Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie

Dieses Protokoll wurde für zelluläre Proben standardisiert, so dass Experimente an verschiedenen Synchrotronstandorten verglichen werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein einfacher und unkomplizierter Workflow, der eine schnelle und zuverlässige Konservierung der chemischen Integration der Probe ermöglicht. Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, können mit der Pelletierung der gefrorenen iterierten Zellen und dem schnellen Laden des Zellpellets in die Kryoprobenordnung zu kämpfen haben.

Eine präzise und schnelle Entlinkung einer Probe bei kryogener Temperatur ist entscheidend. Daher ist eine visuelle Demonstration unerlässlich, um zu verstehen, wie die Technik ausgeführt wird. Um menschliche Prostata- und Eierstockkrebs-Zelllinien-Zellpellets für die Selenspeziation vorzubereiten, legen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen aus jeder Zelllinie in drei T-75-Kolben pro Zustand im entsprechenden Zellkulturmedium in einer laminaren Durchflusshaube und legen Sie die Kolben in einen Zellkultur-Inkubator von 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, bis die Zellen zu 80% konfluent sind.

Um die Krebszellen einer Selenbehandlung auszusetzen, beschallen Sie zunächst frisch zubereitete Nanopartikel-Stammlösungen in einem Ultraschallwasserbad für 30 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie die Selen-Nanopartikellösung in vollständigem Zellkulturmedium auf die entsprechenden Arbeitskonzentrationen verdünnen. Waschen Sie in der Laminar-Flow-Haube die Zellen vorsichtig zweimal mit fünf Millilitern von 37 Grad Celsius PBS pro Waschgang und verwenden Sie eine sterile 25-Milliliter-Pipette, um vorsichtig 15 Milliliter der interessierenden Selenbehandlung auf den Boden des Kolbens zu geben. Schließen Sie die Deckel, ohne den Kolben vollständig zu versiegeln, und legen Sie die Kolben 24 Stunden lang horizontal in den Zellkulturinkubator.

Um die Zellpellets nach dem Waschen und Auffüllen des Kulturmediums vorzubereiten, verwenden Sie einen Zellenschaber pro Kolben, um die Zellen vorsichtig zu lösen. Verwenden Sie Medium, um alle am Kolben haften Zellen in den Überstand zu spülen und die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Waschen Sie die Pellets zweimal in fünf Millilitern PBS pro Röhrchen pro Waschgang, um alle verbleibenden Spuren der Behandlung zu entfernen und die Zellen in einem Milliliter PBS zu resuspendieren.

Geben Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen und sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipette, um den gesamten Überstand vorsichtig zu entfernen und den unteren Teil jedes 1,5-Milliliter-Rohrs in flüssigen Stickstoff auf das Niveau des Zellpellets zu tauchen. Unmittelbar nach dem Einfrieren die Röhrchen zur Langzeitlagerung in einen flüssigen Stickstoff-Dewar überführen.

Für eine hochauflösende Röntgenabsorptionsspektroskopie optimieren Sie alle Kristalle des Kristallanalysatorspektrometers unter Bragg-Bedingungen in Bezug auf die interessierende Fluoreszenzlinienenergie und verwenden Sie eine Referenz, für die die Energieposition der Absorptionskante bekannt ist, um die einfallende monochromatische Strahlenergie zu kalibrieren. Geben Sie den Probenhalter für biologische Proben in einen flüssigen Helium-Kryostaten und stellen Sie den Kryostaten auf 10 Grad Kelvin ein, schließen Sie dann den Versuchsstall gemäß den Synchrotron-Sicherheitsregeln und beginnen Sie mit der Analyse. Hier zeigen repräsentative hochauflösende Röntgenabsorptionsspektroskopiespektren des Selens im Anfangszustand und in Zellen, die auf Nährmedium inkubiert wurden, dass das Selen in den ursprünglichen Selennanopartikeln sowohl als Selennull- als auch als Cellulite-ähnliche Formen vorlag.

Nach Interaktionen mit den PC3-Zellen war das Selen jedoch hauptsächlich als Selennull in den Zellen vorhanden, was eine Veränderung der Selenspezies innerhalb der Zellen zeigt. Für Eisen weisen hochauflösende Röntgenabsorptionsspektroskopie-Referenzspektren je nach Eisenoxidationsstufe unterschiedliche Kantenpositionen auf, wobei reduzierte Eisenspezies auf niedrige Energiewerte verschoben werden. Zwei aufeinanderfolgende Spektren, die an der gleichen Position eines Kieselalgenpellets gesammelt wurden, waren ähnlich, was darauf hindeutet, dass der Strahlschaden zwischen zwei Akquisitionen begrenzt war, wenn ein Helium-Kryostat bei 10 Kelvin verwendet wurde.

Darüber hinaus waren Spektren aus verschiedenen Positionen des Kieselalgenpellets identisch, was zeigt, dass das Probenpellet homogen war und dass die Spektren gemittelt werden konnten, um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnisspektrum zu erhalten. Die kritischsten Schritte sind die Vorbereitung des Nanopartikeldiltuions, die Pelletierung bei kryogener Temperatur und die Aufbereitung der Standardreferenzproben. Dieses Verfahren kann auf andere Massenanalysetechniken wie ICP-MS oder HPLC-ICP-MS oder andere nicht-synchrotronspektroskopische Techniken angewendet werden, die bei kryogener Temperatur durchgeführt werden können.

Andere wissenschaftliche Fragen können mit diesem Verfahren untersucht werden, insbesondere in den Bereichen Biogeologie, Biochemie und Umweltwissenschaften oder toxikologische Forschung. Selenverbindungen und Selen-Nanopartikel können für Ihre Gesundheit ebenso anstrengend sein und sollten in einer speziellen chemischen Kapuze mit Handschuhen, Brillen und einer Gesichtsmaske manipuliert werden.