A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Die verfügbaren Daten zur Beschaffung von Knochenproben für die Synchrotron-Mikro-Computertomographie sind nach wie vor spärlich. Unser umfassendes Tutorial bietet eine Methodik, die unkompliziert, minimal zerstörerisch und kostengünstig ist. Die Beschaffung von Knochenproben mit konsistenten Abmessungen und einer zylindrischen Form ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die resultierenden Datensätze von höchster Qualität sind und die Ergebnisse anwendbar sind.

Die in diesem Manuskript beschriebenen Techniken sind auf das Kernbohren von Gesteinen, Fossilien oder jeglichem harten Material anwendbar. Wir haben diese verwendet, um gleichmäßig große Kerne von Gesteinen und Einkristallen für Hochdruckexperimente zu sammeln, um die Rheologie der Erdkruste und des oberen Erdmantels zu erforschen. Anfänger können feststellen, dass die Knochenprobe konische Formen bildet.

Dies kann behoben werden, indem ausreichend Zeit für das Ausspülen des Knochenstaubs aus dem Bohrer eingeräumt und die Kernbohrgeschwindigkeit verlangsamt wird. Es fehlt an Anleitungstexten und Videos, die die Beschaffung von Knochenproben für die Synchrotron-Mikro-Computertomographie demonstrieren und die logische Analyse darstellen. Unser Schritt-für-Schritt-Tutorial zur Knochenvorbereitung hilft, diese Lücke zu schließen.

Legen Sie einen 75 x 25 Millimeter großen Objektträger aus Glas auf bis zu 140 Grad Celsius heiße Platten und schmelzen Sie eine großzügige Menge thermisches Epoxidharz in der Mitte des Objektträgers. Drücken Sie den unteren Aspekt des Knochenblocks mit der Länge des Knochens senkrecht zum Objektträger in das thermische Epoxidharz auf dem Objektträger. Schieben Sie die Probe hin und her, um die Unterseite des Knochens zu beschichten und eine sichere Haftung zu gewährleisten.

Lassen Sie die montierte Probe etwa fünf Minuten lang auf der Heizplatte ruhen, damit das thermische Epoxidharz in die Poren und Risse eindringen kann, um sicherzustellen, dass das Epoxidharz auf dem Objektträger frei von Blasen ist. Wenn Blasen vorhanden sind, schieben Sie die Probe hin und her, um sie zu entfernen. Nehmen Sie den Objektträger mit der montierten Probe mit einer stumpfen Pinzette von der Heizplatte und lassen Sie ihn etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen, dann entfernen Sie mit einer Rasierklinge jegliches Epoxidharz vom Rand des Objektträgers, um sicherzustellen, dass das Bohrfutter den Objektträger richtig greift.

Befestigen Sie den Objektträger mit der anhaftenden Probe an einem Glasschiebefutter und montieren Sie das Spannfutter auf den Schwenkarm einer langsam laufenden Trennsäge und positionieren Sie es so, dass ein Querschnitt des Knochens senkrecht zu seiner Länge geschnitten werden kann. Stellen Sie den Schwenkarm so ein, dass die Klinge die Probe berührt und durchschneidet. Fügen Sie Gewichte an der anderen Seite des Schneidarms hinzu, um dem Gewicht des Arms entgegenzuwirken, und geben Sie destilliertes Wasser und Schneidflüssigkeit in den Flüssigkeitsbehälter.

Befestigen Sie die Diamantwafer-Klinge fest und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand den Schneidteil der Klinge untertaucht. Stellen Sie die Drehzahl auf 200 U/min ein und senken Sie die Probe langsam auf die Klinge ab. Sobald die Säge mit dem Schneiden beginnt, stellen Sie sicher, dass das Sägeblatt und das Spannfutter nicht wackeln oder hüpfen.

Wenn dies der Fall ist, stoppen Sie die Säge sofort und ziehen Sie die Sägeblatt- oder Futterarmbaugruppe fest. Wenn sich das Bohrfutter aggressiv auf und ab bewegt, fügen Sie weitere Gegengewichte hinzu. Der erste dicke Abschnitt ist ein Abfallschnitt, der parallel zu jedem weiteren Schnitt eine genau definierte Oberfläche bietet.

Heben Sie nach dem ersten Makulaturschnitt den Schwenkarm an und bewegen Sie das Spannfutter mit dem Positionierrad fünf Millimeter in Richtung Sägeblatt. Nachdem das Schneiden abgeschlossen ist, legen Sie den Objektträger mit der montierten Probe auf eine Heizplatte, um das thermische Epoxidharz zu schmelzen. Montieren Sie fünf Millimeter schwere Knochenabschnitte auf dem Boden einer flachen Aluminiumdose mit der zuvor beschriebenen thermischen Epoxid-Klebetechnik.

Legen Sie die Dose auf einen XY-Maschinentisch der Fräsbohrmaschine und ziehen Sie die Spannklammern von Hand fest. Setzen Sie einen Diamantbohrer mit einem Innendurchmesser von zwei Millimetern in das Bohrfutter ein und stellen Sie den Tiefenbegrenzer so ein, dass kein Kern durch das Zinn gelangt. Richten Sie den zentralen vorderen Aspekt der Knochenprobe unter dem Bohrer aus und vermeiden Sie dabei einen engen Kontakt mit dem Periost und Ostium oder stark trabekularisierten Bereichen.

Füllen Sie die Dose mit destilliertem Wasser, um die Probe vollständig zu bedecken, wodurch ein Hitzestau, ein Verbrennen der Probe und eine Beschädigung des Bohrers während des Kernbohrens verhindert werden. Die Mühlenbohrmaschine kann gefährlich sein, wenn keine angemessenen Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden. Der Bediener sollte darauf achten, dass er eine Schutzbrille trägt, dass lose Kleidung gesichert ist und dass lange Haare nach hinten gezogen werden, damit sie sich nicht in der Spindel verfangen.

Bei den ersten Kontakten zwischen dem Kernbohrer und dem Knochen üben Sie leichten Druck aus, um einen Ring auf der oberen Oberfläche des Knochens zu tragen. Dies verhindert eine Durchbiegung des Bohrers zu Beginn des Kernbohrvorgangs und sorgt für eine korrekte Platzierung des Bohrers. Heben Sie den Bohrer während des Kernbohrens in die Probe hinein und wieder heraus, während Sie die Spitze des Bohrers unter der Wasseroberfläche halten.

Tun Sie dies alle paar Sekunden, um eingeschlossenen Knochenstaub auszuspülen und sicherzustellen, dass der Bohrer nicht von Schmutz verdeckt wird. Nach Abschluss der Kernbohrung kann sich der resultierende Knochenkern in dem hohlstieligen Bohrer festsetzen. Verwende eine Pinzette mit feiner Spitze oder einen kleinen Inbusschlüssel, um den Kern vom Bohrer zu lösen.

Lagern Sie die entkernte Probe in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen an einem kühlen und trockenen Ort, bis die Bildgebung beginnt. Die beschriebene Methode der Kernprobenahme erwies sich als äußerst effektiv und effizient. Hier sind repräsentative Abbildungen dargestellt, die den Bildverarbeitungsworkflow einer Kernprobe und einer mit einem rotierenden Werkzeug beschafften Probe vergleichen.

Der Probenschnitt mit dem üblichen Rotationswerkzeug wies im Vergleich zur Kernprobe eine erhöhte Anzahl von Kanälen und Lücken sowie einen verringerten durchschnittlichen Kanaldurchmesser, ein verringertes Kanalvolumen und eine verringerte kortikale Porosität auf. Diese Tabelle zeigt die Porositätsdaten für jede Probe. Obwohl das Kernbohrprotokoll die in Synchrotron-Mikrotomographie-Scans beobachteten Artefakte verringert, stellen die artefaktbeladenen Zahlen von geringerer Qualität aus den geradlinigen Knochenblockexperimenten ein vielschichtiges Problem dar.

Die anschließende Bildverarbeitung bestätigte das Potenzial der Technik, die Visualisierung der kortikalen Knochenmikroarchitektur zu verbessern. Zum Beispiel wurden Mineralisierungsunterschiede, eine verbesserte Abgrenzung der osteonalen Grenzen und eine konsistente Visualisierung von Weichteilen innerhalb der Gefäßkanäle beobachtet. Langsames Vorgehen ist der Schlüssel, um konstant große zylindrische Proben zu erhalten.

Wenn Sie zu schnell fahren, können die Proben kegelförmig statt zylindrisch werden. Bei der Beschaffung dicker Schnitte für die Kernbohrung können weitere dicke Schnitte für die Hellfeld- oder Konfokalmikroskopie entnommen werden. Dies ermöglicht die Visualisierung des kanalikulären Netzwerks.