werte als 0,95 sind ähnlich wie in den zuvor beschriebenen Schritten zu erwarten, korrigieren Sie die gemessene Driftzeit des Zielproteins oder Proteinkomplexes und kalibrieren Sie die Driftzeit des Zielproteins oder Proteinkomplexes unter Verwendung des berechneten Exponentialfaktors X.Berechnen Sie das Omega des Zielproteins oder Proteinkomplexes unter Verwendung der durch die Anpassung bestimmten Konstante A, wobei Omega gleich einem TD ist. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Versuchsbedingung.

Bei der Definition der Querschnittsfläche des unbekannten Proteins oder Proteinkomplexes empfehlen wir, jedes Experiment mindestens dreimal zu wiederholen und die Standardabweichung dieser dreifachen Messungen zu bestimmen, sobald die Kollisionsquerschnittswerte bestimmt sind. Modellierungsansätze werden eingesetzt, um die Topologie oder Anordnungen des Komplexes vorherzusagen. Dies geschieht durch die Anpassung der experimentellen Kollisionsquerschnittswerte an silico Omega-Werte, die aus generierten Modellstrukturen berechnet wurden. Dieses Gebiet befindet sich noch in den Kinderschuhen und muss weiter entwickelt werden, um diesen Ansatz generisch und auf eine Vielzahl von Komplexen anwendbar zu machen.

ist eine Oberflächendarstellung der tetrameren Form des bovinen Hämoglobins dargestellt. Der Sauerstofftransporter Hämoglobin-Komplex kann als Beispiel für den oben genannten Ansatz dienen. Hämoglobin ist ein tetramerer Proteinkomplex, der aus zwei Alpha- und zwei Beta-Untereinheiten besteht, die blau bzw. rot gefärbt sind und ein Dimer von Alpha-Beta-Dimeren bilden.

Hier ist das IMMS-Spektrum des Hämoglobins dargestellt. Das erfasste IM-ms-Spektrum des Komplexes zeigt eine Hauptladungsreihenverteilung, die dem intakten Komplex und den Nebenladungsreihen entspricht, die den Massen des alpha-beta-Dimers und der alpha- und beta-monomeren Untereinheiten entspricht. Die theoretische und gemessene CCS der verschiedenen Formen von Hämoglobin ist hier dargestellt.

Zur Berechnung der Omega-Werte wurden Driftzeitwerte verwendet, die für mehrere Ladungszustände der dimeren und tetrameren Formen abgerufen wurden. Diese wurden mit den theoretischen Werten verglichen. Da ein tetramerer Komplex drei Assoziationsmöglichkeiten hat, entweder zyklische dihedrale oder kettenartige Packungen.

Durch die Berechnung des Anstiegs von Omega beim Übergang von einem Dimer zu einem Tetramer kann die strukturelle Organisation vorhergesagt werden. Frühere Studien und unsere eigenen Experimente haben eine starke Korrelation zwischen gemessenem ccss und Proteinoberflächen gezeigt, die aus kristallstrukturierten Daten abgeleitet wurden. Diese Korrelation kann verwendet werden, um die erwartete Zunahme der Oberfläche eines Tetramers im Vergleich zu einem Dimer für die verschiedenen Packungsformen zu berechnen.

Dies geschieht unter Berücksichtigung jeder asphärischen Untereinheit. Eine kettenartige Anordnung erhöht das Tetramer CCS etwa um das Doppelte, während eine C-, Vier- oder D-Zwei-Packung eine Zunahme von etwa 1,5 bzw. 1,67 ergibt. Das berechnete Verhältnis zwischen den gemessenen CCS-Werten der tetrameren und DME-Form des Hämoglobins betrug 1,57 plus oder minus 0,03.

Diese Zahl verdeutlicht, dass die native Struktur nicht linear organisiert ist, sondern in einer kompakteren Form angeordnet ist, entweder als zyklisches oder dihedrales Tetramer. Bei der Wiederholung der gleichen Berechnung für die aufgelöste Kristallstruktur des Hämoglobins betrug das Verhältnis der Oberflächen von tetrameren zu DME-Formen 1,63, was einer D-Zwei-Symmetrie entspricht. Offensichtlich wurde dieses geometrische Modell vereinfacht und Proteinuntereinheiten sind nicht nur kugelförmig.

Diese Berechnung zeigt jedoch das aufregende Potenzial, das IMMS für die Aufdeckung der Packung von Komplexen mit unbekannten hochauflösenden Strukturen birgt. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man die Driftzeit des Proteins und Proteinkomplexe misst und wie man ihre Kollisionsquerschnittswerte berechnet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die IMMS-Daten für die Kaliberproteine unter genau den gleichen Bedingungen zu erfassen, die für das Zielprotein oder die Proteinkomplexe gelten.

Darüber hinaus empfehlen wir dringend, diese Experimente mindestens dreimal zu wiederholen und die Standardabweichung dieser dreifachen Messungen zu bestimmen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.