Name: Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen des Zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Lernen Sie die Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen im EAE-Mausmodell. Dieses Protokoll ermöglicht eine detailliertere Charakterisierung der Multiplen Sklerose-Pathologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. Raymond Sobel (Stanford University) für seine Methode, Gehirn- und Rückenmarksschnitte zu groben und zu fixieren. Wir danken Kyle Roberton und Milan Ganguly vom Toronto Centre for Phenogenomics für das Erlernen der Einbettungsmethode und dafür, dass sie so viele unserer Gehirn- und Rückenmarksabschnitte durchtrennt haben. Wir danken Dr. Matthew Cussick und Dr. Robert Fujinami (University of Utah) für die Bereitstellung ihrer Protokolle zur Bewertung submeningealer und perivaskulärer Entzündungen im Rückenmark. Wir danken Shalina Ousman für die Bereitstellung des Klons des CD45-Antikörpers. Wir danken Xiofang Lu für die Schulung am Gewebeprozessor und an der Gewebeeinbettungsstation sowie für die Wartung dieser Geräte im Keenan Research Centre of Biomedical Research am St. Michael's Hospital. Diese Arbeit wurde durch ein biomedizinisches Stipendium von MS Canada (an SED) unterstützt. Carmen Ucciferri wird durch ein Stipendium der kanadischen Regierung unterstützt. Nuria Alvarez-Sanchez wird durch ein Keenan-Postdoktorandenstipendium unterstützt.

Histologische Färbung des Rückenmarks zur Beurteilung des Schweregrads der EAE-Erkrankung

<ol><li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+a+model+for+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li>
<li>Rasouli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GM-CSF+in+T+is+increased+in+multiple+sclerosis+and+suppressed+by+IFN-beta+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy.</a> J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).</li>
<li>Zrzavy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+%27homeostatic%27+microglia+and+patterns+of+their+activation+in+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis.</a> Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+multiple+sclerosis+and+related+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases.</a> Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).</li>
<li>Glatigny, S., Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+animal+models+of+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS).</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).</li>
<li>Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+animal+models%3A+A+clinical+and+histopathological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective.</a> Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Croxford, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+GM-CSF+the+inflammatory+signature+of+CCR2%2B+monocytes+and+licenses+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity.</a> Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).</li>
<li>Jones, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+pathological+outcomes+in+MOG+35-55+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).</li>
<li>Zuo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+gray+matter+demyelination+is+associated+with+leptomeningeal+neutrophil+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation.</a> JCI Insight. 7 (12), 158144(2022).</li>
<li>Bannerman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+pathology+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%3A+Studies+in+thy1-yfp+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice.</a> Brain. 128, 1877-1886 (2005).</li>
<li>Cahill, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+hind-limb+clasping+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models+aspects+of+the+neurodegenerative+process+seen+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).</li>
<li>Drohomyrecky, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+acts+within+peripheral+myeloid+cells+to+limit+the+expansion+of+myelin-reactive+T+cells+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).</li>
<li>Osorio-Querejeta, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innovative+animal+monitoring+device+for+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28%26%2334%3BI+am+D+EAE%26%2334%3B%29%3A+A+more+detailed+evaluation+for+improved+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis (&#34;I am D EAE&#34;): A more detailed evaluation for improved results.</a> Mult Scler Relat Disord. 63, 103836(2022).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+diverse+assessment+indicators+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. (187), e63866(2022).</li>
<li>Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+disease+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+using+a+novel+infrared-based+automated+activity-monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system.</a> Sci Rep. 9, 19194(2019).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light%3A+A+biomarker+of+neuronal+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).</li>
<li>Novakova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+disease+activity+in+multiple+sclerosis+using+serum+neurofilament+light+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein.</a> Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).</li>
<li>Pouzol, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Act-1004-1239%2C+a+first-in-class+CXCR7+antagonist+with+both+immunomodulatory+and+promyelinating+effects+for+the+treatment+of+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases.</a> FASEB J. 35 (3), 21431(2021).</li>
<li>Breakell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obinutuzumab-induced+B-cell+depletion+reduces+spinal+cord+pathology+in+a+CD20+double+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6864(2020).</li>
<li>Aharoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+glatiramer+acetate+on+neurofilament+light+chain+leakage+and+glutamate+excess+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (24), 13419(2021).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Mouse spinal brain map. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html">Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html</a> (2023).</li>
<li>Kuhle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+is+associated+with+progression+of+brain+atrophy+and+disability+in+early+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS.</a> Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).</li>
<li>Benkert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light+chain+for+individual+prognostication+of+disease+activity+in+people+with+multiple+sclerosis%3A+A+retrospective+modelling+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study.</a> Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).</li>
<li>D'Souza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGR1%2FGPR68+modulates+the+severity+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+regulates+nitric+oxide+production+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages.</a> PLoS One. 11 (2), 0148439(2016).</li>
<li>Imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html">Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html</a> (2023).</li>
<li>Openmicroscopy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads">Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads</a> (2023).</li>
<li>Doroshenko, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+deficiency+in+microglia+results+in+exacerbated+axonal+injury+and+tissue+loss+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 12, 570425(2021).</li>
<li>Soulika, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+progression+of+axonopathy+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
</ol>

Shannon Dunn berät FSD Lucid Psycheceuticals.

Die histologische Färbung des Rückenmarks ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung des Schweregrads der EAE-Erkrankung, insbesondere in Fällen, in denen es Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen im Ausmaß der Genesung der Erkrankung in der postakuten Phase der Erkrankung gibt. Die Färbung auf Immunzellinfiltration (CD45), Myelin (LFB) und axonale Schädigung (SMI-32) hilft dabei, die zugrunde liegende Ursache für die veränderten klinischen Werte bei Mäusen zu charakterisieren. Das hier beschriebene histologische Färbeprotokoll gibt einen Überblick über die Entzündung sowie das Ausmaß der Myelin- und axonalen Verletzung. Darüber hinaus validieren die gezeigten Ergebnisse die sNF-L-Messung als Methode zur Beurteilung des Ausmaßes der neuronalen Gesamtschädigung bei EAE.
Die kritischen Parameter für diese Analyse bestehen darin, sicherzustellen, dass die Forscher für die Identität der Abschnitte blind sind und dass es auf jeder Ebene des Rückenmarks gleichwertige Proben für die verschiedenen Mäuse gibt. Dies liegt daran, dass die Schwere der Entzündung auf niedrigeren Ebenen der Nabelschnur größer sein kann. Ein weiterer kritischer Parameter ist die Größe der Versuchsgruppen. Rückenmark und Gehirn werden in der Regel von 6-8 Mäusen pro Gruppe am Endpunkt entnommen, um signifikante Unterschiede zwischen Gruppen mit Behandlungen oder Genotypen mit bescheidenen Effektstärken zu sehen. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass ausgewählte Mäuse im Durchschnitt repräsentative Mittelwerte der gesamten Gruppe aufweisen. In Bezug auf die Fehlerbehebung ist ein häufiges Problem, auf das diejenigen, die mit dem Protokoll unerfahren sind, stoßen, dass das Rückenmark nicht ausreichend lange fixiert ist und nicht leicht aus der Wirbelsäule herausgepresst werden kann. Ist dies der Fall, kann das Rückenmark manuell von der Säule abgetrennt werden, indem man mit einer feinen Schere entlang der Dornfortsätze schneidet und die Säule öffnet, um das Rückenmark freizulegen. Alternativ kann das Gewebe für einige zusätzliche Tage fixiert werden, ohne den Erfolg der Antikörperfärbung zu beeinträchtigen. Die hier beschriebenen Antikörperklone wirken in Gewebe, das bis zu 2 Wochen in Formalin fixiert ist.
Das Einbetten der Rückenmarksstücke erfordert Geschick und Übung. Es wird empfohlen, Augenlupen zu tragen und eine Lampe über die Einbettstation zu richten, um besser erkennen zu können, ob die Abschnitte im Querschnitt oder im Längsschnitt fallen. Wenn Sie die Längen der Rückenmarksstücke während der Grobung auf weniger als 2 mm halten, können sie im Querschnitt fallen. Ein weiteres häufiges Problem, das bei weniger erfahrenen Anwendern auftritt, ist, dass der LFB während der nächtlichen Inkubation verdunstet, so dass die Hälfte des Objektträgers gefärbt und die andere Hälfte ungefärbt bleibt. Um Verdunstung zu vermeiden, sollte die Glasfärbeschale mit thermoplastischer Folie und anschließend mit Plastikfolie verschlossen werden. Wenn es zu Verdunstung kommt und Abschnitte ungleichmäßig gefärbt sind, empfiehlt es sich, die Objektträger mit Lithiumcarbonat vollständig zu entblauen, und über Nacht erneut in LFB zu färben. Ein weiteres häufiges Problem ist, dass Benutzer die graue Substanz nach LFB nicht vollständig entblauen. Es ist wichtig, einzelne Abschnitte unter dem Mikroskop zu untersuchen, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge an Entbrühung erreicht wurde, bevor mit anderen Schritten im Protokoll fortgefahren wird. Obwohl die CD45- und SMI-32-IHC-Färbungen robust funktionieren, ist es dennoch wichtig, die Antikörperkonzentrationen in Vorexperimenten für jede neu erhaltene Antikörpercharge zu beheben. Dies kann erfolgen, indem eine Vielzahl von Konzentrationen des Antikörpers an einem positiven Kontrollabschnitt (EAE-Rückenmark) getestet wird. Die erstmalige Färbung sollte auch eine Negativkontrolle umfassen, die nur aus einem Sekundärantikörper ohne Zusatz von Primärantikörpern besteht. Schließlich ist es bei der Bildanalyse wichtig, einzelne Bilder zu begrenzen, da die Verfärbung über Objektträger oder Abschnitte hinweg ungleichmäßig sein kann.
Dieses Protokoll verwendet frei verfügbare Software. Wenn man keinen Zugang zu einem Prozessor, einem Embedder oder Mikrotom hat, können diese Schritte an einen krankenhausbasierten Pathologiekern übergeben werden, der diese Dienste anbietet. Wenn man keinen Zugang zu einem Objektträgerscanner hat, kann man auch ein Lichtmikroskop verwenden, das mit einer Videokamera ausgestattet ist, um TIFF-Bilder des Rückenmarks oder der Gehirnregionen zu speichern. Für einen mikroskopbasierten Arbeitsablauf erfassen Sie LFB- oder LFB/H&E-Schnitte bei geringer Leistung (40-fache Vergrößerung) und für CD45- und SMI-32-Färbungen mindestens vier Fenster, die in den ventralen, dorsalen und lateralen Teilen des Rückenmarks zentriert sind (200-fache Vergrößerung für CD45 und 400-fache Vergrößerung für SMI-32). An diesen Bildern kann eine Bildanalyse durchgeführt werden, um die Färbung auf ähnliche Weise wie beschrieben zu quantifizieren.
Die Entscheidung, welcher histologische Ansatz zur Bewertung der EAE gewählt werden soll, hängt davon ab, wie stark sich die klinischen Werte zwischen den Gruppen unterscheiden. Wenn es beispielsweise drastische Unterschiede im klinischen EAE-Score gibt (eine Gruppe erhielt EAE und eine Gruppe nicht), hängt dies in der Regel mit Unterschieden in der peripher vermittelten Entzündung zusammen. In diesem Fall ist ein Scoring für das Vorhandensein von demyelinisierenden Läsionen auf LFB/H&E-gefärbten Schnitten ausreichend und zeigt Unterschiede zwischen den Gruppen auf. Wenn sich die Gruppen zu Beginn des klinischen Scores ähnlicher sind und es stattdessen Unterschiede im Ausmaß der klinischen Genesung gibt (z. B. Experiment in Abbildung 5A), ist es am besten, den hier beschriebenen vollständigen histologischen Arbeitsablauf anzuwenden, einschließlich der Bewertung der Hirnentzündung im Hirnstamm und im Kleinhirn, um zu unterscheiden, ob die Unterschiede in der Krankheitschronizität mit Unterschieden in der Entzündung oder der Gewebeschädigung zusammenhängen.  Wenn Unterschiede in der Entzündung festgestellt werden, die durch CD45-Zählung beurteilt werden, können weitere IHC-Studien durchgeführt werden, um T-Zellen (Anti-CD3), infiltrierende Monozyten/Makrophagen (Mac3) und Mikroglia (Iba-1/TMEM119) zu färben (empfohlene Antikörperklone sind in der Zusatztabelle 3 aufgeführt). Die Aktivierung der Mikroglia spiegelt sich in einer Erhöhung der Intensität der Iba-1-Färbung auf doppelt markierten Iba-1+TMEM-19+ -Mikroglia und einer erhöhten Retraktion der Mikrogliaprozesse wider, die durch die Sholl-Analyse in Sektionen32 beurteilt werden können. Darüber hinaus können Techniken wie Durchflusszytometrie oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung angewendet werden, um eine tiefere Charakterisierung der Häufigkeit und des Phänotyps von Immunpopulationen im Gehirn und Rückenmark durchzuführen.
Die Zählung von SMI-32+ Axonen ist eine empfindliche Methode zum Nachweis von Axonverletzungen in EAE32,33 und in MS34. SMI-32, das die nicht-phosphorylierte Form von Neurofilamenten erkennt, die schwer oder mittel sind, reichern sich in den Endbulben der durchtrennten Neuronen an. Eine Alternative zum Nachweis verletzter Axone ist die Färbung mit Amyloid-Vorläuferprotein (APP), das sich infolge eines gestörten Axontransports in Axonen anreichern kann33. Das Färbemuster für SMI-32 und APP überlappt sich in der Regel nicht, obwohl beide eine Axonverletzung widerspiegeln, was darauf hindeutet, dass sie unterschiedliche Pathologien erkennen33. Man kann die histologischen Messungen der Axonverletzung auch durch die Messung von sNF-L ergänzen, die ein schnelles und sensitives Maß für eine laufende axonale Verletzung sowohl im Rückenmark als auch im Gehirn ist. Es bietet den Vorteil, dass es in einem halben Tag bei lebenden Mäusen durchgeführt werden kann. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die Kits teuer sind und die Maschine hochspezialisiert ist. Das Unternehmen, das das sNF-L-Kit verkauft, bietet eine Servicegebühr für diejenigen an, die keinen Zugang zu einer SIMOA-Maschine haben. Eine Alternative zur Beurteilung der Axonverletzung besteht darin, den Axonverlust zu bewerten, indem entweder Axone in toluidinblau gefärbten Abschnitten des Rückenmarks12 gezählt werden oder Neurofilamentbündel gezählt werden, die von SMI-31 in Bereichen der weißen Substanz des Rückenmarks nachgewiesen werden32. Beides sind aufwändigere Ansätze als die SMI-32- oder sNF-L-Messung.
Wenn sich die klinischen EAE-Scores zwischen den Gruppen unterscheiden, aber das Scoring für Entzündung, Demyelinisierung und axonale Schädigung keine Unterschiede zwischen den Gruppen zeigt, kann es sinnvoll sein, die Astrozytenaktivierung mit GFAP zu färben (siehe Ergänzende Tabelle 3 für den empfohlenen Antikörperklon). Die Aktivierung von Astrozyten ist mit einer Zunahme der GFAP-Färbung verbunden, und es wurde gezeigt, dass dies mit der EAE-Progression in einigen EAE-Modellen korreliert, einschließlich chronischer EAE bei der DA-Ratte35.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll Methoden und bietet einen Analyse-Workflow zur Durchführung eines histologischen Scorings von EAE.

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das häufigste Mausmodell für die humane demyelinisierende Erkrankung Multiple Sklerose (MS)1. Die klassische MS-Entzündungspathologie, einschließlich der Infiltration von IFN-γ (gamma) und IL-17-produzierenden T-Helferzellen2, der Infiltration von entzündlichen Monozyten3, der Bildung perivaskulärer und submeningealer entzündlicher demyelinisierender Läsionen4 und des Auftretens einer Axonverletzung4 im Zentralnervensystem (ZNS), wird auch bei EAEbeobachtet 5,6,7,8,9 . Die Ähnlichkeit der Immunmechanismen zwischen EAE und MS hat die EAE zu einem geeigneten präklinischen Modell gemacht, um die Wirksamkeit und die Wirkmechanismen einer Reihe zugelassener immunbasierter Therapien für MS zu testen, darunter Natalizumab, Fingolimod, Dimethylfumarat und Glatirameracetat (siehe 1,5). Bestimmte EAE-Therapien modellieren andere Aspekte der progressiven MS-Pathologie, die über die axonale Verletzung hinausgehen, einschließlich der Entwicklung einer submeningealen Entzündung im Gehirn, chronischer Demyelinisierung, Rückenmarksatrophie, Synapse und Neuronenverlust 6,10,11,12. Daher ist EAE nützlich, um die Wirksamkeit neuroprotektiver Therapien für MS zu überprüfen.
EAE wird bei Nagetieren auf verschiedene Weise induziert. Die aktive Immunisierung ist die gebräuchlichste Induktionsmethode und beinhaltet die Immunisierung von Nagetieren mit Myelin-Antigenen (entweder ganze Proteine oder Peptide), die in CFA emulgiert sind, ergänzt mit hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis13. Je nach Mausstamm wird auch Pertussistoxin (PTX) an Tag 0 und Tag 2 der Immunisierung verabreicht, um die Penetranz der Erkrankung zu erhöhen13. EAE kann auch durch adoptive Übertragung von myelinspezifischen T-Zellen, die aus Myelin/CFA-geprimten Mäusen gewonnen wurden, in gesunde Mäuse induziert werden14 oder kann sich spontan in Mäusen entwickeln, die T-Zell-Rezeptoren überexprimieren, die für die wichtigsten Myelinantigenespezifisch sind 5.
Der Schweregrad und das Fortschreiten der EAE-Erkrankung werden in der Regel anhand einer diskreten 5-Punkte-Skala bewertet: 1 – Schwanzschlaffheit, 2 – Hinter- oder Fußschwäche, 3 – vollständige Lähmung einer oder beider Hintergliedmaßen, 4 – Schwäche der Vordergliedmaßen, 5 – todgeweiht oder tot13. Dieses klinische Scoring-System dokumentiert das Fortschreiten der aufsteigenden Lähmung, die zu Beginn der Krankheit auftritt, ist jedoch weniger empfindlich bei der Erfassung des Ausmaßes der Genesung von ZNS-Entzündungsattacken. Zum Beispiel werden sowohl Mäusen, die Schwierigkeiten beim Gehen haben, als auch Mäusen, die leicht gehen können, aber eine Schwäche beim Fassen der Füße aufweisen, eine Punktzahl von 2 auf der EAE-Skala zugewiesen. Die Werte können in der postakuten Phase der EAE aufgrund des Vorhandenseins einer dauerhaften Axonverletzung oder eines dauerhaften Axonverlusts hoch bleiben, selbst trotz des Abklingens der Entzündungsreaktion9. Es gab eine Vielzahl von Versuchen, verfeinerte Bewertungssysteme, Verhaltenstests, Messungen der Hintergliedmaßen- und Griffkraft sowie Infrarot-Überwachungssysteme zu entwickeln, um Unterschiede in den klinischen Defiziten bei EAE 9,16,17,18 besser zu erfassen; Diese komplizierteren Scoring-Messungen unterscheiden jedoch nicht zwischen dem Beitrag von Entzündungen und Gewebeverletzungen zu den zugrunde liegenden neurologischen Defiziten. Daher besteht der Goldstandardansatz zur Bewertung des Schweregrads der EAE darin, sowohl ein klinisches als auch ein histologisches Scoring durchzuführen.
Hier wird ein Protokoll beschrieben, wie Rückenmarks- und Gehirnproben von Mäusen in Paraffin so präpariert und eingebettet werden können, dass der stochastische Prozess der Läsionsbildung, der bei EAE auftritt, erfasst wird. Es wird auch ein Protokoll vorgestellt, wie Schnitte mit Luxol Fast Blue (LFB) gefärbt werden können, das ursprünglich von Kluver und Barrera19 entwickelt wurde und Myelin im ZNS nachweist. Die Schnitte werden entweder mit LFB allein gefärbt (für die Demyelinisierungsanalyse) oder mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gegengefärbt, um entzündliche Läsionen sichtbar zu machen und zu bewerten. Es werden auch Protokolle zur Quantifizierung des Vorhandenseins von Gesamtleukozyten (CD45), des Verlusts von Myelin und der Anzahl verletzter Axone (SMI-32) im Rückenmark unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper, immunhistochemischer (IHC) Techniken und öffentlich zugänglicher Software bereitgestellt. Das Protokoll zur Quantifizierung von Leukozyten im Rückenmark kann auch auf die Quantifizierung von Leukozyten im Gehirn angewendet werden.
Die histologische Beurteilung von axonalen Verlusten und Verletzungen im Gehirn ist vergleichsweise schwieriger als im Rückenmark, da die Bahnen der weißen Substanz im Gehirn nicht parallel zueinander verlaufen. Die Messung des Serum-Neurofilament-Lichts (sNF-L) hat sich als vielversprechender Biomarker für neuronale Verletzungen bei MSherausgestellt 20,21. Jüngste Studien haben diese Technologie auf EAE 22,23,24 ausgeweitet. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung des Serum-Neurofilament-Lichts (sNF-L) in lebenden Mäusen mit einem Small Molecule Assay (SIMOA) Assay vorgestellt. Diese Methode erfordert nur eine kleine Menge Serum und kann an lebenden Mäusen in nur einem halben Tag durchgeführt werden, was eine schnelle Rückmeldung darüber liefert, wie sich eine getestete Therapie auf die Gesamtschädigung des ZNS auswirkt. Alle hier beschriebenen Methoden können auf Mäuse jeden Geschlechts und Stammes angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Zur Fixierung von Rückenmarks- und Gehirnproben</td></tr><tr><td>1000 mL Glasbecher</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>Starstedt</td><td>62.554.100</td><td>Fixierung und Aufbewahrung von Rückenmark und Gehirn</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyerkolben</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Glasbecher</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>92 mm x 16 mm Petrischalen</td><td>Starstedt</td><td>82-1473-001</td><td>Wird im Verfahren zur Gewebevergrößerung</td></tr><tr><td>verwendet 95% Ethylalkohol</td><td>Kommerzielle Alkohole</td><td>P016EA95</td><td>Dehydratisierungs- und Rehydrationsschritte</td></tr><tr><td>ABC Elite Kit</td><td>Vektorlabratorien</td><td>PK6100</td><td>Wird für die immunhistochemische Markierung</td></tr><tr><td>verwendet Aqua Hold 2 PAP Pen</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-75955-53</td><td>Wird zum Zeichnen von Gewebeschnitten in der immunhistochemischen Färbung</td></tr><tr><td>Avidin/Biotin Blocking Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Beliebige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotinylierte Kaninchen Anti-Ratte IgG</td><td>Vektor Labratories</td><td>BA-4000</td><td>Verwendet für die CD45-Färbung</td></tr><tr><td>C57BL6/J Mäuse</td><td>Jackson Laboratory Stock</td><td># 664</td><td>Diese Mäuse wurden in Experimenten verwendet in Papierform dargestellt.</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST Plus</td><td></td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-121</td><td>Wird zum Entwachsen verwendet. Ist eine Alternative zu Xylol</td></tr><tr><td>DAB Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>SK-4100</td><td>Wird für die Entwicklung in der Immunhistochemie</td></tr><tr><td>verwendet ddH2O</td><td></td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Einweg-Skalpell</td><td>Magna</td><td>M92-10</td><td>Wird zum Herstellen von Rückenmark und Gehirn verwendet</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) Glasfärbeschale</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-48585-60</td><td>Wird für histochemische Färbungen und Waschungen</td></tr> verwendet<tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) Glasfärbegestell</td><td>Cole Parmer</td><td>10061392</td><td>Wird für Immunhistochemie und Histochemie</td></tr><tr><td>verwendet Eosin Y</td><td>Bioshop</td><td>173772-87-1</td><td>Färbemittel Zytoplasma</td></tr><tr><td>Federmikrotomklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-1C</td><td>Wird zum Schneiden von Paraffin</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>verwendet Whatman</td><td>1001110</td><td>Wird zum Filtern des Formalins (während des Grobens) verwendet und die Luxol Fast</td></tr><tr><td>Blue Feine Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14160-10</td><td>Wird zum Schneiden von Gehirn und Schädel</td></tr><tr><td>Fumehood</td><td>TAny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190944</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>BioShop</td><td>ACE333.4</td><td>Wird im Luxol Fast Blue Staining Verfahren verwendet</td></tr><tr><td>Histoplex Histologie Behälter</td><td>Starplex Scientific</td><td>565-060-26</td><td>Fixierung von Rückenmark und Gehirn</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Chemicals</td><td>H325-500</td><td>Wird verwendet, um endogene Peroxidase im Gewebe zu entfernen</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td>Wird für die Immunhistochemie</td></tr><tr><td>verwendet Linsenpapier</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>Wird zum Einfangen von Rückenmarksspezies in der Kassette während der Verarbeitung</td></tr><tr><td>verwendet Lichtmikroskop</td><td>Beliebiges</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lithiumcarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>554-13-3</td><td>Entbläuung nach Luxol schnelle Blaufärbung</td></tr><tr><td>Luxolblau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1328-51-4</td><td>Färbemittel ZNS-Myelin</td></tr><tr><td>M.O.M Immundetektionskit</td><td>Vektorlabratorien</td><td>BMK-2202</td><td>Verwendet zu Färbung SMI-32</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A454.2</td><td>Wird zur Fixierung</td></tr> verwendet <tr><td>Mayer's Hämatoxylin</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>26381-02</td><td>Färbekern</td></tr><tr><td>Mikro-Adson-Pinzette mit Zähnen</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td>Wird zur Reflexion des Schädels während der Dissektion</td></tr><tr><td>verwendet Mikrozentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Modell 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Microvette Kapillarröhrchen CB 300 Z</td><td>Starstedt</td><td>16.440.100</td><td>Verwendet für Blutentnahme</td></tr><tr><td>Micrscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545A</td><td>Verwendet für Deckglas</td></tr><tr><td>Mini Shaker</td><td>VWR</td><td>12620-938</td><td>Verwendet für die Herstellung von Puffern</td></tr><tr><td>NF light kit</td><td>Quanterix</td><td>103186</td><td>Dieses Kit kann für den Nachweis von löslichem Neurofilament aus der Maus oder dem Menschen in Serum verwendet werden</td></tr><tr><td>Nitrilhandschuhe</td><td>VWR</td><td>76307-462</td><td>Sicherheit</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vektor Labratories</td><td>S-1000</td><td>Blockierungsreagenz</td></tr><tr><td>Normales Kaninchenserum</td><td>Vektor Labratories</td><td>S-5000</td><td>Blockierungsreagenz</td></tr><tr><td>OmniSette Gewebekassetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4935FS</td><td>Zur Einbettung von Rückenmark und Gehirn</td></tr><tr><td>p1000 Pipette und Spitzen</td><td>diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipette und Spitzen</td><td>diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin-Einbettstation</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modell EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Gewebeinfiltration/Einbettungsmedium</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>Zur Einbettung von Rückenmark und Gehirn</td></tr><tr><td>Permount Montage Medium</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td>Wird für die Montage von Deckgläsern auf Objektträgern</td></tr><tr><td>verwendet pH-Meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>13636AB315B</td><td>Wird für pH-Puffer</td></tr> verwendet <tr><td>Kunststoff-Transferpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Wird für pH-Puffer</td></tr><tr><td>verwendet Kaliumchlorid</td><td>BioShop</td><td>7447-40-7</td><td>Wird für die Herstellung von PBS</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasig</td> <td>verwendetBioShop</td><td>7778-77-0</td><td>Wird zur Herstellung von PBS-Schnellkochtöpfen</td></tr> verwendet, <tr><td></td><td>Nordic Ware</td><td>Tender Cooker</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Ratten-Anti-Maus-CD45-Vektor-Labratories</td><td></td><td>553076</td><td>Weist Leukozyten nach,</td></tr><tr><td>Alkohol in Reagenzqualität 100%,</td> <td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Dehydratisierungs- und Rehydratisierungsschritte</td></tr><tr><td>Alkohol in Reagenzqualität 70%,</td> <td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>Dehydrierung und Rehydrationsschritte</td></tr><tr><td>Rotationsmikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modell RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Maschine</td><td>Quanterix</td><td>HD-X</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerscanner</td><td>Zeiss</td><td>AxioScan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32 Maus IgG1 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>Erkennt beschädigte Axone</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td>Wird zur Herstellung von PBS verwendet</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td>Wird für die Herstellung von PBS</td></tr><tr><td>Standard Adson-Pinzetten</td><td>verwendet Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td>Wird für Dissektionsschritte</td></tr><tr><td>verwendet Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Wird zum Sammeln von Schnitten</td></tr><tr><td>verwendet Chirurgische harte Schnitte</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td>Wird verwendet, um die Wirbelsäule, die Körperwand und die Haut zu durchtrennen</td></tr><tr><td>Gewebeprozessor</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modell TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Soldiumcitrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-04-6132</td><td>Wird für die Antigengewinnung</td></tr><tr><td>verwendet Tween-20</td><td>BioBasic</td><td>9005-64-5</td><td>Wird für das Waschen von Abschnitten</td></tr><tr><td>verwendet X-P Pierce XP-100 Plattendichtung</td><td>Excel Scientific</td><td>12-140</td><td>Wird für den sNF-L-Assay</td></tr> verwendet <tr><td>Xylol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td>Wird zum Entparaffinieren und Reinigen von Schnitten verwendet</td></tr><tr><td>Trichter</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-63100-64</td><td>Wird verwendet, um Formalin vor dem Zerkleinern von Gewebe zu filtern</td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Wird zur Herstellung von Lösungen</td></tr><tr><td>verwendet Ofen</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Wird zum Backen von Gewebeschnitten nach dem Schneiden</td></tr><tr><td>verwendet Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td>Wird verwendet, um LFB-Färbeschale zu versiegeln</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Der Zeitpunkt kann je nach Mikrowellenmodell variieren</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Zur Herstellung von Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408--129</td><td>Zur Lagerung von Mausserumproben</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Alle</td><td></td><td>Zur Vorbereitung von Proben für den sNF-L-Assay</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Wird verwendet, um das Enzymsubstrat für den sNF-L-Assay zu erwärmen</td></tr></tbody></table>

bewertung von entzündungen, demyelinisierung und axonverletzungen des zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner enzephalomyelitis

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gängiges immunbasiertes Modell der Multiplen Sklerose (MS). Diese Erkrankung kann bei Nagetieren durch aktive Immunisierung mit Proteinkomponenten der Myelinscheide und Complete Freund's Adjuvans (CFA) oder durch den Transfer von myelinspezifischen T-Effektorzellen von Nagetieren, die mit Myelinprotein/CFA präpariert wurden, in naive Nagetiere induziert werden. Der Schweregrad der EAE wird in der Regel auf einer klinischen 5-Punkte-Skala bewertet, die den Grad der aufsteigenden Lähmung misst, aber diese Skala ist nicht optimal, um das Ausmaß der Genesung von EAE zu beurteilen. Zum Beispiel bleiben die klinischen Werte in einigen EAE-Modellen (z. B. Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-[MOG]-Peptid-induziertes EAE-Modell) trotz des Abklingens der Entzündung hoch. Daher ist es wichtig, das klinische Scoring durch das histologische Scoring der EAE zu ergänzen, das auch die Möglichkeit bietet, die zugrunde liegenden Mechanismen der Zellschädigung im Zentralnervensystem (ZNS) zu untersuchen.
Hier wird ein einfaches Protokoll vorgestellt, um Rückenmark- und Gehirnschnitte von Mäusen vorzubereiten und zu färben und Entzündungen, Demyelinisierung und axonale Verletzungen im Rückenmark zu bewerten. Die Methode zur Bewertung der Leukozyteninfiltration im Rückenmark kann auch zur Bewertung von Hirnentzündungen bei EAE angewendet werden. Ein Protokoll zur Messung von löslichem Neurofilamentlicht (sNF-L) im Serum von Mäusen mit einem Small Molecule Assay (SIMOA) Assay wird ebenfalls beschrieben, das Rückmeldung über das Ausmaß der Gesamtschädigung des ZNS bei lebenden Mäusen gibt.

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell der Multiplen Sklerose. Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Bewertung von Rückenmarksentzündungen, Demyelinisierung und axonalen Verletzungen bei EAE. Darüber hinaus wird eine Methode zur Quantifizierung des löslichen Neurofilament-Lichtspiegels im Mäuseserum vorgestellt, die die Beurteilung der axonalen Schädigung in lebenden Mäusen erleichtert.

Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen des Zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Wir sind daran interessiert zu verstehen, wie Autoimmunität und Multiple Sklerose oder MS entstehen. Diese Forschung verwendet eine Vielzahl von Ansätzen, um zu untersuchen, wie Risikofaktoren mit MS assoziiert sind. Führen zur Entwicklung von Autoimmunität. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Mausmodell der MS, mit dem die Wirkung verschiedener Risikofaktoren auf die Autoimmunität untersucht werden kann.Wir haben kürzlich den biologischen Weg entdeckt, wie ein MS-Risikofaktor, Fettleibigkeit, zu einer erhöhten Autoimmunentzündung bei Mäusen führt. Studien im EAE-Modell waren entscheidend, um diese Mechanismen zu entschlüsseln. Der Schweregrad der EAE-Erkrankung wird oft auf einer fünfstufigen klinischen Skala bewertet.Diese Skala hat jedoch eine begrenzte Sensitivität und kann nicht unterscheiden, ob klinische Defizite durch Entzündungen oder Gewebeschäden verursacht werden. Die Histologie des Rückenmarks und des Gehirns ist die Goldstandardmethode zur Beurteilung von Entzündungen und Gewebeschäden bei EAE. Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode zur Messung von Entzündungen und Gewebeschäden im Rückenmark und Gehirn während der EAE.Unser Protokoll kann neben der klinischen Skala verwendet werden, um den Schweregrad der EAE besser zu charakterisieren. Unser Protokoll misst die wichtigsten histologischen Merkmale der EAE, einschließlich Immuninfiltration, Demyelinisierung, axonale Schädigung des Rückenmarks und Gehirnentzündung. Dazu gehört auch die Messung des Neurofilamentlichts im Mäuseserum, das das Ausmaß der ZNS-Schädigung anzeigt.Dieses umfassende Protokoll bietet eine detailliertere Charakterisierung der EAE als die Verwendung nur eines Markers.

scoring-central-nervous-system-inflammation-demyelination-axon-injury

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Induktion und klinischen Scoring von einem Tiermodell der Multiplen Sklerose: chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in DA-Ratten. Die Krankheit, durch die Immunisierung von Ratten mit einer Emulsion, die ganze Ratte Rückenmark und komplettem Freund-Adjuvans induziert, weist klinische Symptome ähnlich der menschlichen Erkrankung.

Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch Injektion von Myelin-abgeleiteten Peptiden mit einem Adjuvans, um autoreaktive T-Zellen zu aktivieren, die ins Gehirn wandern. Pertussis-Toxin wird verabreicht, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass diese T-Zellen und andere Immunzellen in das Gehirn eindringen können. Diese Immunzellen verursachen eine Demyelinisierung, die zu einer gestörten...

Generierung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist ein etabliertes Tiermodell für multiple Sklerose. C57BL / 6 Mäuse mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-Peptid 35-55 (MOG 35-55) immunisiert, was zu einer aufsteigenden schlaffen Lähmung durch autoreaktive Immunzellen im zentralen Nervensystem verursacht. Protokolle für die Krankheitsinduktion und Überwachung diskutiert.

Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 Mäuse

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Lernen Sie die Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen im EAE-Mausmodell. Dieses Protokoll ermöglicht eine detailliertere Charakterisierung der Multiplen Sklerose-Pathologie.

Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen des Zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (Video) | JoVE Journal

Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen des Zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Weitere Videos entdecken