Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Dieses Verfahren wurde für die Entwicklung fortgeschrittener 3D-Leberkulturen in vitro eingeführt, die eine physiologisch relevantere Bewertung der genotoxischen Gefahren im Zusammenhang mit Nanomaterial-Expositionen sowohl über ein akutes als auch ein langfristiges, wiederholtes Dosisregime ermöglichen können.

Dieses Hep G2-Modell bietet ein relevantes alternatives In-vitro-Testsystem, um die potenzielle Induktion von fixierten DNA-Schäden nach langfristiger Exposition gegenüber Nanomaterial zuverlässiger zu bewerten, mit dem Ziel, den Bedarf an Versuchen an Tieren zu minimieren. Das Hep G2-Sphäroidmodell besitzt die Fähigkeit, über einen Zeitraum von 14 Tagen lebensfähig und funktionsfähig zu bleiben und ein angemessenes Maß an Proliferation aufrechtzuerhalten. Dies unterstützt die Prüfung einer Reihe von biochemischen und Genotoxizitätsendpunkten, einschließlich des Mikronukleus-Assays.

Bevor Sie dieses Protokoll ausprobieren, empfehle ich Ihnen, zuerst ein paar Übungsläufe zu machen. Seien Sie vorsichtig bei der Zellaussaat oder beim Medienwechsel, da diese eine behutsame Herangehensweise erfordern. Beginnen Sie mit der Zugabe von 100 Mikrolitern sterilem PBS bei Raumtemperatur in die Vertiefungen einer 96-Well-Kulturplatte.

Drehen Sie den Deckel der Platte um und pipettieren Sie vorsichtig 20 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte jeder Well-Rille des Deckels. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und fügen Sie jeweils zwei bis vier Tropfen hinzu, um eine genaue Platzierung zu gewährleisten. Säen Sie nur vier Steroide auf einmal aus und stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitzen alle ausgerichtet sind, bevor Sie beginnen.

Der Winkel, in dem Sie den Mehrkanal halten, macht einen Unterschied in der Art und Weise, wie die Sphäroide gebildet werden. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen in den Rillen der Vertiefungen auf dem Deckel zentriert sind, und klappen Sie dann den Deckel vorsichtig auf die Platte, so dass die Tropfen über den Vertiefungen mit PBS hängen. Inkubieren Sie die Platte drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie das Sphäroid auf Agarose übertragen.

Nehmen Sie nach der Inkubation die Platte aus dem Inkubator und heben Sie vorsichtig den Deckel von der Platte, entsorgen Sie das PBS, klopfen Sie auf die Platte, um die Restflüssigkeit zu entfernen, und lassen Sie die Platten zwei bis drei Minuten lang an der Luft trocknen. Nachdem Sie die Agarose geschmolzen haben, schwenken Sie sie vorsichtig, um Blasen zu entfernen, und geben Sie 50 Mikroliter in den Boden jeder Vertiefung. Lassen Sie die Platte zwei Minuten lang bei Raumtemperatur und geben Sie dann 100 Mikroliter vorgewärmtes DMEM auf die feste Agaroseschicht in jeder Vertiefung.

Setzen Sie den Deckel mit diesen Sphäroidtröpfchen wieder auf die Platte, so dass die Sphäroide wieder hängen, und zentrifugieren Sie die Platte dann drei Minuten lang bei 200 mal G, um die Sphäroide in die einzelnen Vertiefungen der Platte zu übertragen. Inkubieren Sie die Platte weitere 24 Stunden lang, damit sich die Sphäroide absetzen können. Nach der Dispergierung der technisch hergestellten Nanomaterialien (ENM) verdünnen Sie sie mit vorgewärmtem DMEM auf die gewünschte Endkonzentration.

Aspirieren Sie 50 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung mit den Sphäroiden und ersetzen Sie es durch 50 Mikroliter Medium mit dem ENM. Um die Sphäroide zu ernten, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die 100 Mikroliter Zellkulturmedium mit dem Sphäroidgewebe aus jeder Vertiefung zu aspirieren, wobei darauf zu achten ist, dass der Kontakt mit der Agarose vermieden wird. Sammeln Sie die Sphäroide in einem sterilen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Die Sphäroidsuspension wird fünf Minuten lang bei 230 mal G zentrifugiert, dann der Überstand entfernt und bis zur weiteren Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Waschen Sie das Pellet der Sphäroide in einem Milliliter sterilem PBS bei Raumtemperatur, zentrifugieren Sie es dann drei Minuten lang bei 230-fachem G und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Sphäroide in 500 Mikrolitern 0,05%iger Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie sie sechs bis acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5%igem Kohlendioxid.

Nach der Inkubation pipettieren Sie die trypsierten Hep G2-Zellen vorsichtig auf und ab, um sie vollständig zu dissoziieren und zu resuspendieren, bevor Sie sie mit einem Milliliter DMEM neutralisieren. Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 230 mal G zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in zwei Millilitern PBS resuspendiert. Um einen Küvettentrichter einzurichten, legen Sie den vorbereiteten Objektträger in die Metallhalterung, legen Sie eine Filterkarte auf den Objektträger und befestigen Sie dann den Küvettentrichter darauf.

Ordnen Sie die Küvettentrichter in der Zytozentrifuge mit dem Trichter nach oben an, so dass 100 Mikroliter Zellsuspension direkt in jeden Trichter gegeben werden können. Fahren Sie dann mit der Befestigung der Objektträger gemäß den Anweisungen des Manuskripts fort. Bereiten Sie eine 20%ige Giemsa-Färbelösung vor, die in Phosphatasepuffer verdünnt ist.

Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen, und filtern Sie sie dann mit gefaltetem Filterpapier in einem Trichter. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um drei bis fünf Tropfen gefilterte Giemsa-Lösung zum Cytodot auf jedem Objektträger hinzuzufügen und lassen Sie es acht bis 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Waschen Sie die Objektträger in zwei aufeinanderfolgenden Phosphatasepuffer-Waschgängen.

Spülen Sie sie dann kurz unter kaltem Wasser ab, um überschüssige Flecken zu entfernen, und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Vor jeder toxikologischen In-vitro-Bewertung ist es wichtig zu überprüfen, ob sich die 3D-HepG2-Sphäroide richtig gebildet haben. Vier Tage nach der Aussaat sollten sich kompakte, kugelförmige Sphäroide mit einer glatten Oberfläche und ohne visuelle Vorsprünge bilden.

Hier werden Sphäroide von guter und schlechter Qualität vier Tage nach der Aussaat demonstriert. In der Regel bilden sich 90 bis 95 % der pro Platte gebildeten Sphäroide korrekt und sind für weitere Experimente geeignet. Die Lebensfähigkeit und leberähnliche Funktionalität wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen bewertet, um die Langlebigkeit des Leber-Sphäroidmodells zu bestimmen und festzustellen, ob es eine langfristige ENM- oder chemikalienbasierte Gefahrenbewertung unterstützen kann.

Die Albuminkonzentration blieb über die Dauer des Kulturzeitraums konstant, während die Harnstoffproduktion pro Sphäroid zunahm, bevor sie an Tag 14 zu sinken begann. Für die Beurteilung der Genotoxizität wurde der Mikronukleus-Assay verwendet, um das Vorhandensein von Mikrokernen nach akuter und langfristiger ENM-Exposition zu bestimmen. Die Sphäroide wurden zwei ENMs, Titandioxid und Silber, ausgesetzt.

Ein ähnlicher Trend zur Genotoxizität wurde nach akuter Exposition gegenüber beiden ENM beobachtet, aber die erhöhte Genotoxizitätsreaktion war nach einer langfristigen, fünftägigen Exposition nicht offensichtlich. Mit dieser Methode können sowohl der Überstand als auch die Sphäroide für eine Vielzahl von biochemischen Endpunkten gewonnen werden. Dazu gehören die Lebensfähigkeit von Zellen, Leberfunktionstests, SID 450-Analysen, schlechte Entzündungsmarker und Genexpression.

Diese Technik wird derzeit in einer Reihe von Auftragsforschungslabors getestet, die sie für routinemäßige Geotoxizitätstests sowohl von Chemikalien als auch von Nanomaterialien anwenden wollen. Dies hat das Potenzial, die Abhängigkeit von In-vivo-Testansätzen zu verringern.